干细胞 (Stem Cells)

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1 干细胞 (Stem Cells) 周士新, 细胞生物学系

2 问题 人体由于疾病或创伤引起的组织和细胞损伤 能否用体外培养的细胞或组织修复?

3

4 造血干细胞是在胚胎发育期间产生的, 正常的造血干细胞具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能 自然 杂志指出这些成果为白血病和其他需要骨髓移植的, 但又找不到合适供体的血液疾病患者带来了希望 两项研究分别由波士顿儿童医院干细胞计划实验室的负责人 George Daley 教授和 Weill Cornell 医学院的 Shahin Rafii 教授领导

5 Lab-grown blood stem cells produced at last?! Oocytes and Sperms Germ Stem Cells (GSC) and Human embryonic stem cells (ESC) Haematopoietic Stem Cells (HSC)

6 内容 第一节第二节第三节第四节第五节 干细胞概述胚胎干细胞成体干细胞诱导多能干细胞干细胞与再生医学

7 第一节干细胞概述

8 一 概念 干细胞 (stem cells): 是一类具有自我更新 (self-renewal) 和分化潜能 (potency of differentiation) 的细胞

9 干细胞的不对称分裂

10 二 特点 1. 干细胞具有很强的分裂能力 ; 2. 干细胞是未分化的细胞 ; 3. 干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途径中选择其一 : (a) 保持亲代特征仍作为干细胞 ; (b) 可以向特定组织细胞分化

11 干细胞的分裂模式 : (1) 对称分裂 (symmetry division) (2) 不对称分裂 (asymmetry division)

12 12

13 三 干细胞的类型

14 依据其分化潜能可分为 : 全能干细胞 (totipotent stem cells) 亚全能干细胞 (pluripotent stem cells) 多能干细胞 单能干细胞 (multipotent stem cells) (unipotent stem cells)

15 依据其细胞来源可分为 : 胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES cells) 成体干细胞 (adult stem cells)

16 四 干细胞特性维持的分子机制

17 1. 干细胞中的转录调控网络 (1) Oct4: 在胚胎发育的早期植入阶段,Oct4 在多潜能性的建立中起着至关重要的作用 Oct4 是 POU 家族的转录因子, 由 pou5f1 基因编码, 在早期胚胎发育中起着关键作用, 所表达的蛋白质是细胞全能性的重要标志

18 1. 干细胞中的转录调控网络 (2) Nanog: Nanog 是一个 NK-2 家族的同源盒转录因子, 在体内发育过程中主要表达于致密桑椹胚的内部细胞 囊胚内细胞团 胚胎原条的上胚层及外胚层中, 其表达在形成中胚层和限定性内胚层时下调

19 1. 干细胞中的转录调控网络 (3) Sox2: Sox2 属于 HMG 转录调控因子家族 与 Oct4 和 Nanog 不同,Sox2 的表达并不限于多潜能性细胞 除了内细胞团 外胚层和生殖细胞, 在原始外胚层和神经外胚层中也可检测到 Sox2 的表达

20 2. 微环境对干细胞的调控作用 干细胞的生长 迁移 增殖 分化等生物学行为受 到多种因素特别是干细胞所处微环境 (niche) 的调节, 干细胞微环境已被证明是调控干细胞的主要结构

21 干细胞微环境的组成

22 干细胞微环境 (stem cell niche): 微环境构成了生物体组织生理学的基本单位, 在组织代谢 生长 维护和修复过程中起重要的作用 干细胞微环境通过整合内外的信号分子, 介导干细胞对机体生长 修复的需求产生应答, 诱导干细胞发生迁移 分化, 形成终末分化的组织特异性功能细胞

23 干细胞特征的维持与微环境密切相关 其功能主要包括 : 1 锚定干细胞并调控其处于 G0 期 : 钙粘蛋白和整合素介导的细 胞粘附是普遍存在的微环境锚定干细胞的机制 ;

24 干细胞特征的维持与微环境密切相关 2 维持干细胞的自我更新和分化间的平衡 : 微环境结构是不对称 的, 与干细胞分裂机制共同决定干细胞的分裂方式 ; 3 调控干细胞命运 : 干细胞微环境为干细胞提供保护, 屏蔽外部 诱导分化因素对干细胞的影响从而维持干细胞的未分化状态

25 造血干细胞微环境的组成

26 第二节胚胎干细胞

27 一 概念 胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES cells): 早期胚胎发育过程中, 受精卵分裂形成囊胚, 囊胚内细胞团的单个细胞具有多向分化潜能, 可以分化产生三个胚层所有种类的细胞, 将其取出在体外建系和传代, 即为胚胎干细胞

28 二 胚胎干细胞建系 胚胎干细胞建系 : 使胚胎干细胞在体外培养条件下永久性非分化增殖

29 胚胎干细胞 (ES) 建系 1981 年英国剑桥大学 Evans 和 Kaufman 从小鼠的胚泡分离出内细胞团, 利用成纤维细胞作为培养 ES 细胞的饲养层, 成功地建立了体外培养哺乳类 ES 细胞的方法 29

30 小鼠胚胎干细胞 Nature, 1981

31 编辑小鼠目标基因的贡献

32 人胚胎干细胞 1998 年美国威斯康星大 学 Thomson 等科学家, 成功地建立了体外培养人类 ES 细胞的方法

33 James A. Thomson

34 trophectoderm yolk sac 0.15mm blastocyst 4 ½ - 5 days primitive endoderm 7 ½ days implanting epiblast 9 days implanted bilayered embryonic disc extraembryonic mesoderm

35 胚胎干细胞的分化 35

36 受精卵在分裂早期 尚未植入子宫以前, 囊胚内部的内细胞团便是具有全部分化能力的胚胎干细胞集合 如果能够源源不断地获得胚胎干细胞, 就可以在体外诱导产生不同的组织细胞甚至器官供移植用, 因而在临床实践上也有广阔的应用前景 36

37 Thomson, 1998 Mitalipov, 2013 人胚胎干细胞的获得与诱导分化

38

39 39

40 白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 是理想的小鼠胚胎干细胞分化抑制剂, 外源 LIF 可 使小鼠胚胎干细胞在未分化状态下长期培养 碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bfgf) 是目前人胚胎干细胞使用的最 佳分化抑制剂

41 三 胚胎干细胞的鉴定 1. 形态和分子标记 : 克隆生长 碱性磷酸酶 +,SSEA1+ or SSEA4+, 多潜能的基因高表达, 转录因子 Oct4,Nanog 和 Sox2 高表达和启动子区低甲基化 (hes and mes) 2. 体内成瘤 (hes, 畸胎瘤 ) 3. 嵌合体动物 (mes) 4. 四倍体补偿 (mes)

42 1. 体内成瘤 将 ES 细胞注入到同种或免疫缺陷小鼠的皮下或肾包囊, 以观察注入的细胞在宿主动物体内是否可以形成畸胎瘤 病理学检测时, 形成的畸胎瘤具有从胚胎三个不同胚层来源的各种细胞类型 典型的畸胎瘤含有多种组织细胞和类似的组织结构, 如上皮组织, 肌肉组织, 神经组织, 骨和软骨等

43 2. 嵌合体动物 嵌合体动物是指子代动物的各种组织和器官中都包含了来源于两种不同基因背景的细胞 将受试细胞注入到一个正处于胚胎发育的胚泡内, 把这种 杂合 的胚胎移植到假孕母鼠的子宫内 如果受试细胞是亚全能的胚胎干细胞, 就能和受体的囊胚共同发育形成子代动物个体, 这样的子代动物叫做嵌合体 (chimera)

44 嵌合体的小鼠 44

45 3. 四倍体补偿 正常小鼠的胚胎均为二倍体细胞, 在胚胎发育到二细胞阶段时, 用电或化学融合的方法使两个细胞融合为一个细胞, 所得到的细胞为四倍体胚胎, 四倍体胚胎不能发育出正常的个体, 仅能形成胎盘 此时如果将一个亚全能性干细胞注入四倍体囊胚, 可以获得一个完整的动物个体, 因为这个个体仅来源于该干细胞, 因此能证明移植进去的干细胞具有向三胚层分化的能力

46 TS (trophectodermal stem) visceral endoderm (ve) Epiblast (ep) extra-embryonic ectoderm (ex) Reichert s membrane (rm) primitive endoderm (pe) trophectoderm (te) visceral yolk sac (vys) the placenta (pl)

47 第三节成体干细胞

48 一 概念 成体干细胞 (adult stem cells): 是存在于成熟组织器官内 具有分化为相应组织器官功能细胞和自我更新能力的一类原始细胞 因此, 成体干细胞也可被认为是组织干细胞

49 成体干细胞

50 1. 造血干细胞 造血干细胞 (hematopoietic stem cells,hscs): 是形成和维持机体血液有形成分的起源细胞, 分化形成 T B 淋巴细胞 自然杀伤细胞 粒细胞 单核巨噬细胞 红细胞和血小板等功能细胞

51 造血干细胞 为了探索 再生障碍性贫血 和 白血病 等血液疾病的治疗方法, 科学家尝试用骨髓移植的手段重建病人的造血系统 实际上, 骨髓移植就是用骨髓中的血液干细胞来替代病人体内坏死或缺失的各种血细胞 因此造血干细胞是最早被研究, 也是目前认识最深入的干细胞 51

52 造血干细胞

53 成体干细胞 白细胞 肥大细胞 造血干细胞 红细胞 间充质干细胞 纤维细胞 脂肪细胞 53

54 造血干细胞 ( 多向性 ) 原红细胞 ( 定向性 ) 粒系巨噬定向干细胞 原巨核细胞 ( 定向性 ) 淋巴母细胞 网织红细胞 原单核细胞 原粒细胞 巨核细胞 淋巴细胞 红细胞 单核细胞 粒细胞 ( 中性 嗜碱 嗜酸性 ) 血小板 巨噬细胞 造血干细胞分化示意图 54

55 造血干细胞的筛选及应用 : 人造血干细胞表面标志物主要为 CD34+ CD59+ Thy1+ CD38low/- C-kit-/low lin- 等 通常认为, 造血干细胞是以 CD34+/Thy1+/lin- 为标记的细胞亚群 从骨髓中分离出的造血干细胞移植可重建患者造血系统, 治疗多种血液系统疾病

56 造血干细胞的微环境

57 2. 间充质干细胞 间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,msc): 来源于中胚层, 可以从骨髓, 软骨和骨组织中分离得到, 易于在体外扩增, 在不同的诱导条件下, 可以向多种组织细胞分化

58

59 间充质干细胞目前较公认的表面标记物包括 CD44,CD71,CD90,CD117,CD147 SH2 SH3 和 SH4 等 ; 但不表达血液细胞的标记物, 比如 CD34,CD45,CD14,CD31 和 MHC-II 分子等

60 3. 神经干细胞 神经干细胞 (neural stem cells,nsc): 来源于胚胎发育时期的神经上皮, 具有形成各种类型的神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力 在成体脑内神经干细胞存在于侧脑室下区和海马齿状回等区域

61 神经干细胞

62 目前, 神经干细胞还没有单一性的特异性标记 候选的标记 :Nestin,Sox2,CD133

63 4. 表皮干细胞 表皮干细胞 (epidermal stem cell): 在组织结构中位置相对稳定, 一般位于表皮的基底层, 在没有毛发的部位如手掌 脚掌, 表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层

64 外界 核解体迁移细胞干细胞分裂中的干细胞 角蛋白角质化细胞颗粒细胞棘细胞基底细胞基膜真皮 表皮层 哺乳动物表皮剖面图 64

65 表皮干细胞的特异性标志物 : 表皮干细胞的特异性标志物为 β1 整合素 角蛋白 19 (keratinl9, K19) 角蛋白 15 (keratinl5, K15) 和角蛋白 10(keratin 10,K10)

66 5. 肠道上皮干细胞 肠道上皮干细胞位于肠道的隐窝, 现有两种模型定位肠道上皮干细胞, 即 : (1) 从隐窝底部开始往肠道表面数第四个上皮细胞为干细胞 ; (2) 在第四个上皮细胞以下的隐窝细胞都可能是干细胞 肠道干细胞向下分化形成潘氏细胞, 向上形成增殖肠道上皮细胞, 在接近表面时分化形成多种功能的上皮细胞

67 肠道上皮干细胞

68 Paneth cells express CD24 and support growth of Lgr5 stem cells Nature 469, (20 January 2011) doi: /nature09637

69 目前, 小肠上皮干细胞可能的标记物 : Lgr5

70 第四节诱导多能干细胞 Induced pluripotent stem cells

71

72 诱导多能干细胞 日本京都大学 Takahashi and Yamanaka (Cell, 2006) : retroviral vector (plat-a) with Oct4, Sox2, Klf4 and c-myc 72

73 一 概念 诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells,ips cells): 通过各种诱导分子将终末分化的体细胞重编程为多潜能干细胞

74 一 诱导多能干细胞的建立 1. 诱导多能干细胞的诱导方法 2. 诱导多能干细胞的多能性鉴定

75 1. 诱导多能干细胞的诱导方法 (1) 应用逆转录病毒导入特定的转录因子可将成体细胞重编程为诱导多能干细胞 但其可能使外源基因插入细胞的基因组中引起插入突变, 存在一定的安全隐患 另外转染效率也较低

76 1. 诱导多能干细胞的诱导方法 (2) 利用质粒 附着体 重组腺病毒 仙台病毒 mrna mirna 及蛋白质等多种转导方法以避免基因插 入突变及提高诱导效率

77 beta-geo cassette (a fusion of the b-galactosidase and neomycin resistance genes) 24 genes Oct3/4, Klf4, Sox2, and c-myc Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka Cell 126, , August 25, 2006

78 细胞重编程获得诺贝尔奖 2012 年诺贝尔生理学或医学奖 英国科学家约翰 戈登 (John B. Gurdon) 和日本科学家山中伸弥 (Shinya Yamanaka) 获奖, 获奖理由为 发现成熟细胞可被重编程变为多能性

79 人类 ips: 诱导因子及诱导策略的选择 人类 ips Takahashi &Yamanaka 等利用转录因子 Oct4 Sox2 c-myc 和 Klf4; Yu & Thomson 等使用 Oct4 Sox2 Nanog 和 Lin28 79

80 人类 ips Oct4 Sox2 Nanog 和 Lin28 University of Wisconsin-Madison Primate Research Center 80

81 多能干细胞的来源 81

82 1. 诱导多能干细胞的诱导方法 (3) 使用小分子化合物来替代细胞重编程过程中使 用的外源基因 ( 小鼠成功 )

83 2. 诱导多能干细胞的多能性鉴定 细胞多能性的鉴定主要包括以下几个方面 : 形态学特 性 特异性标志分子的表达 体内外分化能力, 以及在其 基因表达和表观遗传学特性等方面进行检测

84 二 直接谱系重编程

85

86 三 诱导多能干细胞的应用前景 1. 构建疾病模型 2. 药物研发和筛选 3. 细胞移植治疗

87 人 ips 细胞的应用前景

88 1. 构建疾病模型 由于 ips 细胞具有来源广泛的特点, 并且具备自我更新和分化为多种细胞类型的能力, 因此它可以为构建疾病模型提供一个不断更新的组织来源, 进而可以用于探究疾病发病机制

89 利用人 ips 细胞构建心血管疾病模型

90 2. 药物研发和筛选 ips 细胞技术可以为药物毒性筛选提供充足的细胞来源 未来利用 ips 细胞开展的药物毒性检测将成为新药发现和研制之间的 过渡 阶段, 既具有可行性, 又具有实际意义 此外, 还可以利用某种特定疾病患者的 ips 细胞进行靶向治疗药物筛选

91 3. 细胞移植治疗 ips 细胞技术在再生医学领域具有广阔的应用前景, 其主要优点为 : (1) 来源于自体细胞, 大大降低了移植过程中的免疫排斥反应, 实现个体化治疗 ; (2) 来源于成体细胞, 因而克服了胚胎干细胞移植存在的来源不足和伦理问题

92 镰状细胞贫血 : 是一种常染色体显性遗传血红蛋白 (Hb) 病 因 β- 肽链第 6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替, 构成镰状血红蛋白 (HbS), 取代了正常 Hb(HbA), 在氧分压下降时 HbS 分子间相互作用, 成为溶解度很低的螺旋形多聚体, 使红细胞扭曲成镰状细胞 ( 镰变 )

93 利用人 ips 细胞进行细胞移植治疗

94 第五节干细胞与再生医学

95 一 概念 再生医学 (regenerative medicine): 通过研究机体正常的组织特征与功能 受创后修复与再生机制及干细胞分化机制, 寻找有效的生物治疗方法, 促进机体自我修复与再生, 或构建出新的组织与器官, 以改善或恢复损伤组织和器官功能的科学

96 二 获得与患者基因型匹配干细胞的方法 1. 细胞核移植技术 : 将患者体细胞核注入到一个去核卵细胞中, 使其发育形成囊胚后, 分离内细胞团, 建立与患者基因型匹配的胚胎干细胞 也称为治疗性克隆技术 2. 诱导多能干细胞技术 : 通过导入特定的转录因子或外加小分子化合物将终末分化的体细胞重编程为多能干细胞

97 获得与患者基因型匹配干细胞的两种方法

98 治疗性克隆技术

99 三 干细胞移植的再生治疗 1. 造血干细胞移植 : 是目前为止研究历史最为悠久 认识理解最为透彻 临床应用最为成熟的成体干细胞 2. 间充质干细胞的临床应用 : 具有自我更新和多向分化潜能, 可以发挥免疫抑制和抗炎症作用, 具有迁徙的能力, 使其具有重大的临床应用价值

100 间充质干细胞与治疗相关的生物学特性

101 本章重点内容 1. 干细胞的基本特性 2. 胚胎干细胞的生物学特性及鉴定标准 3. 诱导多能干细胞的概念及应用前景 4. 造血干细胞的生物学特性及其在再生医学中的应用

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