8 激光生物学报第 20 卷人参 (PanaxginsengG.A.Meyer) 是我国珍贵的传统中药, 应用于中医临床已有两千多年的历史, 具有广泛的药理作用和医疗用途人参的主要活性成分是人参皂苷, 其中, 原人参二醇类人参皂苷主要包括人参皂苷等, 其结构差异仅在于 C3 和 C20 位上的

Size: px

Start display at page:

Download "8 激光生物学报第 20 卷人参 (PanaxginsengG.A.Meyer) 是我国珍贵的传统中药, 应用于中医临床已有两千多年的历史, 具有广泛的药理作用和医疗用途人参的主要活性成分是人参皂苷, 其中, 原人参二醇类人参皂苷主要包括人参皂苷等, 其结构差异仅在于 C3 和 C20 位上的"

家柴
5 years ago
Views:

1 第 20 卷第 1 期 2011 年 2 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.20No.1 Feb.2011 doi: /j.isn HPLC 法同时测定人参皂苷李东霄, 常景玲, 梁刚, 李水水 ( 河南科技学院生命科技学院, 河南新乡 ) 摘要 : 目的 : 建立高效液相色谱法同时测定人参皂苷的方法方法 : 采用 ODS C 18 (4.6mm 150mm) 色谱柱, 流动相乙腈 0.05% 磷酸水, 梯度洗脱, 流速 1mL/min, 检测波长 203nm, 柱温 35 结果: 人参皂苷分离效果良好, 线性关系良好, 相对标准偏差和回收率符合 2010 年版中华人民共和国药典要求结论 : 本方法简便准确稳定重现性好, 可用于上述人参皂苷的含量测定关键词 : 高效液相色谱法 ; 人参皂苷 ; 人参皂苷 Rc; 人参皂苷 Rd; 人参皂苷 ; 人参皂苷 CK; 人参皂苷 Rh 2 中图分类号 :Q815 文献标识码 :A 文章编号 : (2011) QualitativeandQuantitativeAnalysisofGinsenoside,Rc,Rd,, CK andrh 2 SimultaneouslybyHPLC LIDong xiao,changjing ling,lianggang,lishui shui (HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,Henan,China) Abstract:Objective:Todeterminethecontentofginsenoside,Rc,Rd,,CK andrh 2 simultaneouslyby HPLC.Methods:ThesampleswereseparatedonanODSC 18 (4.6mm 150mm)columnusingacetonitrile 0.05% phosphoricacidsolutionasthemobilephase,withthegradientelutionataflowof1.0ml/minand35 columntem perature.thewavelengthofthedetectorwassetat203nm.results:agoodseparationefectcanbereachedforginsen oside,rc,rd,,ckandrh 2 whichshowedagoodlinearrelationshipbetweenthepeakareaandtheconcen trationofstandardsamples.therelativestandarddeviation(rsd)isgoodtomeetthestandardofpharmacopoeiaof PRC.Conclusion:Themethodissimple,accurate,withagoodreproducibility.Itcanbeappliedtoqualitativeand quantitativeanalysisofginsenoside,rc,rd,,ckandrh 2. Keywords:HPLC;ginsenoside ;ginsenosiderc;ginsenosiderd;ginsenoside ;ginsenosideck;ginsen osiderh 2 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 河南省科技厅重点科技攻关项目 ( ); 河南省教育厅自然科学研究计划项目 (2009B180006) 作者简介 : 李东霄 (1968 ), 男, 副教授, 博士, 主要从事生物技术与生物活性物质研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )dongxiao93@hotmail.com 通讯作者 : 常景玲 (1963 ), 女, 河南新乡人, 教授, 主要从事生物制药与生物活性物质研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )changjingling@hist.edu.cn

2 8 激光生物学报第 20 卷人参 (PanaxginsengG.A.Meyer) 是我国珍贵的传统中药, 应用于中医临床已有两千多年的历史, 具有广泛的药理作用和医疗用途人参的主要活性成分是人参皂苷, 其中, 原人参二醇类人参皂苷主要包括人参皂苷等, 其结构差异仅在于 C3 和 C20 位上的糖基侧链不同, 糖链部分不同的糖基数目显示出不同的抗癌等药理活性其中糖基较少的的抗癌活性最强, 且副作用较小其中 Rd 只有在野山参和红参中才拥有, 且含量极低, 而 CK 不是人参中天然存在的化合物, 必须经过生物体转化才能得到 [1 2] 因此, 稀有皂苷成为国内外主要研究开发对象研究者常通过酶法或微生物转化法将较高含量的多糖基人参皂苷水解以获得低糖基的稀有皂苷目前酶的筛选主要是寻求获得用于代谢转化原人参二醇类皂苷的人参皂苷糖苷酶, 寻求转化的产物主要是 Rd 将人参皂苷转化为 Rd, 将人参皂苷转化生成 Rh 2, 将 Rc 转化生成 Rd [3 6] 微生物转化法的实质也是通过微生物生长代谢过程中产生的酶实现对高含量人参皂苷的代谢转化在实际应用和研究中, 获得的酶多为混合物, 而且, 同一种酶也可能代谢转化不同的皂苷底物因而, 找到一种可以同时检测上述各主要皂苷成分的方法对研究其代谢转化规律尤为重要人参皂苷的检测分析方法较多, 主要有分光光度法比色法薄层扫描法高效液相色谱法 (HPLC) 气相色谱等其中 HPLC 法具有分析速度快分离效率高灵敏度高和操作自动化程度高等特点, 在人参皂苷的分析中得到广泛应用 [1,7 9] 如: 王 [10 11] 旭等采用 C 18 柱, 流动相为乙腈 0.05% 磷酸溶 [12] 液, 测定了人参皂苷 Rg 1 和 Re 的含量 ; 邓晓文等采用依利特 ODSC 18 柱, 流动相为乙腈 0.1% 磷酸水, 同时测定了补肾壮阳胶囊中人参皂苷 Rg 1 Re 和 [13] 的含量 ; 刘桂艳等用 Shim packclc ODS 色谱柱, 乙腈 0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液恒流速洗脱, 测定了西洋参果浆中人参皂苷 Rb 2 Rc Rd Re [14] Rg 1 Rg 2 和 Rh 1 的含量 ; 黄新生采用 Nucleosil NH 2 色谱柱, 流动相为乙腈水, 测定人参茎叶浸膏和人参根中 6 种人参皂苷 Rb 2 Rc Rd Re Rg 1 的 [15] 含量 ; 此外, 还有汤明辉检测人参皂苷或 Rh 2 的研究报道在人参皂苷的含量测定中, 使用最多的色谱柱是十八烷基键合柱, 流动相常为甲醇水或乙腈水, 水中常含有 0.1% 的磷酸用来改善色谱峰的峰形及分离度然而, 在研究报道中还未见有相应的 HPLC 方法可以同时测定 CK 根据前期的实验结果, 本实验尝试一种在现有实验条件下可同时分离检测上述六种人参皂苷单体的色谱分离条件, 为相关研究和生产中准确定性定量分析上述皂苷间的转化情况, 提供数据支持 1 材料与方法 1.1 材料材料与试剂人参皂苷标准品 Rc Rd, 由成都曼斯特生物科技有限公司出产 ; 色谱柱 ODSC mm 150mm, 为日本岛津制备 ; 乙腈磷酸甲醇均为色谱级试剂主要仪器 LABCONCOWATERPROPS 纯水机 ( 美国 );LC 2010C 型高效液相色谱仪 ( 日本岛津 );BL610 型电子天平 ( 上海精天电子仪器有限公司 ); 高速台式离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ); 超声波发生器 1.2 方法溶液配制 95% 色谱级甲醇溶液的配制 : 取大于 99% 的色谱级甲醇 95mL 于容量瓶中, 用双蒸水定容至 100mL, 再经 0.45μm 纤维过滤膜过滤 0.05% 色谱级磷酸水溶液的配制 : 取 85% 的色谱级磷酸 58.8μL 于容量瓶中, 用双蒸水定容至 100mL, 再经 0.45μm 纤维过滤膜过滤标准品溶液的配制 : 精密称取各种人参皂苷标准品, 置于离心管中, 吸取适量 95% 的甲醇, 振荡使人参皂苷标准品完全溶解,8000r/min 离心 10min, 再经 0.45μm 有机系滤头过滤后装入液相样品瓶中配制后的 Rc Rd CK 母液的终浓度分别为和 1.29mg/mL 高效液相色谱分析条件色谱柱 ODSC mm 150mm, 检测波长为 203 nm, 进样量 10μL, 柱温 35, 流速 1mL/min, 流动相梯度如下 : 0 23min,100% 乙腈 (B) 0.05% 磷酸水 (D)= 32 68;23 80min,100% 乙腈 (B) 0.05% 磷酸水 (D)= 稳定性试验精密吸取混合 6 种人参皂苷的供试品溶液, 在 0,12,24,36,48h 分别进样 10μL, 对样品进行测定, 利用标准曲线求出混合样品中各个单品的浓度, 计算 Rsd 值精密度实验精密吸取含混合 6 种人参皂

3 第 1 期李东霄等 :HPLC 法同时测定人参皂苷 89 苷的供试品溶液, 连续 5 次进样分析, 利用标准曲线求出混合样品中各个单品的浓度, 计算 RSD 值重复性实验将配置好的样品液平均分成 5 份, 按同样的方法制备上样样品进行 HPLC 检测分析液相结果通过标准曲线分析定量, 求出混合样品中各个单品的浓度, 计算 RSD 值回收率试验在准确定量已知混合样品中各皂苷单体浓度的基础上, 加入已知浓度为 0.296mg/mL,Rc 为 0.198mg/mL,Rd 为 0.352mg/mL, 为 0.222mg/mL,CK 为 0.32 mg/ml,rh 2 为 0.37mg/mL 的标准混合样品, 并在同一条件连续进样 3 次, 根据标准曲线计算出浓度值, 算出回收率 2 结果与分析图 3 人参皂苷 Rd 标准品色谱图 Fig.3 ChromatogramofstandardginsenosideRd 2.1 人参皂苷的定性分析按照上述高效液相色谱分析条件经高效液相色谱仪分别定性分析人参皂苷标准品 Rc Rd, 确定其出峰时间结果见图 1 6 图 4 人参皂苷标准品色谱图 Fig.4 Chromatogramofstandardginsenoside 图 1 人参皂苷标准品色谱图 Fig.1 Chromatogramofstandardginsenoside 图 5 人参皂苷 CK 标准品色谱图 Fig.5 ChromatogramofstandardginsenosideCK 图 2 人参皂苷 Rc 标准品色谱图 Fig.2 ChromatogramofstandardginsenosideRc 结果显示, 出峰时间分别在 5.201~ ~ ~ ~ ~ 和 ~87.258min

4 90 激光生物学报第 20 卷图 6 人参皂苷 Rh 2 标准品色谱图 Fig.6 ChromatogramofstandardginsenosideRh 2 在该液相条件下, 将上述六种人参皂苷标准品的混合溶液进行 HPLC 检测, 检测结果如图 7 结果显示, 在上述六种人参皂苷的混合样中, 人参皂苷在该液相条件下出峰时间分别在 5.235~ ~ ~ ~ ~ 和 ~87.229min 之间此结果和各单品检测时所获得的出峰时间具有较好的对应关系, 因而, 该液相条件可以将上述六种人参皂苷单体很好地分离 2.2 人参皂苷的定量分析标准曲线的制作精确取适量 Rc Rd 标准品溶液, 混合后依次梯度稀释稀释后的浓度及 HPLC 检测色谱峰分别见表 1 和图 8 图 7 人参皂苷标准品混合样色谱图 Fig.7 Chromatogramofmixedstandardsamplesofginsenoside,Rc,Rd,,CKandRh 2 表 1 人参皂苷不同稀释浓度 Tab.1 Diferentdilutionconcentrationofsixginsenosides 序号 Level Rc Rd CK Rh 根据上述结果, 利用 LC Solution 软件以测得的人参皂苷峰面积 (Area) 为横坐标 X, 浓度 (Conc) 为纵坐标 Y, 进行回归处理, 得上述皂苷的回归方程 :Y = e 007X, 相关系数 r= ; Rc:Y= e 007X, 相关系数 r= ; Rd:Y= e 007X, 相关系数 r= ; :Y= e 007X, 相关系数 r= ; CK:Y= e 007X, 相关系数 r= ; Rh 2 :Y= e 007X, 相关系数 r= 结果表明上述皂苷在相关范围内具有良好的线性关系利用 LC Solution 软件制得上述六种人参皂苷的标准曲线, 见图稳定性试验精密吸取一定量同一标准品供试溶液, 分别于配制后 h 进样,HPLC 同时检测人参皂苷, 利用制成的标准曲线计算出样品中各标品的浓度, 结果见表 2

5 第 1 期李东霄等 :HPLC 法同时测定人参皂苷 91 图 8 人参皂苷不同稀释浓度的色谱图 Fig.8 Chromatogramofdiferentdilutionconcentrationofsixginsenosides 图 9 人参皂苷标准曲线 Fig.9 Thestandardcurvesofginsenoside,Rc,Rd,,CKandRh 2 表 2 稳定性实验结果 Tab.2 Theresultsofstabilityexperiment 时间 ( 小时 ) Time(hour) Rc Rd CK Rh

6 92 激光生物学报第 20 卷由表 2 结果计算出各个单体在该条件下的 RSD 值分别是 : 为 0.54% Rd 为 1.47% 为 1.53% Rh 2 为 1.13% Rc 为 6.72% CK 为 2.70% 精密度试验精确配制一定浓度的人参皂苷标准品溶液, 重复进样 5 次, 进行 HPLC 检测, 利用制成的标准曲线计算出样品中各标品的浓度, 结果见表 3 表 3 精密度实验结果 Tab.3 Theresultsofprecisionoftestmethod 重复次数 Num.ofrepetition Rc Rd CK Rh 由表 3 结果计算出各个单体在该条件下的 RSD 值分别是 : 为 1.65% Rc 为 1.92% Rd 为 1.69% 为 4.14 % Rh 2 为 3.33 % CK 为 0.86% 重复性试验将配置好的样品液平均分成 5 份, 编号 1 5, 按供试品溶液的制备方法制备测定, 进行 HPLC 检测分析利用制成的标准曲线计算出样品中各标品的浓度, 结果见表 4 由表 4 结果可以计算出各个单体在该条件下的 RSD 值分别是 : 为 0.73% Rc 为 0.68% Rd 为 1.21% 为 2.50% Rh 2 为 1.31% CK 为 1.03% 回收率试验精密称取一定量的人参皂苷标准品加入到已知浓度的混合样品中, 制备成样品液, 连续进样 3 次进行 HPLC 检测, 利用制成的标准曲线计算出样品中各标品的浓度大小, 结果见表 5 表 4 重复性实验结果 Tab.4 Theresultsofrepetitiveexperiments 重复次数 Num.ofrepetition Rc Rd CK Rh 表 5 回收率实验结果 Tab.5 Theresultsofrecoveryexperiment 样品 Samples Rc Rd CK Rh 2 原始量 Initialamout 加入量 Additionamout 总量 Totalamout 测定值 Measuredvalves

7 第 1 期李东霄等 :HPLC 法同时测定人参皂苷 93 由表 5 结果可以计算出在该条件下的平均回收率分别是 : 为 100.1%,Rc 为 99.35%,Rd 为 99.30%, 为 %,CK 为 98.54%,Rh 2 为 % 3 结论本实验采用高效液相色谱分析检测人参皂苷, 通过对以往色谱条件的优化, 得出一种梯度洗脱的方法, 在该液相色谱分析条件下制得的标准曲线结果显示, 在相应范围内, 人参皂苷的标准曲线均具有良好的线性关系同时, 根据标准曲线测定已知浓度的单体, 重复进样 5 次的相对标准偏差均符合要求, 本实验方法能很好的分离检测人参皂苷 Rc Rd, 色谱峰对称性良好, 分离效果良好, 与其他组分可达到基线分离, 相对标准偏差和回收率符合 2010 年版中华人民共和国药典要求为人参皂苷的检测和转化的研究以及实际应用奠定了基础 References [1] 张萍, 张南平, 肖新月, 等. 人参皂苷类成分的化学分析 [J]. 药物分析杂志,2004,24(3): ZHANGPing,ZHANGNan ping,xiaoxin yue,etal.chemi calanalysisofsaponinsinpanaxginseng[j].chinesejournal ofpharmaceuticalanalysis,2004,24(3): [2] 徐萌萌, 王建芳, 徐春. 微生物转化苷类中药机理及应用 [J]. 世界科学技术中药现代化,2006,8(2): XUMeng meng,wangjian fang,xuchun.microbialtrans formationofglycosidesintraditionalchinesemedicine:mecha nismandapplication[j].worldscienceandtechnology Mod ernizationoftraditionalchinesemedicineandmateriamedica, 2006,8(2): [3] 马吉胜, 周秋丽, 费晓方, 等. 真菌对人参皂苷及人参二醇系皂苷的代谢作用 [J]. 药学学报,2001,36(8): MAJi sheng,zhouqiu li,feixiao fang,etal.metabolism ofginsenoside andpanaxadiolsaponinsbyfungi[j].acta PharmaceuticaSinica,2001,36(8): [4] 李梁, 卢明春, 鱼红闪, 等. 从一种新筛选的菌中找出人参皂苷酶 [J]. 大连工业学院学报,2003,22(3): LILiang,LUMing chun,yuhong shan,etal.ginsenosidase EnzymeFoundfrom anewlyscreenedstrain[j].journalof DalianInstituteofLightIndustry,2003,22(3): [5] 刘欣, 崔昱, 杨凌, 等. 蜗牛酶中一种人参皂苷水解酶的分离纯化 [J]. 生物工程学报,2005,21(6): LIUXin,CUIYu,YANGLing,etal.PurificationofaGinsen oside HydrolasefromHelixSnailase[J].ChineseJournalof Biotechnology,2005,21(6): [6] 于小溪, 姜晓野, 王岩, 等. 把人参二醇类皂苷转化为的特种人参皂苷糖苷酶生成的细菌筛选 [J]. 大连工业大学学报,2008,27(2): YUXiao xi,jiangxiao ye,wangyan,etal.ginsenosidase TransformatingProtopanaxadiolTypeSaponintoGisenosideby DiferentBacteria[J].JournalofDalianPolytechnicUniversity, 2008,27(2): [7] 王铁生. 中国人参 [M]. 沈阳 : 辽宁科学技术出版社,2001: WANGTie sheng.chineseginseng[m].shenyang:liaoning ScienceandTechnologyPublishingHouse,2001: [8] 云南省植物研究所. 人参属植物的三萜成分和分类系统地理分布的关系 [J]. 植物分类学报,1975,13: YunnanInstituteofBotany.RelationshipbetweenTriterpenoid ConstituentsofPanaxSpeciesandClasification,System,Geo graphicaldistribution[j].journalofsystematicsandevolution, 1975,13: [9] 刘军, 王燕桓, 傅承光. 高效液相色谱法分析人参皂苷 [J]. 药物分析杂志,1998,18(2): LIUJun,WANGYan huan,fucheng guang.analysisofcom ponentsofginsenosidesbyhplc[j].chinesejournalofphar maceuticalanalysis,1998,18(2): [10] 王旭, 周富荣.HPLC 法测定西洋参中人参皂甙的含量 [J]. 中国中药杂志,1999,24(4): WANGXu,ZHOUFu rong.determinationofginsenoside inamericanginsengbyhplc[j].chinajournalofchinese MateriaMedica,1999,24(4): [11] 梁宁, 赵怀清, 周迎春, 等.HPLC 法同时测定三七总皂苷中人参皂苷 Rg 1 与的含量 [J]. 中草药,2002,33 (8): LIANGNing,ZHAOHuai qing,zhouying chun,etal.de terminationofginsenosiderg 1 and intotalsaponinsofpa naxnotoginsengbyhplc[j].chinesetraditionalandherbal Drugs,2002,33(8): [12] 邓晓文, 王淑美, 冯素香, 等. 补肾壮阳胶囊人参皂苷的含量测定 [J]. 河南中医学院学报,2007,22(2): DENG Xiao wen,wang Shu mei,feng Su xiang,etal. ContentDeterminationforGinsenosideofInvigoratetheKidney YangCapsule[J].JournalofHenanUniversityofChinese Medicine,2007,22(2): [13] 刘桂艳, 刘墨祥, 于连贵, 等.HPLC 法测定西洋参果浆及其发酵液中人参皂苷 Rh 2 的含量 [J]. 吉林农业大学学报,2001,3(1): LIUGui yan,liumo xiang,yulian gui,etal.determina tionofginsenoside andrh 2 inthemashedfruitandits FermentedSolutionofAmericanGinsengbyRP HPLC[J]. JournalofJilinAgriculturalUniversity,2001,23(1): [14] 黄新生. 高效液相色谱法测定人参茎叶浸膏及人参根中的人参皂苷含量 [J]. 中国中药杂志,2001,26(3): HUANGXin sheng.quantitativedeterminationofginsenosides intheextractofstems,leavesandrootsofginsengbyhplc [J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica,2001,26(3): ( 下转第 107 页 )

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖