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1 生命科学前沿丛书 干细胞生物学 STEM CELL BIOLOGY 裴雪涛主编 北京

2 内容简介 本书介绍了干细胞生物学的理论知识 实验操作技术以及实际应用, 内容全面, 资料翔实 具体内容涉及以下几个部分 : 干细胞生物学基础理论 分类及干细胞增殖与分化的调控 ; 干细胞工程原理与技术, 包括干细胞的分离纯化 冻存与复苏 体外扩增与定向诱导分化 体外大规模培养与检测 ; 利用干细胞治疗人类各种疾病的研究现状, 包括心脏病 糖尿病 骨髓造血机能障碍 帕金森病 皮肤与肢体损伤等涉及人体各系统与器官的疑难杂症, 以及其在临床上的应用情况 ; 干细胞研究的前沿与展望, 包括干细胞模型与基因功能分析 成体干细胞的可塑性 干细胞与组织工程及基因治疗等 本书可供各高校 研究所从事干细胞研究及医疗卫生领域的研究生 科研与管理人员学习和参考 图书在版编目 (CIP) 数据干细胞生物学 / 裴雪涛主编 北京 : 科学出版社, ( 生命科学前沿丛书 ) ISBN Ⅰ. 干 Ⅱ. 裴 Ⅲ. 干细胞 生物学 Ⅳ Q24 中国版本图书馆 CIP 数据核字 (2003) 第 号策划编辑 : 莫结胜 / 文案编辑 : 彭克里吴慧涵责任校对 : 柏连海 / 责任印制 : 刘士平 / 封面设计 : 王浩 出版北京东黄城根北街 16 号 邮政编码 : http :// 印刷 科学出版社发行各地新华书店经销 2003 年 7 月第一版 2003 年 7 月第一次印刷 印数 : 开本 : B5 ( ) 印张 : 36 1/4 字数 : 定价 : 元 ( 如有印装质量问题, 我社负责调换枙新欣枛 )

3 枟生命科学前沿丛书枠专家委员会 主任委员 : 吴旻委员 : ( 按汉语拼音排序 ) 陈永福陈竺范云六贺福初黄大盕李家洋李衍达马大龙强伯勤沈倍奋王琳芳

4 枟干细胞生物学枠编写人员名单 主 编 : 裴雪涛 编写人员 : ( 按姓氏笔画排序 ) 王常勇王冬梅王小平王韫芳牛丽丽刘荷中李海民李艳华张杰张怡堃孟玲岳文周霖侯玲玲郭希民费振翔赵连旭高艳红袁红丰曹丰谢超裴雪涛

5 序 干细胞的研究与应用在枟科学枠 (Science) 杂志公布的 1999 年世界十大科技进展中名列榜首, 并于 2000 年再度入选世界十大科技进展 科学家发现, 取自人胚胎或骨髓的干细胞可用于培育不同的人体细胞 组织或器官, 这有望成为移植器官的新来源 组织器官移植有可能成为 21 世纪人类攻克某些重大疾患 ( 如心脑血管疾病 癌症 老年性疾病等 ) 的根本措施 如果这种移植手段被人们普遍接受的话, 有朝一日, 干细胞将能用来治疗各种人类的疾病, 包括神经损伤 心脏病 肝脏疾病等 干细胞是具有自我更新 高度增殖和多向分化潜能的细胞群体, 即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小, 同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞, 从而构成机体各种复杂的组织器官 随着干细胞技术的发展以及干细胞本身所具有的特性, 使得人类有可能在体外培养某些干细胞, 定向诱导分化为我们所需要的各种组织细胞以供临床所需 以此为目的的干细胞工程学几乎涉及人体所有的重要组织和器官, 也涉及人类面临的大多数医学难题, 如心血管疾病 自身免疫性疾病 糖尿病 骨质疏松 癌症 老年性痴呆 帕金森病 严重烧伤 脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病的治疗 此外, 干细胞研究还涉及组织工程学 功能基因组学和蛋白质组学 发育生物学 新药开发与药效 毒性评估等许多生命科学领域, 并将在人类健康与疾病治疗方面产生极其重要而深远的影响 裴雪涛教授一直从事干细胞生物学的基础与应用研究, 年轻的编著者们都工作在干细胞研究领域的第一线, 他们有着丰富的理论和技术积累, 掌握着这一领域最新的发展动态, 并以自己的勤奋和努力不断探索和推动着这一学科的发展 这次又通过枟干细胞生物学枠这本专著, 把干细胞的基本概念 基本理论与技术 各种干细胞的生物学特性 增殖分化调控 干细胞治疗, 以及相关的组织工程 基因治疗等的最新进展和研究成果奉献给大家, 这无疑是可喜可贺之事, 我相信这将进一步推动干细胞生物学及其相关学科的发展 中国科学院院士 2002 年 10 月于北京 i

6 前 言 干细胞研究是一门新兴的学科 从植物的生根 发芽 生长 凋亡 复苏, 人们看到了干细胞巨大的增殖分化潜能和长久不衰的生命力 ; 从壁虎断尾的再生, 人们体会到了干细胞的神奇和美妙 同时, 也激发了人们的强烈幻想, 希望有一天, 人类也能像壁虎和部分海洋生物一样, 能靠干细胞的自我更新 高度增殖和多向分化能力, 完美地修复或替代因疾病 创伤 衰老或遗传因素所造成的组织或器官的缺损或功能障碍 近年来, 随着发育生物学 实验血液学 神经生物学 细胞生物学 分子生物学 免疫学等学科的发展, 以及计算机技术 纳米技术 新材料技术等高新技术的突飞猛进, 使得干细胞的分离纯化 性能研究 培养扩增 诱导分化等有了突破性进展, 部分干细胞技术已开始进入临床应用 这一系列的成就使干细胞研究名列枟科学枠 (Science) 杂志 1999 年世界十大科技进展的榜首, 并于 2000 年再度入选世界十大科技进展 同时, 人类基因组测序即将完成 蛋白质组计划初露曙光 生物芯片技术不断完善和生物信息学模型日新月异 这些新学科和新技术向干细胞研究与应用的渗透, 又使我们有望回答干细胞维持自我更新的分子基础是什么 其跨系或跨胚层多向分化的调控机制如何, 以及哪些基因决定着体细胞的 重编程 (reprogramming) 等一系列更深层的问题, 从而使组织或器官的修复与替代这一 梦想 最终成为现实 因此, 在新世纪之初, 干细胞的研究又入选枟科学枠 (Science) 杂志列出的 2002 年值得关注的六大科技领域 干细胞生物学的研究与应用几乎涉及了所有的生命科学和生物医药学领域, 除了在细胞治疗 组织器官移植 基因治疗中的重要意义外, 还将在新基因发掘与基因功能分析 发育生物学模型 新药开发与药效 毒性评估等领域产生极其重要的影响 同时, 由于干细胞研究与应用中所涉及的干细胞来源 人与动物细胞核物质的互换 克隆人等问题所引发的社会问题 伦理学问题等也备受社会各界人士的关注 为此, 本书以新颖 实用为基准, 以可读 可操作为目的, 汇集了一批工作在第一线的年轻科学家 博士后和博士生, 以其对新知识的敏锐和对新技术的掌握, 把最新的理论 信息 方法及技术加以凝练, 希望达到系统 科学 全面地介绍干细胞生物学的基础 应用和进展, 为从事干细胞及其相关领域研究 开发和应用的同行提供一份参考和进一步磋商的材料, 也可供关注此领域的政治家 科学家 社会学家和伦理学家参考 干细胞研究发展迅猛, 新理论 新技术不断涌现, 不同的观点也存在争议, iii

7 甚至许多术语及译名也尚未规范与统一 本书各章节是由不同学者执笔, 他们的知识背景和学术观点各异, 都是各自研究领域的专家, 我对他们的学识 造诣 经验和责任心, 以及为本书所付出的辛勤劳动表示由衷的钦佩和感谢 尽管如此, 我依然要声明 : 书中的许多观点我并非完全同意 可对于这一年轻而又富于想像的新兴学科, 完全正确的观点应该出自未来, 而我们所能做的就是踏踏实实潜心研究, 发展才是硬道理 故文中的不妥之处, 可供商榷 最后, 我要特别感谢我的导师吴祖泽院士亲自为本书作序, 他的关怀与指导给了我许多信心和勇气 我还要感谢为本书的组织 联络 编辑 排版等做出贡献的岳文 闫舫 白慈贤 南雪和张锐等同事 此外, 本书的出版还得到国家高技术研究发展计划 (863) 领域重大专项 组织器官工程 (2002AA 和 2001AA216151) 国家重点基础研究发展规划 (973) 项目 ( G 和 2001CB509906) 国家杰出青年科学基金 ( ) 和北京市科委干细胞重大项目 (H ) 的大力支持, 在此深表谢意 裴雪涛 2002 年 10 月于北京 iv

8 目 录 1 导论 2 干细胞分类阐述 第一篇干细胞生物学概论 ( 3 ) ( 19 ) 3 干细胞增殖与分化的调控 ( 75 ) 4 干细胞的分离纯化 5 干细胞的冻存与复苏 第二篇干细胞工程原理与技术 ( 107 ) ( 125 ) 6 干细胞体外扩增与定向诱导分化 ( 154 ) 7 动物细胞的大规模培养技术 ( 190 ) 8 干细胞检测的各种技术方法 ( 213 ) 9 造血干细胞移植 10 干细胞与糖尿病治疗 11 干细胞与眼内移植 第三篇干细胞治疗研究及其临床应用 ( 235 ) ( 280 ) ( 298 ) 12 神经干细胞治疗帕金森病 阿尔茨海默病及其他神经系统损伤 ( 327 ) 13 皮肤干细胞与皮肤损伤修复 ( 352 ) 14 血管内皮干细胞与血管新生 ( 370 ) 15 干细胞移植与心肌梗死的治疗 ( 398 ) 第四篇干细胞研究前沿与展望 16 胚胎干细胞研究与应用 ( 427 ) 17 成体干细胞的可塑性 ( 449 ) 18 干细胞模型与基因功能分析 ( 478 ) 19 干细胞与组织工程 20 干细胞与基因治疗 ( 502 ) ( 533 ) v

9 第一篇 干细胞生物学概论

10 1 导论 生命科学是 20 世纪末和本世纪初自然科学中发展最为迅猛的学科 干细胞的研究与应用成为其中最令人瞩目的领域之一, 干细胞研究的新发现 在美国枟科学枠 (Science) 杂志公布的 1999 年的十大科学成果中名列榜首, 并于 2000 年度再度入选世界十大科学成果 那么, 是何种原因使干细胞研究受到科学家们的如此关注? 关于干细胞的描述始于 19 世纪末, 随着生命科学的进步, 干细胞研究和应用领域得以不断拓宽和深入 20 世纪 90 年代以来, 分离和体外培养各种不同来源干细胞的技术日益成熟, 研究不断取得突破性进展 目前, 干细胞生物学研究几乎涉及了所有的生命科学和生物医药领域, 除了在细胞治疗 组织器官移植 基因治疗中具有重要的意义外, 还在新基因发现与基因功能分析 发育生物学模型 新药开发与药效 毒性评估等领域产生重要影响 科学家们做出如此评价正是基于干细胞研究对人类生命科学和人类健康的所具有的重大意义 本章将对干细胞研究的起源与进展 干细胞的定义与分类及干细胞的应用前景等问题做出概述 1 1 干细胞研究的起源与进展 干细胞 一词最早出现于 19 世纪的生物学文献中, 像许多其他的生物学名词一样被引用至今, 并随着研究的深入被赋予新的内涵 1896 年, E. B. Wilson 在一篇论述细胞生物学的文献中第一次使用这个名词, 专门用来描述存在于寄生虫 ( 如蠕虫 线虫 蛔虫等 ) 生殖系的祖细胞 当时人们认为干细胞只是能够产生子代细胞的一种较原始的细胞 随着科学的发展和试验工具的进步, 人们对干细胞的认识也逐渐深入 1961 年 Till 和 McCulloch 首先描述造血干细胞的特性 : 将骨髓细胞悬液通过静脉注入受致死剂量 X 射线照射的小鼠体内, 注入的细胞在脾中形成集落 ( 脾结节 ) 细胞学研究表明, 脾集落就是来源于单个细胞的细胞克隆, 并且是一个包含红细胞和粒细胞的混合体, 此外还含有一些细胞, 当其被转移到其他受照射的小鼠体内时, 也可形成集落 Till 和 McCulloch 认为 这种来自于集落的细胞, 同时具有多向分化潜能和自我更新的能力, 就具有了造血干细胞的特点 多向分化潜能和自我更新也正是目前所认为的干细胞的基本特征 1983 年 Sulston 等的研究清楚地表明, 线虫生殖系祖细胞的发育潜能在每个细胞连续分裂的过程中发生了明显的改变, 只有早期的细胞分裂的产物仍能够保持亲代分裂球的特性, 具有自我更新的能力, 而并非所有的祖细胞均具有这种干 3

11 细胞的特性 1967 年, 美国华盛顿大学的多纳尔 托马斯发表报告称, 如果将正常人的骨髓移植到患者体内, 可以治疗造血功能障碍 自此, 便从血液系统开始了对干细胞临床应用的研究 1981 年英国剑桥大学的 Evans 和 Kaufman 成功地从小鼠延迟着床的囊胚中分离获得了小鼠的内细胞团细胞并建立了胚胎干细胞系, 从此胚胎干细胞的研究不断地拓展和深入 1998 年威斯康星大学的 Thomson 等 (1998) 分离人的内细胞团细胞并成功建立了人的胚胎干细胞系, 与此同时, Gearhart 等从人的原始生殖细胞中建立了胚胎生殖细胞系, 随后以色列 澳大利亚 日本 新加坡等也先后从体外受精卵分离获得了人胚胎干细胞系, 并诱导胚胎干细胞生成神经细胞 造血细胞 肌肉细胞 胰岛细胞等 (Suemori et al.2001, Boiani et al.2002) 这使胚胎干细胞的研究更加令人关注, 并带动了世界范围内的干细胞研究热潮 此项研究使科学家们看到干细胞生物工程的曙光 : 可以在体外培育所需的细胞 组织甚至是器官, 用来修复患者体内的坏损的组织器官 2001 年 11 月 25 日, 美国马萨诸塞州先进细胞技术公司利用克隆技术培育出人类早期胚胎, 该公司宣称是为了利用干细胞治疗疾病 这是治疗性克隆研究中的重大突破, 将有望帮助研究人员找到治疗帕金森病 (Parkinson disease) 糖尿病和阿尔茨海默病 (Alzheimer disease) ( 老年性痴呆 ) 等疾病的方法 1999 年 12 月, 美国科学家在枟美国科学院院刊枠 (Proceeding of the National Academy of Science of the United Stated of America, PNAS) 上发表报告说, 小鼠肌肉组织的成体干细胞可以 横向分化 为血液细胞 随后, 世界各国的科学家相继证实, 来自于成年动物和人的骨髓 脐带血等组织的成体干细胞, 具有跨系甚至是跨胚层分化的能力, 可以分化为骨 软骨 肌肉 神经 肝 脂肪等细胞类型 此外神经干细胞也可以转变为血液细胞, 脂肪基质干细胞也可以变成骨或软骨细胞 (Forbes et al.2002, Almeida Porada et al.2001) 由于胚胎干细胞的研究与应用目前面临伦理 法律及免疫排斥等问题, 成体干细胞的这种 可塑性 的发现与研究, 为干细胞的临床应用开辟了更为广泛的空间 1 2 干细胞定义与分类 干细胞的定义 在生命过程中, 有些组织的细胞需要不断地更新, 如皮肤 小肠和血液细胞等 目前, 各种组织的再生能力不同已经得到公认 Reguad 基于对精子发生学的研究首次提出, 干细胞的存在是组织具有自我更新能力的最根本的原因 ; 与此同时, 血液学家 Weidenreich Dantschakoff 和 Maximow 提出了一个热点问题, 即所有的血细胞都来自于一个共同的干细胞 虽然他们没有现代技术上的优势, 4

12 但这些敏锐的科学家认识到在组织 器官的整个生命过程中, 精子或者血细胞的发生之所以始终可以得到补充, 一定是因为存在一个具有自我更新能力的原始祖细胞 这样从历史的角度看, 干细胞的概念和组织的自我更新紧密相连 在一个器官的生命过程中, 是否具有重建其组织的能力成为确定该器官中的某些细胞是否是 干细胞 的一个重要的原则 那么, 究竟什么是干细胞呢? 干细胞 (stem cell, SC) 的 干, 译自英文 stem, 意为 茎干 干 和 起源 简单来讲, 干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞, 能够产生至少一种类型的 高度分化的子代细胞 干细胞群的功能即为控制和维持细胞的再生 一般来说, 在干细胞和其终末分化的子代细胞之间存在着被称为 定向祖细胞 的中间祖细胞群, 它们具有有限的扩增能力和限制性分化潜能 (Slack 2000) 这些细胞群的功能是增加干细胞每次分裂后产生的分化细胞的数量 干细胞具有自我更新的能力, 但是干细胞的分裂实际上是相对不对称的 (Van der Kooy and Weiss 2000) 多年来对干细胞的定义不断进行修正, 并从不同的层面上来进行定义 目前大多数生物学家和医学家认为干细胞是来自于胚胎 胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞, 能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞, 也能产生组成机体组织 器官的已特化的细胞, 同时还能分化为祖细胞 虽然在形态学和分子生物学水平上干细胞的结构意义能帮助定义干细胞, 但是干细胞的定义仍必须是建立在功能性的基础上的 从功能上讲, 干细胞是具有多向分化潜能 自我更新能力的细胞, 是处于细胞系起源顶端的最原始细胞, 在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞 对于单细胞来讲, 对这个定义进行严格限制是很重要的 尤其是在复杂的器官中, 为了区别干细胞和其他各种类型的祖细胞, 对其进行功能上的区分可能更精确和必要 因为干细胞和祖细胞的定义是由其是否具有自我更新能力所决定的 干细胞一旦分化为祖细胞后就失去了自我更新的能力, 出现对称性的有丝分裂, 祖细胞的数量只有通过干细胞的增殖分化来补充, 但是祖细胞仍然保持高度的增殖能力, 就造血干祖细胞而言, 各系造血过程中细胞的大量扩增主要依靠造血祖细胞的增殖 在成体的器官中, 干细胞可以通过不断分裂来修复组织, 或者是像在哺乳动物脑组织中那样处于静止的状态 干细胞在其发育期间能够通过对称性地分裂以扩增它们的数量, 或者通过非对称性分裂进行自我更新和产生更多不同分化类型的祖细胞 干细胞的分类 科学地对干细胞进行分类有助于对干细胞概念及其生物学特性的准确地把握 5

13 和理解, 目前可以采用以下几种方法对干细胞进行分类 根据发生学来源分类按照发生学来源, 干细胞可以分为胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ESC) 和成体干细胞 (somatic stem cell) (1) 胚胎干细胞在各种干细胞的研究与应用中, 胚胎干细胞最引人注目 胚胎干细胞是指由胚胎内细胞团 (inner cell mass, ICM) 或原始生殖细胞 (primordial germ cell, PGC) 经体外抑制培养而筛选出的细胞 此外, 胚胎干细胞还可以利用体细胞核转移 (somatic cell nuclear transfer, SCN T) 技术来获得 胚胎干细胞具有发育全能性, 在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞 ; 胚胎干细胞在体外可以大量扩增 筛选 冻存和复苏而不会丧失其原有的特性 (2) 成体干细胞成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞, 这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞 成体干细胞存在于机体的各种组织器官中 目前发现的成体干细胞主要有 : 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肝干细胞 肌肉卫星细胞 皮肤表皮干细胞 肠上皮干细胞 视网膜干细胞 胰腺干细胞等 成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态, 在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力 在多数情况下, 成体干细胞分化为与其组织来源一致的细胞, 但是在某些情况下, 成体干细胞的分化并不遵循该规律, 表现出很强的跨系或跨胚层分化潜能 例如, 骨髓 (bone marrow) 间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 不仅可以分化为造血基质细胞, 还可以向多种造血以外的组织迁移 定位并分化成相应的组织细胞 骨髓间充质干细胞在体外培养时也表现出多向分化潜能, 在不同的诱导条件下可以向成骨 成软骨 成肌肉和成脂肪细胞及中胚层以外的细胞, 如神经元等分化 而且分化方向已定的细胞, 在一定的条件下依然具有分化方向上的 可塑性 (plasticity) 还有研究表明, 神经干细胞 ( neural stem cell, NSC) 在生长因子 激素和微环境因素的作用下, 除了可以分化为神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞外, 还可以分化为骨骼肌细胞和造血细胞 可塑性 使得成体干细胞分化潜能较弱的传统观念受到挑战, 更重要的是, 表明其在修复 取代受损的细胞 组织甚至是器官方面将发挥重要作用 根据分化潜能分类根据不同的分化潜能, 干细胞可以被分为全能干细胞 (totipotent stem cell) 多能干细胞 (pluripotent stem cell) 单能干细胞 (unipotent stem cell) 6

14 (1) 全能干细胞具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力, 有形成完整个体的分化潜能, 如胚胎干细胞, 具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力, 可以无限增殖并分化成为全身 200 多种细胞类型, 进一步形成机体的所有组织 器官 (2) 多能干细胞 pluri 来自于拉丁词汇 plures, 意思是几个和许多 顾名思义, 多能干细胞具有产生多种类型细胞的能力, 但却失去了发育成完整个体的能力, 发育潜能受到一定的限制 例如, 造血干细胞可分化出至少 12 种血细胞, 骨髓间充质干细胞可以分化为多种中胚层组织的细胞 ( 如骨 软骨 肌肉 脂肪等 ) 及其他胚层的细胞 ( 如神经元 ) 科学家们目前趋向于将分化潜能更广的干细胞称为多潜能干细胞 (pluripotent stem cell), 如骨髓间充质干细胞, 而将向某一类型组织的不同细胞分化的干细胞称为多能干细胞 (multipotent stem cell), 如造血干细胞 神经细胞等 (3) 单能干细胞 ( 也称专能 偏能干细胞 ) 常被用来描述在成体组织 器官中的一类细胞, 意思是此类细胞只能向单一方向分化, 产生一种类型的细胞 uni 来自于拉丁单词 unus, 意思是 惟一, 单一 在许多已分化组织中的成体干细胞是典型的单能干细胞, 在正常的情况下只能产生一种类型的细胞 如上皮组织基底层的干细胞 肌肉中的成肌细胞又叫卫星细胞 这种组织是处于一种稳定的自我更新的状态 然而, 如果这种组织受到伤害并且需要多种类型的细胞来修复时, 则需要激活多潜能干细胞来修复受伤的组织 此外, 可以根据干细胞组织发生的部位进行分类 目前, 已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞, 其中包括 : 胚胎干细胞 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肌肉干细胞 (muscle stem cell) 成骨干细胞 (osteogenic stem cell) 内胚层干细胞 (endodermal stem cell) 视网膜干细胞 (retinal stem cell) 及胰腺干细胞等 而随着干细胞研究的进一步拓展和深入, 一些命名的含义将会更加丰富, 也将逐渐会有新的干细胞被发现 1 3 干细胞的生物学特点及其鉴别方法 干细胞的生物学特性 在成体动物中许多组织如皮肤 血液和小肠上皮的细胞寿命很短, 需要不断地被相应的新细胞替换 成熟个体产生新的分化细胞的途径之一是通过已存在的分化细胞的简单倍增形成新的分化细胞, 即分化细胞经分裂形成相同类型的两个 7

15 子代细胞, 如血管中新的内皮细胞就是通过这种方式产生的 但是, 在分化的过程中, 细胞往往因为高度分化而失去了再分裂的能力, 最终走上衰老死亡 为了弥补这一不足, 机体在发育过程中还保留了一部分未分化的原始细胞, 也就是干细胞 一旦生理需要, 这些干细胞可以按照发育途径通过分裂产生分化细胞 多向分化潜能和自我更新是干细胞的基本特点 具体来讲, 干细胞具有以下一些生物学特点 : 1 属非终末分化细胞, 终生保持未分化或低分化特征, 缺乏分化标记 ; 2 在机体的数目 位置相对恒定 ; 3 具有自我更新能力 ; 4 能无限地分裂 增殖, 干细胞可连续分裂几代, 也可在较长时间内处于静止状态 ; 5 具有多向分化潜能, 能分化为各种不同类型的组织细胞 ; 也即具有分化发育的可塑性, 在特定环境下, 能被诱导分化成在发育上无关的细胞类型, 其分化受其所处周围微环境的 [ 干细胞壁龛 (niche)] 影响 ; 6 分裂的慢周期性, 绝大多数干细胞处于 G 0 期 ; 7 干细胞通过两种方式生长, 一种是对称分裂, 形成两个相同的干细胞, 另一种是非对称分裂方式, 非对称分裂中一个保持亲代的特征, 仍作为干细胞保留下来, 另外一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞 在各种干细胞的研究与应用中, 胚胎干细胞最引人注目 1981 年英国剑桥大学的 Evans 和 Kaufman 等成功地从小鼠延迟着床的囊胚中分离并获得了小鼠的内细胞团细胞并建立了胚胎干细胞系, 从此胚胎干细胞的研究不断地拓展和深入 1998 年威斯康星大学的 Thomson 等借助 Gardner 等发明的 G1 2 和 G2 2 培养基, 解决了早期胚胎对输卵管的依赖性问题, 从而将新鲜和冷冻的体外受精卵 ( in vitro fertilization, IVF) 由 4 ~ 8 细胞阶段培养至分离人的内细胞团细胞并成功建立了人胚胎干细胞系 与此同时, Gearheart 从人的原始生殖细胞中建立了胚胎生殖细胞 (embryonic germ cell, EGC) 系 人胚胎干细胞分离和体外培养的成功, 使科学家们看到了干细胞生物学的曙光, 不仅掀起了新一轮干细胞研究的热潮, 还由于胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞和神经干细胞的成功, 使得干细胞应用于临床的研究取得了突破性的进展 (Amano et al. 2002, Fijnvandraat et al.2002, Kawasaki et al.2002) 美国的 NIH 委员会也在非规定的申请时间内破例为胚胎干细胞的研究提供了基金资助, 从此使胚胎干细胞的研究更加令世人瞩目 胚胎干细胞具有在体外无限扩增并保持未分化状态的能力, 因此, 它可以在体外大量扩增 筛选 冻存和复苏而不会丧失其原有的特性 胚胎干细胞主要有以下几个特点 : 1 具有发育全能性, 在一定的条件下有向 3 个胚层细胞分化的能力, 在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞 ; 2 具有种系传递能力, 能够形成嵌合体动物 ; 3 胚胎干细胞易于进行基因改造操作, 胚胎干细胞技术和基因打靶技术相结合, 如基因敲除 (gene knock out) 和基因转染已成为研究基因功能的重要手段 ( Tsai et al.1998, Soukharev et al.1999) 8

16 正是由于胚胎干细胞所具有的这些生物学特性, 使其成为发育生物学中研究细胞分化 组织形成过程的基本体系, 并成为临床细胞替代治疗和移植的新的细胞来源 随着对干细胞研究的深入, 成体干细胞成为目前干细胞工程的另一主要研究对象 人们从自体组织中分离出的成体干细胞, 在体外定向诱导分化为靶组织细胞并维持其增殖能力, 以达到研究和临床应用的目的 目前发现的成体干细胞主要包括 : 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肝干细胞 肌肉卫星细胞 皮肤表皮干细胞 肠上皮干细胞 视网膜干细胞等 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞等成体干细胞具有一定的跨系, 甚至跨胚层分化的特性, 人们称其为干细胞的 可塑性 成体干细胞的 可塑性 和人胚胎干细胞系的建立是迄今为止干细胞生命科学领域的最重要的研究进展, 目前关于成体干细胞可塑性的机制尚未清楚 (Weissman 2000) 以神经干细胞向造血细胞分化为例来说, 科学家们认为有以下几种可能的机制 : 一是神经干细胞向造血干细胞发生转分化 (trans differentiate) 或者是横向分化 ; 二是神经干细胞发生逆分化 (dedifferentiate) 或者去分化, 形成全能或者是多能的干细胞, 这种全能或者多能的干细胞进一步向造血细胞分化 ; 三是神经干细胞可能并不存在真正的可塑性, 只是在分离的神经干细胞中含有少量的多能或全能干细胞, 造血干细胞正是来源于这些少量存在的多能或者是全能的干细胞 成体干细胞的可塑性使得其像胚胎干细胞一样, 有可能在将来的再生医学 (regeneration medicine) 等应用领域发挥重要的作用 与胚胎干细胞相比, 成体干细胞在研究和应用方面具有以下优点 : 1 成体干细胞的自体移植避免了免疫排斥 ; 2 成体干细胞在正常情况下处于静止状态, 只有在病理情况下才显示出一定的自我更新潜能, 不像胚胎干细胞具有无限的自我更新能力, 因此成体干细胞导致细胞 永生化 甚至癌变的可能性较小 ; 3 成体干细胞的分化潜能比较局限, 更容易诱导向特定的组织细胞分裂, 也可以直接用于体内组织的原位修复 ; 4 某种类型的成体干细胞有向同种组织的损伤部位迁移的趋势, 这一点在神经干细胞表现尤为明显, 这有助于临床应用干细胞来进行疾病替代治疗时的定位 ; 5 分离和使用成体干细胞不存在伦理学问题 但是成体干细胞的应用还受到以下因素的制约 : 1 目前尚未在人体的所有部位分离出成体干细胞, 例如, 尚未发现肾干细胞 ; 2 在一些遗传性疾病中, 遗传错误也会出现在患者的干细胞中, 这种干细胞是不适合移植的, 而且由于环境因素的影响, 成体干细胞有可能有基因突变等 DNA 异常 ; 3 成体干细胞没有胚胎干细胞的增殖能力强 所有这些因素使得成体干细胞无法完全取代胚胎干细胞 9

17 1 3 2 干细胞的鉴别方法 尽管许多组织中都存在干细胞, 但其数量很少, 而且在显微镜下时, 无法将它们与这些组织中的其他细胞清楚区分 因此, 如何找到一种简单有效的方法, 科学 准确地区分这类稀少的细胞, 一直是科学家们不断探索的课题 过去人们普遍采用的干细胞鉴别方法主要有以下两种 : 1 利用干细胞的慢周期性, 采用标记滞留细胞的分析方法来识别在体的静息干细胞 ; 2 利用干细胞的自我更新能力, 观察其在体外培养时表现出的无限的增殖能力来而识别离体的干细胞 但这两种方法应用时具有一定的限制性 (Cotsarelis et al. 1999) 目前研究人员普遍采用的方法是依靠干细胞的表面标志来区分和鉴定各种干细胞 干细胞的表面标志是指覆盖在细胞表面的特殊的蛋白质 受体, 它能选择性的结合或黏附其他信号分子 目前已发现了干细胞表面的许多不同类型的受体, 利用单克隆抗体的特异性和多样性, 应用不同抗体的合理组合可以区分干细胞和其他细胞, 根据干细胞表面标志还可以分离不同类型的干细胞及其亚群 抗体介导的细胞分离技术主要有 : 抗体 / 补体介导细胞溶解法 流式细胞仪细胞分选法 平面黏附分离法和免疫磁珠分离法等 (Li et al.1998, Michel et al.1997) 不同的干细胞有其独特的表面标志, 具体的干细胞的分离鉴定将在以后各章中详细描述 目前基因和分子技术的发展大大地扩展了干细胞的研究方法, 使人们可以通过检测细胞中特异性的基因和转录因子来鉴定干细胞 如用 PCR 技术来可以识别使细胞具有某种特异性的基因的表达 这种技术有助于研究人员通过识别 基因标志 来区分干细胞 例如, PDX 1 基因的产物是一种转录因子, 负责胰岛素基因的最初活化 研究人员通过识别它来鉴别出能分化出胰岛细胞的干细胞 此外, 研究人员还利用基因工程技术结合荧光素技术鉴别干细胞 这种技术的意义就在于可以检测分化 ( 或称为定向分化 ) 时的干细胞, 科学家在干细胞中插入一种被称为绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因 这种基因激活后在干细胞中产生一种绿色荧光蛋白, 从而通过显微成像技术可以鉴别干细胞 利用这种方法研究人员可以分离早期的干细胞 识别组织中的干细胞及追踪分化过程中的干细胞 这些鉴别手段目前在许多实验室已被广泛应用, 它们在未来的干细胞研究中将起重要作用 随着不断地识别新的干细胞和对它们的研究日益深入, 许多科学家致力于探讨更精密 准确的方法以满足需要, 相信在不远的将来, 在迅速发展的干细胞生物学领域, 识别表面标志等干细胞的分离方法将发挥更为起重要的作用 10

18 1 4 干细胞研究中的相关概念及术语 目前在专业文献 新闻报刊中有许多用来描述干细胞的词汇或术语, 但经常被混淆和误解 当今, 干细胞生物学领域正以令人难以置信的步伐向前发展, 在所发表的各种生物医学的论文中, 几乎每周都有新的发现 因此, 对干细胞及其相关术语进行科学的界定十分必要 分化 (differentiation) 分化是一个过程 在分化的过程中, 细胞内一些特定的基因开始表达, 而其他基因并不表达, 从而一个非特化的细胞特化成为一个具有特殊结构并执行一定功能的细胞 例如, 干细胞分化为神经细胞, 神经细胞具有薄的纤维状的保护膜, 负责发出和接收电化学信号, 其促使该神经细胞和其他的神经细胞进行传导 在实验室中, 干细胞可以人为地操纵, 使其变向某一种类型的细胞分化, 如心肌细胞 肝细胞或胰腺细胞 祖细胞 (progenitor or precursor cell) 胚胎和成体组织中的祖细胞是部分特化的, 它可以分裂并产生某种类型的细胞 研究人员可以通过以下特性鉴别祖细胞和干细胞 : 当一个干细胞分裂时, 两个子代细胞中至少有一个是具有自我复制能力的干细胞 ; 而当祖细胞分裂时, 它可以形成两个祖细胞或者是产生两个分化细胞, 但是这些细胞都失去了自我复制的能力 胚胎生殖细胞 (embryonic germ cell, EGC) 胚胎生殖细胞来自于 5 ~ 10 周龄的胚胎性腺区的早期生殖细胞 在发育的后期, 性腺区发育成睾丸或卵巢, 原始生殖细胞产生卵子或精子 胚胎干细胞和胚胎生殖细胞都是多潜能细胞, 但二者在性能和特征上还不能清楚地区别 (Matsui et al.1992) 胚胎癌细胞 (embryonal carcinoma cell, ECC) 来源于恶性畸胎瘤的一种多能的干细胞 畸胎瘤是由机体内幼稚生殖细胞发生变异而形成的肿瘤 恶性畸胎瘤内既含有各种分化成熟的组织, 还含有一些未分化的 能不断增殖的干细胞, 因其形态和发育潜能都类似胚胎细胞, 而且是恶性的, 故称为胚胎癌细胞 胚泡 (blastocyst) 由 30 ~ 150 个细胞组成的植入前胚胎组织, 呈球状, 胚泡的壁由单层的滋养层细胞组成, 中央的空腔称为胚泡腔 (blastocoele), 在胚泡腔的内侧有一团大而不规则的细胞称为内细胞团 (inner cell mass) 骨髓细胞 (bone marrow cell, BMC) 包括不同发育阶段的血细胞 ( 造血干 / 祖细胞 形态上可识别的幼稚的血细胞和成熟的血细胞 ) 和造血基质细胞 ( 巨噬细胞 成纤维细胞 间充质细胞等 ) 骨髓干细胞 (bone marrow stem cell, BMSC) 至少包括两种类型干细胞 : 造血干细胞 (hematopoietic stem cell) 和骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem 11

19 cell) 间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 中胚层发育的早期细胞, 不仅可以分化为造血实质和造血基质细胞, 还可以分化为许多造血以外的组织, 特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞 可塑性 (plasticity) 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞等成体干细胞具有一定跨系 甚至跨胚层分化的特性, 称其为干细胞的 可塑性 嵌合体 (chimera) 一种生物体, 由至少来源于两种不同受精卵的细胞组成, 而理论上, 这些受精卵具有独立形成完整个体的能力 集落形成细胞 (colony forming cell) 生长在固体培养基表面的一些细胞群, 每个细胞群都是由一个细胞分裂增殖而产生 集落刺激因子 (colony stimulating factor) 一种可以刺激造血干细胞增殖的可溶性蛋白 胚胎小体 (embryoid body, EB) 在体外培养环境中时, 如果在胚胎干细胞的培养体系中撤除抑制细胞分化的因子 ( 如滋养层细胞或白血病抑制因子 ), 胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力, 可以自发形成多细胞结构, 即胚胎小体, 胚胎小体中含有 3 个胚层的细胞, 胚胎小体继续分化, 可以自发分化为血细胞 内皮细胞及神经等不同类型的细胞 饲养层细胞 (feeder cell layer) 共培养中用来维持多能干细胞未分化特性的细胞, 通常指胎鼠的成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblast, MEF) 白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 用以维持胚胎干细胞增殖和未分化状态的一类生长因子 系表面抗原 (lineage surface antigen, Lin) 当干细胞分化为各系的祖细胞和成熟的血细胞时, 会出现各系细胞的专一性标志, 如淋巴系 CD19 CD7, 粒系的 CD13 CD11 CD15 CD16, 红系的 CD47 CD51 CD71, 巨系的 CD31 CD41 CD42 CD61 CD63 CD107, T/NK 系的 CD2 CD11 CD25 CD7, 这些在特定类型的血细胞表面出现的抗原通称为系表面抗原 神经干细胞 (neural stem cell, NSC) 存在于成体的神经组织的干细胞, 可以分化形成神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞 体细胞 (somatic cell) 动植物体内任何生殖细胞以外的细胞都可以称为体细胞 体细胞核转移 (somatic cell nuclear transfer) 将体细胞的细胞核移入一个成熟的去核卵母细胞的过程 12

20 干细胞抗原 (stem cell antigen 1, sca 1) 存在于骨髓细胞中造血干细胞和间充质干细胞表面的蛋白质 表面标志 (surface marker) 存在于某种细胞表面的特异性的表面蛋白, 利用这些表面蛋白的特异性表达, 应用抗体结合或者其他的检测方法可以获得相应的目的细胞 1 5 干细胞的应用前景 干细胞研究受到科学家和世人的广泛关注有其必然性, 干细胞在生命科学的 基础研究与临床应用中起着越来越重要的作用, 干细胞在细胞治疗 组织器官修 复 发育生物学 药物学等领域有着极为广阔的应用前景 作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞 组织器官的损伤和功能衰竭一直以来是人类健康所面临的一大难题, 完美地修复或替代因疾病 战伤 意外事故或遗传因素所造成的组织 器官或肢体的伤残一直是人类的梦想, 也是难以攻克的医学高峰 目前的治疗方案均难以完全修复受损的组织 器官或使其功能得以长期恢复 科学家们在经过长期的探索和努力之后, 最终把目光落在干细胞上, 生命体是通过干细胞的分裂来实现细胞更新及保证持续增长, 干细胞的研究与应用将有可能使人类实现完美修复损伤组织和器官的梦想 多年来科学家们一直致力于寻找利用干细胞的复制和分化来取代受损细胞或组织的方法 这一点随着组织工程 胚胎工程 细胞工程 基因工程等各种生物技术的发展和干细胞生物学研究领域的突破而展现出无比广阔的前景 按照一定的目的在体外人工培养 分离干细胞已成为可能, 利用干细胞构建各种细胞 组织 器官作为移植的来源将成为干细胞应用的主要方向 造血干细胞移植 (hematopoietic stem cell transplantation, HSC) 技术已经逐渐成熟并且得到广泛的应用, 已经成为治愈恶性血液病和实体瘤等疾病的可靠选择, 成为干细胞研究和应用的成功范例 近年来, 骨髓间充质干细胞因具有高度自我更新能力 多向分化潜能和取材方便等优点而备受关注, 成为细胞治疗和组织工程的理想种子细胞 随着年龄的增长, 机体的组织器官会出现退行性的改变, 从而引发一些相关疾病, 如肌萎缩 肌营养不良 脑萎缩 帕金森病 阿尔茨海默病等 骨髓间充质干细胞在体内外能够分化为肌肉细胞和神经细胞, 为治疗这些退行性疾病带来了希望 我们实验室诱导鼠骨髓间充质干细胞成为分泌多巴胺的细胞, 利用这些细胞进行替代治疗对鼠的帕金森症状有缓解作用 此外, 日本科学家也成功诱导猴的胚胎干细胞分化为分泌多巴胺的细胞 更为重要的 13

21 是, 目前已经能够从发育中甚至成年中枢神经系统组织分离出神经干细胞, 这些细胞在体外扩增培养后植入神经系统的损伤或病变部位, 可以分化为神经元 星形胶质细胞 少突胶质细胞, 为缓解或修复神经系统损伤和退行性病变的细胞替代治疗带来了新的希望 利用体外分离的骨髓间充质干细胞或其诱导分化后的细胞来改善遗传缺陷组织的功能这一治疗途径正在试验中, 胰腺干细胞和胚胎干细胞为糖尿病的细胞替代治疗带来了希望, 胰腺干细胞有可能替代糖尿病患者被自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞而成为糖尿病进行干细胞替代治疗的种子细胞 理论上讲, 干细胞工程和现代组织工程学几乎涉及人体所有的重要组织和器官及人类面临的许多医学难题, 如意外损伤 放射损伤等患者的植皮, 肌肉 骨及软骨缺损的修补, 髋 膝等关节的置换, 血管疾病或损伤后的血管的替代, 糖尿病患者的胰岛植入, 心脏病患者的瓣膜置换, 房室间隔缺损的修补, 癌症患者手术后大剂量放化疗后的造血与免疫重建, 切除组织的或器官的替代, 肝 肾等重要脏器损伤和功能衰竭的置换, 部分遗传缺陷性疾病的治疗等 造血干细胞工程及其产品已经或正在进入临床应用, 预计在不久的将来某些组织工程产品, 如人造皮肤 血管 骨 软骨 肌肉 瓣膜 神经, 甚至胰岛 肾 肝 心脏等将相继问世, 人类将实现完美修复组织器官的愿望, 人类将进入实际应用现代组织工程产品的新时代 探讨胚胎发育的调控机制 发育生物学是生命科学的前沿领域, 在最近几十年里, 对发育生物学的某些基础领域有了较为深入的认识 但是发育生物学领域依然存在许多未解的问题, 例如, 一个单细胞 受精卵细胞是如何发育成复杂的组织 器官 系统乃至完整的有机个体? 生命最大的奥秘就是探讨一个受精卵如何发育成复杂的生物体 但是, 由于受精卵植入子宫后的不可接近性, 使人们对胚胎发育机制的探讨受到影响 而人胚胎干细胞系的建立将有助于我们探讨发育过程中的影响因素和调控机制 在对胚胎发育过程中关键性调控机制的研究中, 胚胎干细胞无疑已成为一个重要的工具, 例如, 可以比较胚胎干细胞和不同时空的分化细胞之间的基因表达差异, 研究参与胚胎发育与分化的分子机制 作为疾病基因治疗的载体 干细胞是对疾病进行基因治疗的理想载体 造血干细胞具有自我更新 多向分化 重建长期造血 采集和体外处理容易等特点, 因此是基因治疗最理想的载体细胞之一, 以此为基础的基因治疗, 在重症免疫缺陷 遗传性疾病 恶性肿 14

22 瘤 造血干细胞保护 AIDS 等领域具有广阔的应用前景 (Hawley 2001) 骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达, 这种特点结合骨髓间充质干细胞的多向分化潜能, 使其可能成为一种理想的基因治疗的靶细胞 此外, 人胚胎干细胞可以不断自我更新, 经过遗传操作后依然能够稳定地在体外增殖, 将其作为基因治疗的载体, 将有可能解决目前基因治疗中所面临的用作载体的细胞在体外不能被稳定改造和传代的问题 胚胎干细胞的遗传改造将有可能被用于遗传性疾病的治疗领域 (Tsokos and Nepom 2000) 目前人们普遍关注的干细胞分离纯化技术的进步 基因转染效率的提高 基因转移载体 ( 脂质体 逆转录病毒 腺病毒 腺相关病毒等 ) 的不断改进及转基因细胞的扩增和定向诱导分化 新的目的基因的发现 目的基因转染后的稳定表达和调控等领域的深入研究将使得与干细胞相关的基因治疗更加有效和广泛地应用于临床 利用胚胎干细胞体外整合外源基因, 研究基因功能 胚胎干细胞与基因定位整合技术相结合, 对于研究基因在胚胎发育中的表达与功能具有十分重要的意义 利用这项技术可以将一些在发育过程中特定的基因敲除 (gene knock out), 在动物体内进行基因功能缺失的研究, 这对于揭示以前不能在体内充分证明的分子调控机制也具有重要的作用, 此外, 还可以在干细胞水平上利用基因功能获得性突变使特定基因在体内瞬时或长期表达, 来研究基因在胚胎不同发育时期的作用 药物筛选平台的建立, 药理研究与新药开发 胚胎干细胞可以分化为多种细胞类型又能不断自我更新, 这在药物研究领域具有广泛的用途 目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的人体细胞, 而胚胎干细胞可以经过体外诱导, 为人类提供各种组织类型的细胞, 这为药物筛选 鉴定及其毒理的研究提供坚实的基础, 并有助于人类疾病细胞模型的建立及新药开发 (Jones and Thomson 2000) 1 6 干细胞研究中的主要问题 虽然目前关于干细胞的研究在很多方面取得了突破性的进展, 但是干细胞研究中依然有很多未知的领域需要科学家们不断的探索和追求 这些问题主要包括以下几个方面 : 1 维持胚胎干细胞未分化状态的机制 ; 2 干细胞定向诱导分化的调控机制 ; 3 获得高数量和高纯度的分化细胞, 为组织工程提供种子细胞 ; 4 虽然人胚胎干细胞可以形成各种类型的细胞和简单的组织, 但是其是否具有 15

23 形成复杂器官的能力目前还远未清楚, 胚胎干细胞诱导分化为人体的器官并进行移植目前还面临很多的问题, 尤其是大型的 复杂的 精细的人体器官 ; 5 来源于胚胎干细胞的细胞应用于细胞和组织替代治疗所面临的移植排斥问题 ; 6 干细胞用于临床治疗的安全性问题, 对于胚胎干细胞而言, 在移植前应该保证胚胎干细胞全部被诱导分化, 对诱导分化的细胞应该严格纯化 ; 7 干细胞可塑性的机制是怎样的, 干细胞分化时所处微环境中的调控因素是如何起作用的 除此之外, 目前尚待解决的问题还包括影响干细胞 归巢 的调控的机制等 对于胚胎干细胞的研究, 目前还面临一系列的伦理学和社会学问题 1996 年 7 月 5 日, 全世界第一只克隆羊多利在苏格兰的罗斯林德研究所诞生时, 这一事件如雷霆风暴般席卷了全世界, 包括科学界 宗教界 伦理学界 政治界等社会各界, 无不因这划时代的事件而震动 然而, 胚胎干细胞研究在世界范围内引发了更为激烈的伦理争议 争议的焦点在于胚胎干细胞的来源, 即是否可以从胚胎中获得干细胞进行研究, 如果可以, 是可以从治疗生育疾病多余的或流产的胚胎中选取, 还是可以通过克隆等技术制造出的专门用于干细胞研究的胚胎中选取 在这种争议存在的情况下, 美国国立卫生研究院 ( National Institute of Health) 公布了枟关于胚胎干细胞研究的指导原则枠, 该原则允许使用私人资助的现已获得的来自于人胚胎的细胞系进行研究, 但是禁止应用干细胞创建人胚胎的研究, 禁止将人胚胎干细胞与动物胚胎结合研究, 禁止生殖性克隆 该指导原则对使用来自胎儿组织的细胞系进行研究相对比较宽容 继美国之后, 英国和法国相继颁布了相关的法律严格禁止克隆人并指出对人类胚胎干细胞的研究要在严格的法律监控下, 遵循伦理道德的原则进行 (Young 2000) 2002 年初, 英国人类受精和胚胎学管理机构分别批准了爱丁堡大学和伦敦盖伊医院关于研究人类胚胎干细胞的申请, 这使其在干细胞方面的研究一直处于世界领先的地位 目前胚胎干细胞的研究仍是科学家和反对者之间争论的热门话题 尽管干细胞研究目前还面临许多需要探讨的问题, 但干细胞在生命科学的基础研究和对人类疾病的治疗领域中所具有广阔的前景是显而易见的 干细胞的研究和临床应用近几十年来取得了长足的进展, 科学家们孜孜不倦的探索将使干细胞研究领域得以不断的拓宽和深入, 人类将真正实现揭示生命发育的奥秘和利用干细胞进行治疗疾病和完美替代损伤组织器官的梦想 参考文献 ( 岳文张怡堃裴雪涛 ) Almeida Porada G, Porada C, Zanjani ED Adult stem cell plasticity and methods of detection. Rev Clin Exp Hematol, 5 : 26 ~ 41 Amano T, Kato Y, Tsunoda Y Non radioactive in situ detection of mrn A in ES cell derived cardiomy 16

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26 2 干细胞分类阐述 人或动物从受精卵到成体的全部发育过程中, 在胚胎和成熟组织中均存在一些具有高度的自我更新能力和多向分化潜能但尚未分化的干细胞 根据其发育阶段, 干细胞可分为胚胎干细胞和成体 ( 组织 ) 干细胞 按分化潜能的大小, 干细胞基本上可分为 3 种类型 : 一类是全能干细胞, 具发育全能性, 能分化为各种分化细胞, 甚至参与个体发育, 具有形成完整个体的分化潜能, 胚胎干细胞即属于此类 ; 第二类是多能干细胞, 它具有分化出多种细胞组织的潜能, 但却失去了发育成完整个体的能力, 如骨髓间充质干细胞 神经干细胞 造血干细胞 肌肉干细胞和皮肤干细胞等 ; 第三类称为专能干细胞, 只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化, 如肝干细胞 肠上皮干细胞 胰腺干细胞 ( 沈干 2001) 这些干细胞在基础研究和临床应用中均具有重要价值 近年来, 干细胞领域令人吃惊的一系列发现已经动摇了有关人体中细胞专化如何控制的已成之见, 能发育成一系列组织的细胞正引发一场生物学革命 随着方法学的进展, 目前已经能够体外分离和培养某些类型的干细胞, 因而使干细胞生物学的研究掀起了新一轮热潮 干细胞生物学至少将在两个领域中有重要意义 : 一是为发育生物学研究提供有利的体外模型, 揭示细胞分化的内在机制, 即如何从一个细胞 ( 受精卵 ) 分化发育为多种复杂的组织 器官 系统直至完整的有机个体 ; 另一个重要领域则是运用组织工程和基因工程技术, 体外对干细胞进行诱导分化和人为改造 ( 如导入目的基因等 ), 然后用于体内组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗, 为临床开拓新途径 干细胞生物学将是 21 世纪的一个热点领域, 已受到国内外学者的高度重视, 本章将着重对几种重要干细胞的基本生物学特性等进行分类阐述 2 1 全能干细胞 简单地说, 胚胎干细胞是指极早期的胚胎细胞, 也就是受精卵分裂至少达 16 ~ 32 个细胞时期的胚胎 ( 又名桑葚胚 ) 及分裂球 ( 即单个细胞 ) 此时若将分裂球的各个细胞分开 每个细胞都能够发育成一个完整的胚胎, 所以细胞生物学家称这种细胞是 全能细胞, 这也表明胚胎干细胞可能发育成机体中各种类型的细胞或组织 通常胚胎性干细胞是指由早期胚胎内细胞团 (inner cell mass, ICM) 或原始生殖细胞 (primordial germ cell, PGC) 分离出来并建系成功的多潜能细胞, 与机体内发育的早期胚胎细胞有着相似的形态特征和分化潜能 哺乳动物早期胚胎的每个细胞都具有全能性 在胚胎发育早期, 囊胚的内细胞团中含有 19

27 图 2 1 囊胚的内细胞团和滋养层 图 2 2 人体组织器官的分化 (NIH Report 2001) 20

28 约 140 个细胞, 最外层由一层扁平细胞构成的滋养层, 可发育成胚胎的支持组织等 ; 中心的腔称囊胚腔, 腔内一侧的细胞群, 即 内细胞团 ( 图 2 1) 内细胞团中的胚胎干细胞可进一步分裂 分化并发育成个体 内细胞团在形成内 中 外 3 个胚层时开始分化 每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官 ( 图 2 2) 由于内细胞团中的胚胎干细胞可以发育成完整的个体, 因而这些细胞被认为具有全能性 而哺乳动物 PGC 最早出现于靠近尿囊基部的卵黄囊内胚层内, 以后胚胎纵向折转, 卵黄囊这一部分成为胚胎的后肠, PGC 由此做变形运动, 经背侧系膜向生殖嵴移动 从生殖嵴 ( 性腺嵴 ) 分离的 PGC 也是一种多能的胚胎干细胞 由胚胎建立胚胎干细胞细胞系的原理, 就是把囊胚期的内细胞团 桑葚胚或 PGC 在体外培养建系, 并设法阻止其分化 根据来源的差异将前者称为胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ESC), 后者称为胚胎生殖细胞 (embryonic germ cell, EGC), 通常所说的胚胎干细胞即 ESC 其基本特征是具发育全能性, 能分化为属于外胚层 中胚层和内胚层范畴的各种分化细胞, 甚至参与个体发育 胚胎干细胞的生物学特性是识别 鉴定胚胎干细胞并进行进一步应用操作的理论基础 ESC 的形态学特征及核型 各种哺乳动物包括人 ( 无论是动物还是人源 ) 的 ESC 都具有与早期胚胎细胞相似的形态结构特征, 胞体体积小, 核大, 有一个或多个核仁, 核仁清晰 ESC 在超微结构 组织化学 福斯曼抗原 (Forssman antigen) 及蛋白合成方式等方面的研究表明, ESC 与卵圆柱期胚胎外胚层和胎儿生殖嵴的原始生殖细胞类似, 而与 ICM 细胞有差异 细胞中多为常染色质, 胞质结构简单, 散布着大量核糖体和线粒体, 核型正常, 具有稳定的整倍体核型 如 Thomson 等 (1998) 分离的 5 个人的 ESC 系中 H1 H13 和 H14 具有正常的 XY 核型, H7 和 H9 具有正常的 XX 核型, H9 培养 6 个月后仍具有正常的 XX 核型 正常 ESC 染色体正常, 如发生异常则很难发育形成动物个体 ESC 的生长特性 ESC 在体外分化抑制培养时, 呈克隆状生长, 细胞紧密地聚集在一起, 圆形或卵圆形细胞均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状的群体细胞克隆, 细胞界限不清, 克隆周围有时可见单个 ESC 和分化的扁平状上皮细胞 ESC 增殖迅速, 每 18 ~ 24h 增殖 1 次 ESC 不同于其他细胞系的两个特征在于 : 1 具有多向分化潜能即具有像早期胚胎组织细胞那样的全能 ( 多能 ) 性, 能够被诱导生成机体各种类型的细胞 ; 2 具有体外培养细胞系的特征, 可以在体外不断扩增, 21

29 并能连续无限地保持未分化状态传代 已证实近年建系的人 ESC 具有较强的端粒酶活性, 在体外培养体系中连续培养 4 ~ 5 个月而不分化, 具有比一般体细胞更长的寿命和更高的增殖活性 另外, ESC 有在遗传操作 选择 冻存及复苏后不失其多能性的特点, 并且来自同一克隆的细胞具有同样的特征, 其在不同的生长条件下可具有不同的功能状态 ESC 的端粒酶活性 端粒酶是增加染色体末端端粒序列的一种核糖核蛋白, 参与维持端粒长度, 端粒长度对细胞复制的寿命有很重要的作用, 因此细胞生理年龄可以通过测定端粒序列的长度来判定 端粒酶的表达与人细胞的永生化高度相关, 对一些人二倍体细胞引入端粒酶活性, 会延长其复制的寿命 ; 人二倍体细胞缺乏端粒酶活性, 随年龄增长, 其端粒变短, 在组织培养中经过有限增殖期后, 进入复制衰老状态 ; 相反, 在生殖系细胞和胚胎组织, 端粒酶高水平表达, 因此 ESC 端粒酶活性的高度表达表明其复制的寿命长于体细胞复制的寿命 Thomson 等 (1998) 研究证明 ESC 具有很高的端粒酶活性, 这也揭示 ESC 和 PGC 比体细胞核移植具有更现实的应用前景 碱性磷酸酶的表达 在早期胚胎如小鼠 大鼠的桑葚胚和囊胚细胞均有碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AKP) 表达, 小鼠的 ESC 中也含有丰富的 AKP, 活性较高 而在已分化的 ESC 中 AKP 呈弱阳性或阴性 猪 兔的桑葚胚和早期囊胚 AKP 呈阳性 因此, AKP 常用来作为鉴定 ESC 分化与否的标志之一 ESC 的高度分化潜能 ESC 的体外分化潜能用于 ESC 分离的胚胎 ( 胚胎细胞 ) 或 PGC 是具有全能性的细胞或细胞团, 在体内这些细胞处于快速增殖和有序分化状态 对动物而言, 其实质是个体产生稳定性组织差异的过程, 从分子生物学角度讲, 从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞是细胞特异基因在时间和空间上差次表达的结果, 组织细胞间的差异主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活 因此, ESC 的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达, 以实现分化抑制, 保证细胞的全能性 ESC 在体外需在饲养层 (feeder layer) 细胞上培养才能维持其未分化状态, 一旦脱离饲养层就自发地进行分化 大鼠肝细胞等条件 22

30 培养基和细胞分化抑制因子 / 白血病抑制因子 (differentiation inhibitory activity/ leukemia inhibitory factor, DIA/LIF) 的应用, 也可使培养的 ESC 处于不分化状态 除去这些分化抑制物, 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞, 悬浮培养可形成 简单类胚体, 进一步培养可形成 囊状胚体, 使简单类胚体重新附着于培养皿上生长, 可形成不同种类复杂的细胞分化物 ESC 在体外某些物质的诱导下可以发生定向分化, 如在对造血系统的研究中发现, ESC 不仅可以向各系细胞分化, 还可以分化为造血干细胞, 而且分化过程与在体内发育过程类似 将转化生长因子 ( transforming growth factor β1, TGF β1) 或 MyoD 基因导入 ESC, 可以发育为血管样结构或骨骼肌和肌管, 而二甲基亚砜可诱导 ESC 向各类肌细胞分化, 维甲酸可诱导其向神经细胞分化, 对聚集培养的 ESC 进行诱导则可分化为节律性收缩的心肌细胞 这些发现为 ESC 基础研究提供了重要依据 ( 杜伟忠和丛笑倩 1998, Sato and Nakano 2001) ESC 的体内分化潜能将 ESC 注射到同源动物皮下则形成复杂的混合组织瘤, 其细胞组成可代表 3 个胚层细胞 如在 Balb/c nu 裸鼠腋下接种 ESC 或 EGC 小鼠产生畸胎瘤, 除大量的干细胞巢和间质细胞外, 还包括神经管 腺管 上皮细胞 软骨和肌肉等多种类型的分化细胞 Thomson 等 (1998) 将来自囊胚分离的 5 个 ESC 系分别注射给重症联合免疫缺陷的棕色小鼠, 每个小鼠都产生胚胎组织瘤, 每个胚胎组织瘤包括胃上皮 ( 内胚层 ) 软骨骨髓 平滑肌 横纹肌 ( 中胚层 ) 和多层鳞片状上皮细胞 ( 外胚层 ) 嵌合体动物 ( 试验 ) 参与宿主胚胎发育, 并形成嵌合体动物包括生殖系嵌合体后代是 ESC 和 EGC 的最基本特征 嵌合体试验是传统验证 ESC 和 EGC 全能性的重要实验和最有说服力的途径, 即 ESC 与正常胚胎嵌合, 如能产生包括生殖系在内的各个组织器官且能产生功能性配子的嵌合体 ( 种系嵌合体 ), 即可证实的确分离到具发育全能性的 ESC 系 以小鼠 ESC 为例说明常用的两种方法 1 胚胎聚集法, 将两个宿主的 8 细胞期桑葚胚置入在培养皿中铺的琼脂层上打的小洞穴内 然后, 3 ~ 5 个 ESC 或 EGC 组成的细胞团块置入这两个桑葚胚之间 确保 ESC 或 EGC 与桑葚胚黏附在一起 体外培养聚合体使其发育至胚泡期 选择发育良好的胚泡转移至假孕母鼠的子宫内使其着床和进一步发育 2 纤维注射法, 将 8 ~ 10 个 ESC 或 EGC 直接注入宿主发育 4d 的胚泡, 待胚泡复形后转移至假孕母鼠子宫内继续发育 当 ESC 被异位移植至皮下时, 仍保持着旺盛的细胞增殖特性, 虽然其具有发育全能性或多能性, 但其发育的遗传程序失控, 表现为无序的细胞分 23