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1 园艺学报,2015,42 (11): Acta Horticulturae Sinica 2174 doi: /j.issn x ; ahs. ac. cn 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生王烨, 顾兴芳 *, 张圣平, 苗晗 ( 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 ) 摘要 : 以欧亚杂交类型黄瓜 (Cucumis sativus L.)65G 228 的 F 1 为材料, 对未受精胚珠进行离体培养, 通过 6 因素 5 水平的正交试验, 研究预处理温度诱导培养基 TDZ KT 和 BA 浓度对未受精胚珠雌核发育的影响结果证明 TDZ 浓度对胚发生频率有极显著影响, 是诱导黄瓜离体雌核发育的最主要因素, 当其浓度为 0.02 mg L -1 时胚状体的诱导率最高诱导培养基和 KT 浓度显著影响胚发生率, 而预处理温度和 BA 浓度影响不显著硝态氮 (NO - 3 ) 和铵态氮 (NH + 4 ) 含量比例均接近 1 1 的诱导培养基, 较其他比值较大的培养基的胚发生率有显著提高利用流式细胞仪进行倍性鉴定, 再生植株中单倍体率为 18.2% 关键词 : 黄瓜 ; 未受精胚珠 ; 单倍体 ; 流式细胞仪中图分类号 :S 文献标志码 :A 文章编号 : X(2015) Studies on Haploid Plant Induction via in vitro Unfertilized Ovule Culture of Cucumber WANG Ye,GU Xing-fang *,ZHANG Sheng-ping,and MIAO Han (Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing ,China) Abstract:The unpollinated ovules of cucumber(cucumis sativus L.)line 65G 228 were used to obtain haploid plants via in vitro gynogenesis. With the unfertilized ovules,a regeneration system of cucumber was established by analizing the effects of pretreatment temperature,induction medium, concentration of TDZ,KT and BA on haploid induction. The results indicated that 0.02 mg L -1 TDZ was better for the initiation of gynogenesis. Induction medium and concentration of KT significantly affected the frequency of embryo induction. Further,the highest embryo regeneration frequency was achieved at IM3 medium supplemented with 0.75 mg L -1 KT and 2.0 mg L -1 BA. The embryos could grow root and develop into the complete plant on MS medium. Flow cytometry analysis showed that 18.2% of the regenerated plants were haploid. Key words:cucumber;unfertilized ovule;haploid;flow cytometry 黄瓜 (Cucumis sativus L.) 单倍体培养有助于缩短育种年限, 提高育种效率由于单倍体经染色体加倍后获得的双单倍体 (DH) 不存在等位基因位点的显隐性作用, 隐性基因控制的性状能够获得充分体现, 因此可极大降低筛选育种材料时的误选概率此外, 利用单倍体技术还能迅速获得个收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目 (CARS-25); 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 通信作者 Author for correspondence( guxingfang@caas.cn)

2 王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗. 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报,2015,42 (11): 体完全纯合同质的双单倍体群体, 为遗传分析分子标记和数量性状研究提供理想材料但黄瓜单倍体的自然发生概率极低 (Savin et al.,1988), 不能满足科研工作需要, 因此人工诱导单倍体发生势在必行, 而雌核离体培养是目前最有效的途径 Gémes-Juhúsz 等 (2002) 首次通过雌核发育途径获得黄瓜单倍体植株, 但诱导再生频率较低魏爱民等 (2007) 研究了栽培方式和栽培季节对黄瓜未受精子房发育的影响杜胜利 (2001) 杜胜利等 (2003) 通过对黄瓜离体雌核发育过程的研究发现, 外植体中的多种酶活性在诱导前期便产生了明显变化, 同时细胞学观察显示雌核发育已启动此外, 陈小鹏等 (2005) 王璐等(2008) 刁卫平等 (2008) 王烨等(2008) 裴晓利(2011) 裴晓利等(2011) 和 Li 等 (2013) 还对基因型培养基预处理等影响黄瓜单倍体发育的诱导条件和技术环节进行了研究和优化至今, 黄瓜单倍体相关研究开展的虽然较多, 但再生频率仍然较低, 且多以未授粉子房和幼胚为外植体, 所采用的材料也主要是华北密刺类型和欧洲温室类型黄瓜的常规种和自交系目前尚未见到以欧亚杂交类型黄瓜为材料通过未受精胚珠进行雌核发育诱导的研究报道针对上述问题, 本研究中以欧亚杂交类型黄瓜 65G 和华北密刺类型黄瓜 228 的 F 1 为材料, 通过未受精胚珠诱导雌核发育, 成功获得黄瓜单倍体植株这不仅奠定了黄瓜单倍体培养的研究基础, 拓宽了单倍体育种技术的应用范围, 更为杂交选育分子标记遗传图谱构建和基因定位提供了技术支撑 1 材料与方法 1.1 试验材料的诱导培养与植株再生采用的试验材料是以欧洲温室类型黄瓜 65G 为母本华北密刺类型黄瓜 228 为父本配制的 F 1 代, 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组提供试验于 2013 年 8 11 月和 2014 年 4 10 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所葫芦科育种室组培实验室进行选取开花前 1 ~ 2 d 的雌花, 流水清洗并去除子房表面的刺瘤, 先用 75% 乙醇消毒 30 s, 而后在 6.5% 的次氯酸钠溶液中消毒 15 min, 无菌水反复冲洗 4 ~ 5 次, 最后无菌滤纸吸干表面水分不对子房进行切割, 将完整子房接种在以 MS 培养基 (Murashige & Skoog,1962) 为基础添加 TDZ 的培养基上进行预培养, 其中蔗糖 30 g L -1 和植物凝胶 2.5 g L -1,pH 5.8 在添加 TDZ 的培养基上预培养 7 d 后, 取出完整子房并沿中心线纵切, 剥离胚珠和胎座组织接种在含有 KT 和 BA 的诱导培养基上, 培养条件为 (25 ± 2),LD 所有诱导培养基均添加 30 g L -1 蔗糖和 2.5 g L -1 植物凝胶,pH 为 5.6, 于高压灭菌锅中 121 灭菌 20 min 用 10 cm 培养皿分装培养基,Parafilm 石蜡膜封口, 每皿接种外植体 4 ~ 5 个胚诱导全过程对包括预培养培养基中的 TDZ 浓度预处理温度诱导培养基 ( 包括大量元素微量元素和有机物成份, 配方见表 1) 诱导培养基中的 KT 浓度和 BA 浓度在内的 5 个因素 ( 设一列空白作为误差项 ) 进行 6 因素 5 水平的 L25(5 6 ) 正交试验, 共 25 个处理 ( 表 2), 每个处理 3 次重复胚发生频率 (%)= 有胚状体发生的外植体数 / 外植体总数 100 试验数据采用 Excel 和 SAS 软件进行统计分析待胚状体分化出子叶和胚根后, 转入 MS 培养基 (30 g L -1 蔗糖和 2.5 g L -1 植物凝胶,pH 5.8) 中继续生长发育, 获得完整的再生植株

3 Wang Ye,Gu Xing-fang,Zhang Sheng-ping,Miao Han. Studies on haploid plant induction via in vitro unfertilized ovule culture of cucumber Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (11): 表 1 诱导培养基配方 Table 1 Concentration micro and macro elements including vitamins in medium for embryo induction mg L -1 成分培养基 Medium Component IM1 IM2 IM3 IM4 IM5 KNO CaCl 2 H 2 O MgSO 4 7H 2 O KH 2 PO (NH 3 ) 2 SO MnSO ZnSO H 3 BO KI FeSO 4 7H 2 O Na 2 EDTA 2H 2 O 肌醇 Inositol 维生素 B1 Vitamin B 维生素 B6 Vitamin B 烟酸 Nicotinic acid 甘氨酸 Glycine 再生植株倍性鉴定染色体计数法 : 取 2 ~ 3 mm 的再生植株幼嫩根尖, 经卡诺固定液处理过夜后, 切取根尖部分用卡宝染液染色, 覆上盖玻片, 然后用镊子轻轻敲片, 以便根尖组织散开, 即可在显微镜下观察选取染色体分散较好的体细胞进行拍照, 统计染色体数流式细胞仪测定法 : 取少量新鲜叶片, 置于冰浴的培养皿中, 加入细胞裂解液, 并用解剖刀将材料切碎将样品提取液通过微孔膜过滤而后离心到测试管中, 上样于流式细胞仪测定植株细胞 DNA 的相对含量 1.3 再生植株田间性状调查当果实长度达到正常商品瓜大小时, 测量从瓜蒂至瓜顶的长度, 测量距离瓜顶约 1/3 瓜长处的横径当植株长到 25 节后, 调查主蔓上每一个节位的花性, 计算有雌花发生的节位占总节位数的比例, 即雌花率 2 结果与分析 2.1 黄瓜离体胚珠雌核发育的形态学观察及再生植株的获得完整的黄瓜子房 ( 图 1,a) 经过 7 d 的预培养, 形态上没有明显变化, 但颜色由绿色转为黄色 ( 图 1,b) 子房纵切后剥离胚珠接种在添加 KT 和 BA 的诱导培养基中, 此时的胚珠为球形乳白色 ( 图 1,c) 培养约 1 周后便可观察到浅绿色胚珠上出现突起 ( 图 1,d) 经过约 20 d 的诱导培养, 球形胚发育为心形胚 ( 图 1,e) 40 ~ 45 d 后即可获得较完整的幼胚 ( 图 1,f), 并逐步发育出子叶和胚根 ( 图 1,g) 将幼胚转移到 MS 培养基中继续生长, 可形成正常的叶片和根系 ( 图 1,h) 再生植株在 7 d 左右的短期驯化后移植田间 ( 图 1,i)

王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗. 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报,2015,42 (11):2174 2182.

1 The development of unfertilized ovule via in vitro gynogenesis and plant regeneration a:pre-culture of unfertilized ovaries;b:the unfertilized ovaries after 7 d pre-culture; c:the detached

regeneration plans were transplanted to the field. 2.

4 王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗. 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报,2015,42 (11): 图 1 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生 a: 未受精子房的预培养 ;b: 培养 7 d 后的未受精子房 ;c: 剥离的胚珠 ;d: 胚珠上形成突起, 发育为球形胚 ;e: 心形胚 ; f: 幼胚 ;g: 发育出子叶和胚根的胚 ;h: 单倍体再生植株 ;i: 移植田间 Fig. 1 The development of unfertilized ovule via in vitro gynogenesis and plant regeneration a:pre-culture of unfertilized ovaries;b:the unfertilized ovaries after 7 d pre-culture; c:the detached ovules;d:the protuberance on ovule developed into a globular embryoid;e:the heart stage of embryo; f:the immature embryo;g:the embryo with cotyledon and radical;h:the regenerated plant; i:the regeneration plans were transplanted to the field. 2.2 不同处理因素对黄瓜未受精胚珠诱导胚状体的影响将胚珠接种于诱导培养基中 60 d 后, 胚的诱导和分化基本完成此时调查正交试验各组处理有胚状体发生的子房数, 统计胚诱导率 ( 表 2) 利用 Excel 软件对未受精胚珠的胚发生频率数据进行直观分析,TDZ 预处理温度诱导培养基 KT 和 BA 等 5 因素的极差 (R) 分别为和 3.26( 表 2), 可以直观地看出 5 因素对胚发生的诱导效应表现为 TDZ > KT > 诱导培养基 > 预处理温度 > BA 根据直观分析结果, 可初步选择有利于提高胚发生频率的因素水平搭配为处理 6, 即首先利用 TDZ 浓度为 0.02 mg L -1 预培养培养基进行初步诱导, 同时 4 低温预处理, 而后将未受精胚珠接种在 IM2 诱导培养基上, 培养基中添加 0.75 mg L -1 的 KT 和 2.0 mg L -1 的 BA 通过 SAS 软件对胚诱导率数据进行方差分析结果表明,TDZ 浓度对胚发生率的影响达到极显著水平, 是胚状体发生的最主要影响因素 ; 诱导培养基和 KT 浓度达到显著水平, 而预处理温度和

5 Wang Ye,Gu Xing-fang,Zhang Sheng-ping,Miao Han. Studies on haploid plant induction via in vitro unfertilized ovule culture of cucumber Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (11): BA 浓度对胚发生影响不显著 ( 表 2) 处理编号 Code Table 2 预处理温度 / Pretreatment 表 2 不同处理因素对黄瓜未受精胚珠诱导胚状体的影响 Effect of different medium and plant growth regulators on embryo induction 诱导培养基 Induction 接种子房数 Number of 产生胚的子房数 Number of 诱导率 /% Frequency of TDZ/ (mg L -1 ) temperature medium KT/ (mg L -1 ) BA/ (mg L -1 ) ovaries embryo induced embryo induction IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM IM R F ** * * 注 :R 为极差 F 即 F 值, 表示样本均数差别的显著性 * ** 分别表示达到 5% 1% 水平显著性差异 Note:R indicates the difference the maximum and minimum values of X value. F indicates the significance of the difference between the sample mean. *,** represent significant at the 0.05,0.01 probability levels. 2.3 预培养 TDZ 浓度对胚状体发生的影响直观分析和方差分析均证明预培养培养基中的 TDZ 浓度是影响黄瓜雌核发育的最主要因素利用邓肯氏新复极差法对 TDZ 浓度的 5 个水平进行多重比较 ( 表 3), 含有 0.02 mg L -1 TDZ 的诱导培养基中, 胚状体的诱导率较其他浓度有极显著提高,0.05 和 0.10 mg L -1 TDZ 的诱导效果较其有极显著下降 0.50 mg L -1 TDZ 诱导率最低, 与不添加 TDZ 的处理间无差异表 3 TDZ 浓度 5 水平的邓肯氏新复极差法多重比较 Table 3 Duncan s multiple range analysis for concentration of TDZ TDZ/(mg L -1 ) 诱导率 /% Frequency of embryo induction cc aa bb bb cbc 注 : 小写字母表示 P < 0.05 水平, 大写字母表示 P < 0.01 水平, 不同字母代表显著差异下同 Note:Small letters and capital letters in the same line mean significant difference at 0.05 and 0.01 level tested by Duncan s multiple range analysis respectively, significant differences treatments are indicated by different letter. The same below.

王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗. 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报,2015,42 (11):2174 2182. 2179 2.

6 王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗. 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报,2015,42 (11): 诱导培养基中无机氮形式及含量对胚状体发生的影响对 5 个诱导培养基的试验数据进行邓肯氏新复极差法分析 ( 表 4), 诱导培养基 IM3 和 IM4 的胚发生率最高, 两个培养基中的硝态氮 (NO - 3 ) 和铵态氮 (NH + 4 ) 的含量分别为 600 mg L mg L -1 和 300 mg L mg L -1, 接近 1 1 IM2 和 IM5 中硝态氮和铵态氮的含量比例增大到 4 1 和 5 1,IM2 的胚发生率较 IM3 和 IM4 有降低, 但未达显著水平, 而 IM5 则出现了显著降低 IM1 中硝态氮和铵态氮比例达到 7.5 1, 则诱导率最低表 4 培养基成分 5 水平的邓肯氏新复极差法多重比较 Table 4 Duncan s multiple range analysis for induction medium 诱导培养基 Induction medium IM1 IM2 IM3 IM4 IM5 诱导率 /% Frequency of embryo induction 9.50 cb aba aa aa bab 2.5 诱导培养基 KT 浓度对胚状体发生的影响对诱导培养基中 KT 浓度的试验数据进行邓肯氏新复极差法分析后发现 ( 表 5),KT 为 0.50 mg L mg L -1 和 1.0 mg L -1 时胚诱导率没有显著变化, 但 KT 浓度升高到 2.0 mg L -1 时胚诱导频率反而会显著下降, 而 KT 浓度降低为 0 mg L -1 时则诱导频率会出现极显著下降表 5 TDZ 浓度 5 水平的邓肯氏新复极差法多重比较 Table 5 Duncan s multiple range analysis for concentration of TDZ 诱导率 /% KT/(mg L -1 ) Frequency of embryo induction cb aba aa aa bab 2.6 再生植株倍性鉴定将幼胚转移到 MS 培养基上可诱导生根, 生根率均达 100% 以正常二倍体(2n = 14) 黄瓜为对照, 对再生植株进行根尖细胞染色体数分析, 发现了体细胞含有 7 条染色体的单倍体植株 ( 图 2) 同时以正常黄瓜二倍体植株叶片为对照, 利用流式细胞仪进行倍性鉴定, 结果发现, 二倍体对照的分离峰出现在相对荧光强度约 220 时 ( 图 3,a), 由此推断分离峰出现在相对荧光强度为 110 的为单倍体 ( 图 3,b) 获得的 236 株再生植株中单倍体率为 18.2% 图 2 黄瓜单倍体和二倍体植株的根尖细胞染色体倍性鉴定 Fig. 2 The chromosomes in root tip cells of a diploid plant and a haploid plant from 65G 228

7 Wang Ye,Gu Xing-fang,Zhang Sheng-ping,Miao Han. Studies on haploid plant induction via in vitro unfertilized ovule culture of cucumber Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (11): 图 3 黄瓜单倍体和二倍体植株 DNA 含量分布图 a: 二倍体 ;b: 单倍体 Fig. 3 The DNA distribution of a diploid plant and a haploid plant from 65G 228 a:diploid;b:haploid. 2.7 再生植株群体的田间性状调查对再生植株群体进行田间调查 ( 表 6), 瓜长和雌花率在两个亲本之间差异显著,F 1 在瓜长和瓜横径上均介于亲本之间, 而花性上与母本同为雌性系 3 个性状在再生植株群体中均表现出连续分布和广泛的变异, 尤其是雌花率的变异幅度为 0 ~ 瓜横径和雌花率的偏度大于 0, 表明两个性状的调查数据中大于均值的数据更为分散瓜横径的峰度也大于 0, 说明数据分布较标准正态分布更陡峭 Table 6 表 6 黄瓜 65G 228 F 1 和再生植株群体的瓜长瓜粗雌花率的遗传参数 Fruit and pistillate flower associated trait of 65G,228 and F 1,and genetic parameters of regeneration plant population 性状亲本 Parents 再生植株群体 Regeneration plant population F 1 Trait 65G 228 平均值 Mean 范围 Range 标准误 Stedv. 偏度 Skewness 峰度 Kurtosis 瓜长 /cm Fruit length ~ 瓜横径 /cm Fruit diameter 雌花率 /% Female flower proportion ~ ~ 讨论 3.1 黄瓜胚珠离体培养诱导单倍体发生目前主要通过未授粉子房培养和辐射花粉授粉诱导黄瓜单倍体的发生, 取得了较好结果, 但再生频率仍然较低, 且在人工诱导过程中易出现由子房壁组织引起的发育障碍本研究中以胚珠为诱导对象, 但在剥离前先对整个子房进行预培养, 使胚珠由活体状态缓和过渡到半离体状态, 同时利用 TDZ 诱导雌核离体发育, 而后再从子房中剥离胚珠, 彻底转为离体培养可见, 先启动雌核发育机制而后进行剥离, 是黄瓜未受精胚珠单倍体诱导的关键环节剥离后的胚珠虽然处于裸露状态, 对培养条件也更严格, 却可以更直接地接触到培养基中的营养成分和激素, 进而获得更高的胚诱导

8 王烨, 顾兴芳, 张圣平, 苗晗. 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报,2015,42 (11): 频率, 因此胚珠离体培养对于黄瓜而言是一种更为高效的单倍体诱导途径 3.2 培养基是诱导黄瓜胚珠单倍体发生的重要影响因素本试验中对基本培养基成分进行改良时发现, 硝态氮 (NO - 3 ) 和铵态氮 (NH + 4 ) 含量较接近的 IM3 和 IM4 诱导培养基中未受精胚珠的胚发生率较高, 随着硝态氮 (NO - 3 ) 和铵态氮 (NH + 4 ) 浓度差逐步增大, 胚发生率呈现下降趋势, 说明无机氮的存在形式浓度和比例在黄瓜雌核诱导过程中发挥着重要的调节作用, 目前尚未见到这一现象的其它研究报道 3.3 单倍体培养再生植株的自然加倍以往的研究发现, 通过单倍体培养获得的再生植株多是一个由单倍体二倍体及多倍体构成的混杂群体, 且非单倍体率在不同作物以及不同基因型间存在显著差异 Zhang 和 Takahata(2001) 报道了 45 个大白菜基因型的小孢子再生植物的自然加倍情况, 其中 95% 的基因型自然加倍率超过 50% Chatelet 等 (1999) 在花椰菜的小孢子培养研究中发现 27 个基因型的自发二倍体率均在 55% 以上李金荣等 (2011) 利用胡萝卜材料 80Q54 进行游离小孢子培养, 再生植株的二倍体率为 63.6%, 而材料则仅有 17.5% 染色体自然加倍现象同样也发生在大孢子单倍体诱导研究中, 李伟 (2012) 通过西葫芦未受精子房离体培养获得再生植株, 其中二倍体植株占被检测植株的 60% 王璐等 (2008) 针对黄瓜未受精子房开展胚状体诱导, 获得的再生植株经细胞流式仪鉴定为二倍体而本研究中利用黄瓜胚珠进行离体培养, 再生植株的单倍体率仅为 18.2% 由此可见, 植物单倍体培养中广泛存在着染色体自然加倍现象, 但其机理仍不明确 Keller 和 Armstrong(1981) 曾提出小孢子胚自然加倍与胚胎发生初始的核内有丝分裂相关, 而小麦的游离小孢子培养研究则证明再生植株的自然加倍率与外植体的预处理方式关系密切 (Indrianto et al.,1999) 在下一步研究工作中, 将结合胚珠发育的全过程细胞组织学研究和再生植株自交后代性状观察, 深入分析再生植株来源和染色体自然加倍现象 References Chatelet P,Gindreau K,Herve Y Development and use of microspore culture applied to vegetable Brassica oleracea breeding. Anther and Pollen:From Biology to Biotechnology, Chen Xiao-peng,Liu Shuan-tao,Sun Xiao-lei,Zhao Zhi-zhong,Wang Xiu-feng Primary study on embryoids induced from unpollinated ovaries of cucumber. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,14 (2): (in Chinese) 陈小鹏, 刘栓桃, 孙晓镭, 赵智中, 王秀峰黄瓜未受精子房的胚状体诱导研究初报. 西北农业学报,14 (2): Diao Wei-ping,Chen Jin-feng,Lei Chun,Song Hui,Zhang Xiao-qing Factors affecting embryo formation in unpollinated ovary culture of cucumber. Journal of Nanjing Agricultural University,31 (1): (in Chinese) 刁卫平, 陈劲枫, 雷春, 宋慧, 张晓青影响黄瓜未授粉子房培养胚发生因素的研究. 南京农业大学学报,31 (1): Du Sheng-li Study on the creation of new methods of cucumber breeding material by biotechnology. Tianjin Agricultural Sciences,(2):627. (in Chinese) 杜胜利利用生物技术创造黄瓜育种新材料方法研究. 天津科技,(2):627. Du Sheng-li,Han Yi-ke,Cong Ying,Wei Ai-min,Hou Feng,Chen Qi-min Histological and early biochemical aspects in cucumber in vitro gynogenesis. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nakaiensis:Natural Science Edition,36 (2): (in Chinese) 杜胜利, 韩毅科, 丛颖, 魏爱民, 侯锋, 陈启民黄瓜离体雌核发育的过程及其早期生化变化研究. 南开大学学报 : 自然科学版,36 (2): Gémes-Juhasz A,Balogh P,Ferenczy A,Kristóf Z Effect of optimal stage of female gametophyte and heart treatment on in vitro gynogenesis

9 Wang Ye,Gu Xing-fang,Zhang Sheng-ping,Miao Han. Studies on haploid plant induction via in vitro unfertilized ovule culture of cucumber Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (11): induction in cucumber(cucumis sativus L.). Plant Cell Reports,21 (2): Indrianto A,Heberle-Bors E,Touraev A Assessment of various stresses and carbohydrates for their effect on the induction of embryogenesis in isolated wheat microspore. Plant Science,143 (1): Keller W A,Armstrong K C Production of anther derived dihaploid plants in autotetraploid marrowstem kale(brassica oleracea var. acephala). Canadian Journal of Genetics and Cytology,23: Li Jin-rong,Ou Cheng-gang,Zhuang Fei-yun,Zhao Zhi-wei,Hu Hong,Mao Ji-hua Studies on the development of microspore in carrot isolated microspore culture. Acta Horticulturae Sinica,38 (8): (in Chinese) 李金荣, 欧承刚, 庄飞云, 赵志伟, 胡鸿, 毛笈华胡萝卜游离小孢子培养及其发育过程研究. 园艺学报,38 (8): Li J W,Si S W,Cheng J Y,Li J X,Liu J Q Thidiazuron and silver nitrate enhanced gynogenesis of unfertilized ovule cultures of Cucumis sativus. Biologia Plantarum,57 (1): Li Wei Study on the optimization of embryoids culture condition and plantlet formation in summer squash in vitro ovary culture techniques. [M. D. Dissertation]. Yangling:Northwest Agriculture and Forest University. (in Chinese) 李伟西葫芦未受精子房离体培养成胚条件优化与成苗技术研究 [ 硕士论文 ]. 杨凌 : 西北农林科技大学. Murashige T,Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant,15: Pei Xiao-li In vitro gynogenesis to induce haploid plants in cucumber and construction of genetic map with SSR markers in DH population[m. D. Dissertation]. Lanzhou:Gansu Agricultural University. (in Chinese) 裴晓利黄瓜离体雌核发育诱导单倍体及其 DH 群体 SSR 标记图谱构建 [ 硕士论文 ]. 兰州 : 甘肃农业大学.. Pei Xiao-li,Yang Ying,Li Sheng,Wang Jian-she Gynogenesis induction haploid of cucumber in vitro. Journal of Gansu Agricultural University,46 (6): (in Chinese) 裴晓利, 杨颖, 李胜, 王建设黄瓜离体雌核发育诱导单倍体的研究. 甘肃农业大学学报,46 (6): Savin F,Decomble V,Le Couviour M,Hallard J The X-ray detection of haploid embryos arisen in muskmelon Cucumis melo L. seeds,and resulting from a parthenogenetic development induced by irradiated pollen. Curcurbit Genet Crop Rep,11: Wang Lu,Chen Xiao-yan,Zhang Li,Chen Huai-meng,Ren Hua-zhong Effect of different factors on induction of embryoids in unfertilized ovaries of cucumber. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,17 (4): (in Chinese) 王璐, 陈小燕, 张力, 陈怀勐, 任华中不同因素对黄瓜未受精子房胚状体诱导的影响. 西北农业学报,17 (4): Wang Ye,Gu Xing-fang,Zhang Sheng-ping Study the effect of pretreatment and exogenous hormones on embryoids induced from unpollinated ovaries of cucumber. Acta Horticulturae Boreali-Sinica,23 (S1): (in Chinese) 王烨, 顾兴芳, 张圣平预处理和外源激素对黄瓜未授粉子房的胚状体诱导的影响. 华北农学报,23 ( 增刊 ): Wei Ai-min,Han Yi-ke,Du Sheng-li,Zhang Gui-hua,Liu Nan Effects of donor plant growing seasons and cultivation ways on cucumber unfertilized ovary culture in vitro. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,16 (5): (in Chinese) 魏爱民, 韩毅科, 杜胜利, 张桂华, 刘楠供体植株栽培季节和栽培方式对黄瓜未受精子房离体培养的影响. 西北农业学报, 16 (5): Zhang Feng-lan,Takahata Y Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops. Theoretical and Applied Genetics,103 (2):

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Microsoft Word - A201405-840_1401293463.doc 5 10 15 中国科技论文在线 # 台湾独蒜兰无菌萌发与植株再生研究卓孝康 1,2, 兰思仁 1,2, 彭东辉 1,2, 吴沙沙 1,2, 陈潇 1,2, 江鸣涛 1,2 1,2**, 张林瀛 (1. 福建农林大学园林学院, 福建福州 350002; 2. 福建农林大学海峡兰花保育