第 3 期李长玲等 : 绿海龟外周血细胞显微结构与分类 25 已有报道, 曹伏君等对乌龟 (Chinemys reevesii) 外周血细胞的显微和超微结构进行研究分析 [4], 黄斌等对巴西彩龟 (Trachemys scripta) 血细胞显微结构进行观察研究 [5], 王石泉对鳖 (Trion

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1 第 28 卷第 3 期 2008 年 6 月广东海洋大学学报 Journal of Guangdong Ocean University Vol.28 No.3 Jun 绿海龟外周血细胞显微结构与分类李长玲, 曹伏君, 黄翔鹄, 刘楚吾, 麦哲文 ( 广东海洋大学水产学院, 广东湛江 ) 摘要 : 对绿海龟 (Chelonia mydas) 外周血细胞的进行显微观察结果表明, 经 Wright s 染液染色, 可鉴定出红血细胞单核细胞淋巴细胞血栓细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞嗜中性粒细胞等七种血细胞其中红血细胞数量多, 长椭圆形, 具圆核白细胞数量少, 多为圆形, 分无颗粒型白细胞和颗粒型白细胞两种无颗粒型白细胞包括单核细胞和淋巴细胞, 细胞质中无特殊颗粒 ; 颗粒型白细胞包括嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞, 细胞质中具有特殊颗粒在白血细胞中, 血栓细胞体积最小, 单核细胞体积最大 ; 在数量上, 血栓细胞最多, 淋巴细胞次之, 单核细胞和嗜碱性粒细胞则较少绿海龟的淋巴细胞可分为大淋巴细胞和小淋巴细胞两种类型在外周血细胞中可观察到分解解体状态的红血细胞, 还可观察到少量未成熟的红血细胞和嗜中性粒细胞, 偶尔可见正在分裂的红血细胞, 提示红血细胞也可在外周血直接分裂关键词 : 绿海龟 ; 血细胞 ; 显微结构中图分类号 :Q 文献标志码 :A 文章编号 : (2008) Microstructure and Identification of Peripheral Blood in Chelonia mydas LI Chang-ling, CAO Fu-jun, HUANG Xiang-hu, LIU Chu-wu, MAI Zhe-wen (Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang ,China) Abstract: The morphology of peripheral blood cells of the Chelonia mydas was studied. On the stained smears, seven major types of cells are recognized: erythrocyte, thrombocyte, lymphocyte, monocyte, neutrophil, eosinophil and basophil. Among these cells, erythrocyte is the most abundant and has round nucleus. Leucocytes are divided into two types: granulocytes and non-granulocytes. Non-granulocytes include lymphocyte and monocyte; granulocytes include neutrophil, eosinophil and basophil. In size, thrombocyte is the smallest among leucocytes, and monocyte is the largest; in quantity, thrombocyte is the largest, lymphocyte the second, then monocyte and basophil. Lymphocytes can be divided into two types: large lymphocyte and small one. In peripheral blood cells, decomposition as well as immature erythrocytes can be observed, and sometimes even in the process of fission. Key words: Chelonia mydas;blood cells;microstructure 绿海龟 (Chelonia mydas) 隶属于爬行纲 (Reptile) 龟鳖目 (Testudoformes) 海龟科 (Chelonidae) 海龟属 (Chelonia), 为我国二级保护动物 [1-2] 血细胞是机体免疫的重要成分, 对外界环境的理化刺激较为敏感, 特别是对寄生虫致病微生物以及药物等引起的反应更明显对血细胞进行研究, 既有助于从比较血液学和比较免疫学的角度认识它们的正常和病理功能与动物生长发育成熟繁殖生存环境等因素的关系, 又能从系统演化上探讨它们的进化趋势和特点 [3] 对龟鳖类外周血细胞的研究, 国内外收稿日期 : 第一作者 : 李长玲 (1964-), 女, 副教授, 研究方向为水生生物学 ybcl@tom.com 通讯作者 : 刘楚吾, 男, 教授 liucw@gdou.edu.cn

2 第 3 期李长玲等 : 绿海龟外周血细胞显微结构与分类 25 已有报道, 曹伏君等对乌龟 (Chinemys reevesii) 外周血细胞的显微和超微结构进行研究分析 [4], 黄斌等对巴西彩龟 (Trachemys scripta) 血细胞显微结构进行观察研究 [5], 王石泉对鳖 (Trionyx sinensis) 外周血细胞显微形态及细胞化学进行研究分析 [6], 王军萍等对中华鳖 (Trionys sinesis) 血细胞显微和超微结构进行观察分析 [7], 吴孝兵对 16 种爬行动物血细胞形态学参数进行了研究分析 [8], 还有一些学者对鳖的血细胞的功能和龟鳖的嗜碱性粒细胞进行了研究 [9,10] 关于绿海龟血细胞的大小和数量与季节和种群特征的关系已有报道 [11,12] 本文研究海龟的外周血细胞的显微结构, 旨在加强我国爬行动物血液学的研究, 促进和发展爬行动物生物学研究, 为绿海龟等珍稀保护动物药用经济动物的人工养殖和疾病防治提供基础资料 1 材料与方法 1.1 材料实验用的四只绿海龟均来自海南省琼海, 雌雄各半, 体重 ~ g, 活体运回实验室, 经检查鉴定无明显病变, 于水族箱中暂养备用 1.2 方法尾静脉取血, 常规血涂片, 自然干燥后, 用 Wright s 染液染色, 充分水洗, 干燥后用中性树胶封片 [13], 在德国蔡氏 AXIOSKOP40FL 数码显微成像系统下观察并拍照测量记数 : 对于细胞及细胞核大小均取 100 次测量的平均值 [14], 对 100 张血涂片上的 267 个视野中的 2525 个白细胞进行分类计数 (differential leucoyte count,dlc) 2 结果 2.1 血细胞大小表 l 显示, 绿海龟的白血细胞以血栓细胞和小淋巴细胞体积最小, 嗜碱性粒细胞嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞次之, 单核细胞和大淋巴细胞则体积较大 ; 在数量上, 血栓细胞最多, 淋巴细胞次之, 单核细胞和嗜碱性粒细胞则相对较少表 1 白细胞分类计数和各类血细胞大小 Tab.1 Differential leucoyte count(dlc)and size of all types of blood cells 细胞 DLC / % 细胞长径短径 /(µm µm) 胞核长径短径 /(µm µm) 红血细胞 (18.87±1.62) (12.78±1.20) (6.41±0.81) (4.55±0.56) 淋巴细胞 (13.80±3.62) (11.90±3.28) (11.27±2.73) (8.80±2.29) 单核细胞 8.79 (19.34±2.12) (14.75±1.81) (12.19±0.98) (9.30±1.06) 嗜中性粒细胞 (16.24±1.15) (15.34±1.15) (12.13±1.04) (8.71±1.17) 嗜酸性粒细胞 (15.24±1.74) (14.34±1.52) (7.94±1.81) (4.98±1.05) 嗜碱性粒细胞 2.56 (17.05±0.78) (15.98±1.05) (7.12±0.94) (5.18±0.78) 血栓细胞 (10.94±1.30) (6.35±0.88) (8.47±0.97) (5.73±0.72) 2.2 血细胞的显微结构红血细胞红血细胞数量最多, 成熟的红细胞为椭圆形, 表面光滑, 核近圆形, 一般位于细胞中央, 致密染色体团块染成紫红色, 胞质染成砖红色, 染色均匀幼稚红血细胞 (12.5 ~ 15.0 µm) 数量少, 近圆形, 核圆形, 较大, 染色质结构疏松, 着色较浅 ; 胞质被染成灰紫蓝色 ( 图 1-1) 偶见正直接分裂的红血细胞 : 细胞核中间出现缢痕, 分成两个等大小的细胞核 ( 图 1-2); 还可见红血细胞核影 ( 图 1-3) 和融解的红血细胞 ( 图 1-1): 膜破裂, 胞质外溢, 核体积显著增大, 染成紫红色, 形成核影淋巴细胞淋巴细胞数量较多, 可细分为小淋巴细胞和大淋巴细胞小淋巴细胞体积较小, 但占比例较大, 常呈圆形或不规则, 表面常伸出许多伪足状突起核质比大, 核中染色质稠密, 着色深, 被染成深紫色, 胞浆较少, 染成深蓝色 ( 图 1-4) 大淋巴细胞体积较大, 近圆形或椭圆形, 核质比大, 核中染色质较稠密, 着色较深, 被染成紫色 ; 胞浆染成深蓝色, 在核外围成环核带或仅见于胞核凹陷处 ( 图 1-5) 单核细胞单核细胞在数量上占白细胞的比例较小其形状不规则, 表面常伸出许多伪足状突起胞质较多, 染成灰蓝色, 可见分散细小的

26 广东海洋大学学报嗜天青颗粒和大小不一的空泡核椭圆形或不规则较大占整个细胞 1/3 ~

正在溶解的红血细胞(Der)和幼稚的红血细胞(Ier) 2 分裂的红血细胞(Dier)和红血细胞(Er) 3 红

7 嗜中性粒细胞(Ne) 8 嗜中性粒细胞分叶 (Sne) 9 晚幼嗜中性粒细胞(Nme) 10

1 Microstructure of peripheral bloods in Chelonia mydas 2.

3 26 广东海洋大学学报嗜天青颗粒和大小不一的空泡核椭圆形或不规则较大占整个细胞 1/3 ~ 1/2 偏于细胞一侧核中染第 28 卷色质分布较疏松染成红紫色图红血细胞(Er) 正在溶解的红血细胞(Der)和幼稚的红血细胞(Ier) 2 分裂的红血细胞(Dier)和红血细胞(Er) 3 红血细胞核影(Ns) 4 小淋巴细胞(Sl) 5 大淋巴细胞(Ll) 6 单核细胞(M).7 嗜中性粒细胞(Ne) 8 嗜中性粒细胞分叶 (Sne) 9 晚幼嗜中性粒细胞(Nme) 10 嗜酸性粒细胞(Eo) 11 嗜碱性粒细胞(Ba) 12 血栓细胞(Th) 图 1 绿海龟外周血细胞显微结构 Fig.1 Microstructure of peripheral bloods in Chelonia mydas 嗜中性粒细胞嗜中性粒细胞在数量上占白细胞的比例较大呈圆形细核形状不规则呈圆形肾形偶见分叶状图核多偏于细胞一侧约占细胞体积的 1/3 ~ 1/2 染色质斑块

4 第 3 期李长玲等 : 绿海龟外周血细胞显微结构与分类 27 状, 呈深浅不均的紫红色胞质染成粉红色, 其中有细小的染成粉红色的嗜中性颗粒和少量不均匀分布的嗜天青颗粒, 边沿有不明显的小囊泡可见幼中性粒细胞, 其核质比较大, 胞浆呈淡蓝色, 胞质中也有细小的染成淡红色的嗜中性颗粒和嗜天青颗粒 ( 图 1-9) 嗜酸性粒细胞嗜酸粒细胞呈圆形, 核质比较小核不规则, 有分叶现象, 常偏于细胞的一侧细胞质粗糙, 橘红色, 其中充满较大的特殊颗粒, 颗粒呈圆形, 大小均匀, 嗜酸性, 染成亮红色, 分散在细胞一侧, 量多时可散落在胞核上 ( 图 1-10) 嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞数量最少, 圆形特殊颗粒很大, 呈圆形或不规则, 分布不均匀, 多聚集于细胞核周围, 颗粒嗜碱性, 被染成蓝紫色细胞核多呈圆形, 体积较小, 偏心位核内染色质呈块状, 染成紫蓝色胞质疏松, 染成淡红色或毛玻璃样无色 ( 图 1-11) 血栓细胞血栓细胞形状与小淋巴细胞相似, 呈卵圆形泪滴状或裸核状, 染成深紫兰色, 体积较小, 边缘不太光滑往往成堆出现, 或四五个集在一起核质比大, 核形态随细胞体而异, 核中染色质稠密, 着色很深胞质染成淡灰蓝色, 在核外围成极薄的一圈, 或不明显 ( 图 1-12) 3 讨论 3.1 龟鳖类血细胞的分类有关龟鳖类血细胞的分类, 不同的学者有不同的观点 Girons 将爬行动物血液中成熟血细胞分为红细胞粒细胞 ( 包括嗜酸性粒细胞嗜喊性粒细胞嗜天青粒细胞和嗜中性粒细胞 ) 淋巴细胞单核细胞浆细胞和血栓细胞 [15] [16] Cooper 等认为嗜天青粒细胞和嗜中性粒细胞属同一种细胞, 它们是同一种细胞发育分化的两个不同阶段笔者观察到绿海龟外周血细可以区分出红血细胞淋巴细胞血栓细胞单核细胞嗜碱性粒细胞嗜中性粒细胞嗜酸性粒细胞七种血细胞, 未发现浆细胞, 其分类结果符合 Cooper 的分类方法 3.2 白细胞的比例龟鳖类白细胞比例在不同种类存在明显差异中华鳖中性粒细胞数量为 34.8% ~ 59.5%, 淋巴细胞 13.0% ~ 28.5%, 嗜天青粒细胞 14.0% ~ 30.8%, 嗜碱性粒细胞 2.4% ~ 10.0%, 单核细胞 0.6% ~ 4.0%, 嗜酸性粒细胞 0.0 ~ 2.0% [7] 在乌龟(C. reevesii) 中各白血细胞比例为中性粒细胞数量 57.5%, 嗜碱性粒细胞 24.9%, 单核细胞 8.8%, 淋巴细胞 6.68%, 嗜酸性粒细胞 3.12% [4] 吴孝兵等发现平胸龟 (Platysternon megacephalum ) 黄喉拟水龟 (Mauremys mutica ) 黄缘闭壳龟(Cistoclemmys flavomarginata ) 乌龟中的嗜中性嗜酸性粒细胞比例高 (40% ~ 50%), 淋巴细胞比例很低 (12%), 或观察不到绿海龟的白细胞比例是淋巴细胞 20.92%, 单核细胞 8.79%, 嗜中性粒细胞 14.39%, 嗜酸性粒细胞 12.16%, 嗜碱性粒细胞 2.56%, 血栓细胞为 41.18% 龟鳖类白细胞比例存在明显差异, 哪一种细胞的比例最大亦有所不同究其原因, 除龟鳖类具有种的特异性外, 不同的生理状态不同季节不同个体和年龄等因素均可导致白细胞比例的差异 [4,7,8,11,12], 这种差异还与不同作者的研究方法有密切关系 3.3 红细胞的形态与功能红细胞的主要功能是运输氧气对爬行动物 29 科 76 种动物的红细胞的研究表明, 红细胞的大小和形态与动物的分类地位有关 [8,17] Wintrobe 认为脊椎动物红细胞的大小和形态反映了动物的进化地位 [18] 爬行动物红细胞的形态有一定的科种的特征 [8,17] ; 鳖外周血红细胞与人相比, 体积大, 具有细胞核, 表明单位红细胞血红蛋白的载氧和二氧化碳总量大, 似与可长时间适应水底栖息或活动的需要有关 [7,9] 绿海龟红细胞长径约 µm, 短径约 µm, 较其他爬行类 [8] [8] 的大 ( 黄缘闭壳龟稍小,16.9 µm), 具细胞核, 这与龟类在爬行动物进化史上处于较低位置有关, 也证明了绿海龟具有长期适应水底生活的生理特征绿海龟具无丝分裂的红血细胞, 这不同于乌龟的有丝分裂 [4], 因此认为在系统分类上绿海龟的分类地位比乌龟低级 3.4 无颗粒白血细胞的形态与功能单核细胞存在于其他脊椎动物中担负着非特异性免疫机能, 具强烈吞噬与防御机能 [19] 龟鳖类的单核细胞在结构和功能上与哺乳动物相似, 不同的是龟鳖类外周血中的单核细胞在血管内就可变成巨噬细胞, 具一定吞噬功能, 特别在发生炎症时, 数量剧增, 并和嗜中性粒细胞一起发挥较强的吞噬作用 [20] 从本实验结果来看, 绿海龟外周血液中的单核细胞和部分淋巴细胞具胞突, 为粗短或细小的指状突起, 结构与哺乳动物和其他龟鳖类相似, 因此, 绿海龟的单核细胞和部分淋巴细胞与其他哺乳动物一样, 具有运动能力和相似的免疫机制

5 28 广东海洋大学学报第 28 卷 3.5 血栓细胞的形态与功能龟鳖类血栓细胞小, 卵圆形, 核较长, 中位, 主要参与凝血和止血过程, 其功能类似于哺乳动物的血小板 ; 其细胞质是一薄层, 围绕在核的周围 ; 胞质几乎不着色, 血栓细胞易碎, 细胞质常丢失, 核多个聚集在一起 [21,22] 在显微镜下, 绿海龟血栓细胞的细胞质薄, 着色淡, 核多个聚集在一起, 胞膜上有许多细长突起, 其结构与其他龟鳖类相似 3.6 有颗粒细胞的结构与功能哺乳动物嗜酸性粒细胞的细胞质中充满出大的嗜酸性颗粒, 染成橘红色, 该颗粒含有过氧化物酶酸性磷酸酶, 具有溶菌功能和吞噬能力 ; 嗜碱性粒细胞的细胞质中含有大小不等的嗜碱性颗粒, 染成深蓝色, 分布不均匀, 该特殊颗粒能够释放组织胺及肝素, 其肝素具有抗凝血作用, 组织胺参与过敏反应, 并具有吞噬能力 ; 嗜中性粒细胞的细胞质中充满细小的嗜中性颗粒, 染成浅红色, 该颗粒具有酸性水解酶过氧化物酶溶菌酶和碱性磷酸酶等, 对细菌的分泌物和受损伤的组织所释放的化学物质有趋化性, 能形成伪足, 作变形运动, 可以穿过血管, 进入组织的发炎中心, 聚集到细菌入侵的部位, 大量吞噬细菌 [19] 有研究报道, 中华鳖的嗜中性颗粒细胞具有明显的吞噬能力 [20] 本实验结果表明, 绿海龟的颗粒细胞着色情况与哺乳动物的颗粒细胞相近 [19] 绿海龟的嗜中性粒细胞中可见到内吞泡因此, 绿海龟的嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞与哺乳动物和其他爬行动物一样, 具吞噬作用在绿海龟的外周血细胞中, 嗜中性粒细胞数量较多, 这与乌龟的不一致 [4] 从细胞发育角度来说, 嗜中性粒细胞的核从没有分叶到分叶, 其实就是一个衰老的过程而且分的叶越多, 细胞衰老的程度越高 [19] 绿海龟的外周血细胞当中, 出现核分叶的嗜中性粒细胞数量很少, 因此可推断海龟的衰老过程比较缓慢参考文献 [1] 张孟闻, 宗愉, 马积藩. 中国动物志爬行纲第 1 卷 [M]. 北京 : 科学出版社,1998: [2] 张金泉. 港口国家级自然保护区及其海龟的生态生物学特性 [J]. 中国生物圈保护区,1996,3(4):3-5. [3] 陆雨燕. 爬行动物血细胞研究进展 ( 一 )[J]. 烟台师范学院学报 ( 自然科学版 ),1999,15(3): [4] 曹伏君, 李长玲, 刘楚吾, 等. 乌龟外周血细胞的显微和超微结构 [J]. 水生生物学报,2001,25(3): [5] 黄斌, 杨霁虹, 陆玉建. 巴西彩龟血细胞显微结构的观察研究 [J]. 动物科学与动物医学,2002,19(9): [6] 王石泉. 鳖外周血细胞显微形态及细胞化学 [J]. 动物学杂志,1995, 30(1): [7] 王军萍, 郭明申, 韩希福, 等. 中华鳖血细胞显微和超微结构的观察 [J]. 中国水产科学,1999,6(4): [8] 吴孝兵, 张盛周, 吴海龙, 等.16 种爬行动物血细胞形态学参数研究 [J]. 动物学杂志,1998,33(1): [9] 李丕鹏, 朱洪文. 龟鳖嗜碱性粒细胞的显微和超微结构 [J]. 动物学报,1990,36(2): [10] 蒋立科, 宋祥芬, 齐跃敏, 等. 鳖血细胞结构及功能的初步研究 [J]. 动物学报,1996,42(3): [11] Frari W. Turtle red blood cell packed volumes, size and numbers[j].herpetologica, 1997, 33: [12] Bolten A B,Biorndal K A.Blood profiles for wild population of green sea turtles(chelonia mydas) in the southern Bahama: Size-specific and sex-specific relationships[j].journal of wildlife diseases,1992,28(3): [13] 芮菊生, 杜懋琴, 陈海明, 等. 组织切片技术 [M]. 北京 : 人民教育出版社,1980: [14] 袁仕取, 张永安, 姚卫建, 等. 鳜鱼外周血细胞显微和亚显微结构的观察 [J]. 水生生物学报,1998,22(1): [15] Girons M C S.Morphology of the circulating blood cells[j] // Gans C,Parson T S, ed.biology of the reptilia.london:academic press, 1970: [16] Cooper E L, Klempau AE, Zapata AG.Reptilian immunity[m] // Biology of the Reptilia. Gans C, ed. New York: John Wiley & Sons, 1985,13: [17] Saint Girons M C, Saint Girons H.Contribution a la morphologie comparée des érythrocytes cherles reptiles[j].br J Herpet, 1969, 4(4): [18] Wintrobe M M.Variations in the size and haemaglobin concentration of erythrocytes in the blood of various vertebrates[j]. Folia Haemat, 1933, 51: [19] 上海第一医学院. 组织胚胎学 [M]. 北京 : 人民卫生出版社, 1978: [20] 潘连德, 邹玉蓉. 中华鳖嗜中性粒细胞吞噬功能的研究 [J]. 中国水产科学,2000,7(2): [21] 程备久, 蒋立科, 宋祥芬, 等. 鳖血细胞数量的季节变化及形态结构研究 [J]. 应用生态学报,1996,7(4): [22] Wood F E,Ebanks G K. Blood cytology and hematology of the green sea turtle[j]. Calotes mydas Herpetologica, 1984, 40(3):

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Microsoft Word 曹伏君_new_.doc 45 2 Vol.45, No.2 2014 3 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Mar., 2014 (Lethrinus erythropterus) * ( 524025) Wright (Lethrinus erythropterus),,,, ; ; ; Q954.56 doi: 10.11693/hyhz20140100011 (Lethrinus erythropterus)