干细胞 (Stem Cells)

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1 干细胞 (Stem Cells) 周士新, 细胞生物学系

2 第二节胚胎干细胞

3 一 概念 胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES cells): 早期胚胎发育过程中, 受精卵分裂形成囊胚, 囊胚内细胞团的单个细胞具有多向分化潜能, 可以分化产生三个胚层所有种类的细胞, 将其取出在体外建系和传代, 即为胚胎干细胞

4 二 胚胎干细胞建系 胚胎干细胞建系 : 使胚胎干细胞在体外培养条件下永久性 非分化增殖

5 胚胎干细胞 (ES) 建系 1981 年英国剑桥大学 Evans 和 Kaufman 从小鼠的胚泡分离出内细胞团, 利用成纤维细胞作为培养 ES 细胞的饲养层, 成功地建立了体外培养哺乳类 ES 细胞的方法 5

6 小鼠胚胎干细胞 Nature, 1981

7 编辑小鼠目标基因的贡献

8 人胚胎干细胞 1998 年美国威斯康星大 学 Thomson 等科学家, 成功地建立了体外培养人类 ES 细胞的方法

9 James A. Thomson

10 trophectoderm yolk sac 0.15mm blastocyst 4 ½ - 5 days primitive endoderm 7 ½ days implanting epiblast 9 days implanted bilayered embryonic disc extraembryonic mesoderm

11 胚胎干细胞的分化 11

12 受精卵在分裂早期 尚未植入子宫以前, 囊胚内部的内细胞团便是具有全部分化能力的胚胎干细胞集合 如果能够源源不断地获得胚胎干细胞, 就可以在体外诱导产生不同的组织细胞甚至器官供移植用, 因而在临床实践上也有广阔的应用前景 12

13 Thomson, 1998 Mitalipov, 2013 人胚胎干细胞的获得与诱导分化

14

15 核移植方法建立了人的胚胎干细胞 Cell. 2013:

16 白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 是理想的小鼠胚胎干细胞分化抑制剂, 外源 LIF 可 使小鼠胚胎干细胞在未分化状态下长期培养 碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bfgf) 是目前人胚胎干细胞使用的最 佳分化抑制剂

17 17

18 三 胚胎干细胞的鉴定 1. 形态和分子标记 : 克隆生长 碱性磷酸酶 +,SSEA1+ or SSEA4+, 多潜能的基因高表达, 转录因子 Oct4,Nanog 和 Sox2 高表达和启动子区低甲基化 (hes and mes) 2. 体内成瘤 (hes, 畸胎瘤 ) 3. 嵌合体动物 (mes) 4. 四倍体补偿 (mes)

19 2. 体内成瘤 将 ES 细胞注入到同种或免疫缺陷小鼠的皮下或肾包囊, 以观察注入的细胞在宿主动物体内是否可以形成畸胎瘤 病理学检测时, 形成的畸胎瘤具有从胚胎三个不同胚层来源的各种细胞类型 典型的畸胎瘤含有多种组织细胞和类似的组织结构, 如上皮组织, 肌肉组织, 神经组织, 骨和软骨等

20 3. 嵌合体动物 嵌合体动物是指子代动物的各种组织和器官中都包含了来源于两种不同基因背景的细胞 将受试细胞注入到一个正处于胚胎发育的胚泡内, 把这种 杂合 的胚胎移植到假孕母鼠的子宫内 如果受试细胞是亚全能的胚胎干细胞, 就能和受体的囊胚共同发育形成子代动物个体, 这样的子代动物叫做嵌合体 (chimera)

21 嵌合体的小鼠 21

22 4. 四倍体补偿 正常小鼠的胚胎均为二倍体细胞, 在胚胎发育到二细胞阶段时, 用电或化学融合的方法使两个细胞融合为一个细胞, 所得到的细胞为四倍体胚胎, 四倍体胚胎不能发育出正常的个体, 仅能形成胎盘 此时如果将一个亚全能性干细胞注入四倍体囊胚, 可以获得一个完整的动物个体, 因为这个个体仅来源于该干细胞, 因此能证明移植进去的干细胞具有向三胚层分化的能力

23 TS (trophectodermal stem) visceral endoderm (ve) Epiblast (ep) extra-embryonic ectoderm (ex) Reichert s membrane (rm) primitive endoderm (pe) trophectoderm (te) visceral yolk sac (vys) the placenta (pl)

24 第三节诱导多能干细胞 Induced pluripotent stem cells

25 概述 1. 细胞重编程 概念 : 分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态, 或者形成胚胎干细胞系, 或者进一步发育成一个新的个体的过程

26 细胞重编程 2008 年 12 月 Science 杂志评出的 2008 年十大科学进展中细胞重编程被评为首位 策略 : 核移植 细胞融合 直接重编程

27 细胞重编程 Cellular Reprogramming 细胞分化的逆向过程

28

29 细胞重编程 小鼠发育过程中,DNA 甲基化的重编程

30 2. 体细胞核移植 体细胞核移植 (Somatic cell nuclear transplantation, SCNT) 又称为体细胞克隆 : 即把体细胞核移入去核卵母细胞中, 使其重组并能发育为新的胚胎, 最终发育为动物个体 用核移植方法获得的动物称为克隆动物 细胞核的采集和卵母细胞的准备 供体细胞核移植到去核卵母细胞中 体外完成早期的胚胎培养 植入代孕母体, 发育为新的个体

31 2. 体细胞核移植 PNAS. 1952, 38: Briggs and King developed methods to transplant nuclei of blastula cells into enucleated frog oocytes, they established the technique of SCNT.

32 2. 体细胞核移植 - 蝌蚪 J Embryol. Exp. Morph 1962,622-40

33 2. 体细胞核移植 - 哺乳动物 Nuclear donor: embryo-derived cells Nature, 1996, Nuclear donor: adult mammary gland Nature, 1997,

34 Dolly ( ) Ian Wilmut, Roslin Institute Ewe Ju: : 母羊 Udder: 乳房 34

35 2. 体细胞核移植 局限性 克隆的效率极低 ; 产生的许多后代在各个阶段都体现出严重的发育异常 ; 由于需要卵母细胞, 核移植实验在人类中的应用受到强烈的伦理学质疑 克隆技术在多种哺乳动物中都得到了有效应用 克隆鼠 克隆牛 克隆猪等相继出现 通过克隆技术可以保护濒临的物种 蛙 鲤鱼 羊 鼠 猕猴 猪 牛 猫 兔 骡 鹿 马 狗 狼 猴 大鼠

36 3. 细胞融合 细胞融合 : 将成熟的体细胞与多潜能的细胞 (ES EC 等 ) 融合, 或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞, 也可以在一定程度上使体细胞发生重编程 Yamanaka, CSC,2007:41-49

37 3. 细胞融合 缺点 : 体细胞与多能性细胞的融合率较低 ; 融合之后的细胞具有两套染色体, 并且在移植后会发生排斥现象, 这就制约了细胞融合的临床应用 Eggan. Science,2005

38 4. 直接重编程 诱导多能干细胞 (ips 细胞 )

39 概念 诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells,ips cells): 通过各种诱导分子将稳定分化的体细胞重编程为多潜能干细胞

40 诱导多能干细胞 2006 年发现, 小鼠的成熟细胞可以被重新编程变成未成熟的干细胞 山中伸弥,1962 年出生于日本大阪 他于 1987 年在神户大学获得医学博士学位, 做过整形外科医生, 之后转为基础科研 目前是京都大学再生医学研究所所长 教授

41 一 诱导多能干细胞的建立 1. 诱导因子 2. 诱导多能干细胞的诱导方法 3. 诱导多能干细胞的机制 4. 诱导多能干细胞的多能性鉴定

42 1 诱导因子 : 小鼠和人 ips 细胞 Takahashi &Yamanaka 等利用转录因子 Oct4 Sox2 c-myc 和 Klf4;

43 1 诱导因子 : 人类 ips 细胞 Oct4 Sox2 Nanog 和 Lin28 University of Wisconsin-Madison Primate Research Center 43

44 OCT4,SOX2,c-Myc,KLF-4 Cell, 2007: OCT4,SOX2,NANOG,LIN28 第一作者是俞君英 Science,2007:

45 人类 ips: 诱导因子及诱导策略的选择 人类 ips Takahashi &Yamanaka 等利用转录因子 Oct4 Sox2 c- Myc 和 Klf4; Yu & Thomson 等使用 Oct4 Sox2 Nanog 和 Lin28 45

46 2. 诱导多能干细胞的诱导方法 (1) 应用逆转录或慢病毒导入特定的转录因子可将成体细胞重 编程为诱导多能干细胞 但其可能使外源基因插入细胞的基因组 中引起插入突变, 存在一定的安全隐患

47 beta-geo cassette (a fusion of the b-galactosidase and neomycin resistance genes) 24 genes Oct3/4, Klf4, Sox2, and c-myc Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka Cell 126, , August 25, 2006

48 诱导多能干细胞 日本京都大学 Takahashi and Yamanaka (Cell, 2006) : retroviral vector (plat-a) with Oct4, Sox2, Klf4 and c-myc 48

49 2. 诱导多能干细胞的诱导方法 (2) 利用质粒 附着体 重组腺病毒 仙台 病毒 mrna mirna 及蛋白质等多种转导方法 以避免基因插入突变及提高诱导效率

50 2. 诱导多能干细胞的诱导方法 (3) 使用小分子化合物来替代细胞重编程过程中使用的 外源基因 ( 在小鼠获得成功 )

51 2. 诱导多能干细胞的诱导方法 宿主基因组整合 Retroviral, Lentiviral 非宿主基因组整合 Non-integrating factors Sendai virus, Episomal 可切除的载体 蛋白质转染 mrna mirna 小分子化合物 VPA, 5-azacytidine Wnt3a, sirna of p53 Nature methods. 2010:21

52 提高 ips 重编程效率的方法 P53 knockdown and UTF1 could synergize to improve the reprogramming efficiency up to 100-fold. Cell Stem Cell, 2008:475-9

53 3. 体细胞重编程的机制 Nature 502, , 2013

54 Yamanaka 因子的作用机制 Putative Roles of the Four Factors in the Induction of ips Cells Shinya Yamanaka. Cell Stem Cell, 2007 Jun 7;1(1):39-49

55 细胞命运改变机制的新理论 : 跷跷板 模型 Cell.2013:963-75

56 Seesaw Model When the seesaw is balanced between the two differentiation potentials, the call has a higher probability of entering the pluripotent state. Cell.2013:963-75

57 细胞重编程获得诺贝尔奖 2012 年诺贝尔生理学或医学奖 英国科学家约翰 戈登 (John B. Gurdon) 和日本科学家山中伸弥 (Shinya Yamanaka) 获奖, 获奖理由为 发现成熟细胞可被重编程变为多能性

58 化学小分子重编程 Small molecules Small molecules Somatic cells ipscs 小分子在重编程中的作用 : 修饰表观遗传学状态, 调控细胞周期, 激活或抑制细胞信号通路等 ( 小分子激活和抑制特异蛋白的功能通过其浓度的精细调控是可逆的 ) 小分子的优点 : 具有细胞可通透性 ; 非免疫原性 ; 廉价 方便制备 容易保存和标准化 风险较低

59 2. 诱导多能干细胞的多能性鉴定 细胞多能性的鉴定主要包括以下几个方面 : 形态学特 性 特异性标志分子的表达 体内外分化能力, 以及在其 基因表达和表观遗传学特性等方面进行检测

60 形态 - 克隆样生长 Cell. 2007:

61 形态 : 免疫荧光染色 Cell. 2007:

62 基因表达谱 Figure 2. Expression of hes Cell-Marker Genes in Human ips Cells Cell. 2007:

63 表观遗传和启动子分析.Analyses Promoter Regions of Development-Associated Genes in Human ips cells Cell. 2007:

64 四倍体补偿 ( 小鼠 ) Nature, 2009 Sep 3;461(7260):86-90

65 二 直接谱系重编程

66

67 多能干细胞的来源 67

68 细胞重编程重点事件

69 三 诱导多能干细胞的应用前景 1. 构建疾病模型 2. 药物研发和筛选 3. 细胞移植治疗

70 人 ips 细胞的应用前景

71 1. 构建疾病模型 由于 ips 细胞具有来源广泛的特点, 并且具备自我更新和分化为多种细胞类型的能力, 因此它可以为构建疾病模型提供一个不断更新的组织来源, 进而可以用于探究疾病发病机制

72 利用人 ips 细胞构建心血管疾病模型

73 2. 药物研发和筛选 ips 细胞技术可以为药物毒性筛选提供充足的细胞来源 未来利用 ips 细胞开展的药物毒性检测将成为新药发现和研制之间的 过渡 阶段, 既具有可行性, 又具有实际意义 此外, 还可以利用某种特定疾病患者的 ips 细胞进行靶向治疗药物筛选

74 3. 细胞移植治疗 ips 细胞技术在再生医学领域具有广阔的应用前景, 其主要优点为 : (1) 来源于自体细胞, 大大降低了移植过程中的免疫排斥反应, 实现个体化治疗 ; (2) 来源于成体细胞, 因而克服了胚胎干细胞移植存在的来源不足和伦理问题

75 镰状细胞贫血 : 是一种常染色体显性遗传血红蛋白 (Hb) 病 因 β- 肽链第 6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替, 构成镰状血红蛋白 (HbS), 取代了正常 Hb(HbA), 在氧分压下降时 HbS 分子间相互作用, 成为溶解度很低的螺旋形多聚体, 使红细胞扭曲成镰状细胞 ( 镰变 )

76 利用人 ips 细胞进行细胞移植治疗

77 第四节成体干细胞

78 一 概念 成体干细胞 (adult stem cells): 是存在于成熟组织器官内 具有分化为相应组织器官功能细胞和自我更新能力的一类原始细胞 因此, 成体干细胞也可被认为是组织干细胞

79 成体干细胞

80 1. 造血干细胞 造血干细胞 (hematopoietic stem cells,hscs): 是形成和维持机体血液有形成分的起源细胞, 分化形成 T B 淋巴细胞 自然杀伤细胞 粒细胞 单核巨噬细胞 红细胞和血小板等功能细胞

81 造血干细胞 为了探索 再生障碍性贫血 和 白血病 等血液疾病的治疗方法, 科学家尝试用骨髓移植的手段重建病人的造血系统 实际上, 骨髓移植就是用骨髓中的血液干细胞来替代病人体内坏死或缺失的各种血细胞 因此造血干细胞是最早被研究, 也是目前认识最深入的干细胞 81

82 造血干细胞

83 造血干细胞 ( 多向性 ) 原红细胞 ( 定向性 ) 粒系巨噬定向干细胞 原巨核细胞 ( 定向性 ) 淋巴母细胞 网织红细胞 原单核细胞 原粒细胞 巨核细胞 淋巴细胞 红细胞 单核细胞 粒细胞 ( 中性 嗜碱 嗜酸性 ) 血小板 巨噬细胞 造血干细胞分化示意图 83

84 造血干细胞的筛选及应用 : 人造血干细胞表面标志物主要为 CD34+ CD59+ Thy1+ CD38low/- C-kit-/low lin- 等 通常认为, 造血干细胞是以 CD34+/Thy1+/lin- 为标记的细胞亚群 从骨髓中分离出的造血干细胞移植可重建患者造血系统, 治疗多种血液系统疾病

85 造血干细胞的微环境

86 2. 间充质干细胞 间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,msc): 来源于中胚层, 可以从骨髓, 软骨和骨组织中分离得到, 易于在体外扩增, 在不同的诱导条件下, 可以向多种组织细胞分化

87

88 间充质干细胞目前较公认的表面标记物包括 CD44,CD71,CD90,CD117,CD147 SH2 SH3 和 SH4 等 ; 但不表达血液细胞的标记物, 比如 CD34,CD45,CD14,CD31 和 MHC-II 分子等

89 3. 神经干细胞 神经干细胞 (neural stem cells,nsc): 来源于胚胎发育时期的神经上皮, 具有形成各种类型的神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力 在成体脑内神经干细胞存在于侧脑室下区和海马齿状回等区域

90 神经干细胞

91 目前, 神经干细胞还没有单一性的特异性标记 候选的标记 :Nestin,Sox2,CD133

92 4. 表皮干细胞 表皮干细胞 (epidermal stem cell): 在组织结构中位置相对稳定, 一般位于表皮的基底层, 在没有毛发的部位如手掌 脚掌, 表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层

93 外界 核解体迁移细胞干细胞分裂中的干细胞 角蛋白角质化细胞颗粒细胞棘细胞基底细胞基膜真皮 表皮层 哺乳动物表皮剖面图 93

94 表皮干细胞的特异性标志物 : 表皮干细胞的特异性标志物为 β1 整合素 角蛋白 19 (keratinl9, K19) 角蛋白 15 (keratinl5, K15) 和角蛋白 10(keratin 10,K10)

95 5. 肠道上皮干细胞 肠道上皮干细胞位于肠道的隐窝, 现有两种模型定位肠道上皮干细胞, 即 : (1) 从隐窝底部开始往肠道表面数第四个上皮细胞为干细胞 ; (2) 在第四个上皮细胞以下的隐窝细胞都可能是干细胞 肠道干细胞向下分化形成潘氏细胞, 向上形成增殖肠道上皮细胞, 在接近表面时分化形成多种功能的上皮细胞

96 肠道上皮干细胞

97 Paneth cells express CD24 and support growth of Lgr5 stem cells Nature 469, (20 January 2011) doi: /nature09637

98 目前, 小肠上皮干细胞可能的标记物 : Lgr5

99 第五节干细胞与再生医学

100 一 概念 再生医学 (regenerative medicine): 通过研究机体正常的组织特征与功能 受创后修复与再生机制及干细胞分化机制, 寻找有效的生物治疗方法, 促进机体自我修复与再生, 或构建出新的组织与器官, 以改善或恢复损伤组织和器官功能的科学

101 二 获得与患者基因型匹配干细胞的方法 1. 细胞核移植技术 : 将患者体细胞核注入到一个去核卵细胞中, 使其发育形成囊胚后, 分离内细胞团, 建立与患者基因型匹配的胚胎干细胞 也称为治疗性克隆技术 2. 诱导多能干细胞技术 : 通过导入特定的转录因子或外加小分子化合物将终末分化的体细胞重编程为多能干细胞

102 获得与患者基因型匹配干细胞的两种方法

103 治疗性克隆技术

104 三 干细胞移植的再生治疗 1. 造血干细胞移植 : 是目前为止研究历史最为悠久 认识理解最为透彻 临床应用最为成熟的成体干细胞 2. 间充质干细胞的临床应用 : 具有自我更新和多向分化潜能, 可以发挥免疫抑制和抗炎症作用, 具有迁徙的能力, 使其具有重大的临床应用价值

105 间充质干细胞与治疗相关的生物学特性

106 本章重点内容 1. 干细胞的基本特性 2. 胚胎干细胞的生物学特性及鉴定标准 3. 细胞重编程概念和方法 4. 诱导多能干细胞的概念和生物学特性及应用前景 5. 造血干细胞在再生医学中的应用

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