实验背景 铁 (iron, Fe) 是人体必需的微量元素 约 67.58% 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围 (2.5g) 分布于红细胞的 Hb 中, 另外骨髓和 Mb 中各存在 2.59% 和 4.15% 及许多酶分子中 健康人储备铁约为 0.5g~2g, 主要以铁蛋白 (

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1 实验六亚铁嗪显色法测定 血清铁和总铁结合力 天津医科大学医学检验学院 刘雪平

2 实验背景 铁 (iron, Fe) 是人体必需的微量元素 约 67.58% 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围 (2.5g) 分布于红细胞的 Hb 中, 另外骨髓和 Mb 中各存在 2.59% 和 4.15% 及许多酶分子中 健康人储备铁约为 0.5g~2g, 主要以铁蛋白 (ferritin,ferr) 的形式贮存在肝 脾和骨髓 人体对铁的吸收是有限度的, 而铁的排泄为主动调节过程, 铁的消耗是要靠长期贮存铁 无毒性铁和重利用铁 临床意义

3 实验背景 图 6-1 铁代谢平衡

4 实验背景 血清铁及 TIBC 的高低受铁的吸收 贮存和重利用等因素的影响, 因此不同疾病时可有相应的变化, 血清铁蛋白饱和度为估计人体的铁状态较好的指标, 亦可用于缺铁性贫血的鉴别诊断和治疗监测, 而铁蛋白是最好的参数 表 6 1 不同疾病时血清铁及总铁结合力变化 疾病 血清铁 总铁结合力 缺铁性贫 明显降低 增高 溶血性贫血 增高 降低或正常 再生障碍性贫血 增高 降低 巨幼细胞性贫血 增高 降低 铅中毒 增高 降低 红细胞增多症 降低或正常 增高 肾病综合征 降低 明显降低 肝炎 明显增高 增高 肝硬化 降低或正常 降低或正常 慢性感染性贫血 降低或正常 降低或正常 肿瘤性贫血 降低或正常 降低或正常 含铁血黄素沉着症 明显增高 正常

5 实验背景 血清铁的检测方法有 ( 微量无焰 常规火焰 ) 原子吸收光谱法 电量滴定法 化学比色法 原子吸收光谱法和电量滴定法设备复杂 费用昂贵且不适于常规半自动或全自动生化分析 血清 TIBC 表示血清中转铁蛋白利用铁的最大生理活性, 其高低与缺铁性贫血 急性肝炎等疾病的发生 发展密切相关 传统测定 TIBC 的方法多需采用碳酸镁 铁交换树脂 氧化铝或磁珠等吸附剂吸附多余的未结合铁, 经离心去除吸附剂后再显色测定 目前临床通过调节不同反应阶段的 ph 值及选用水溶性偶氮染料 铬天青 B 等显色剂, 实现全自动生化分析血清 TIBC

6 实验原理 血清中的铁与运铁蛋白结合成复合物. 在酸性介质中铁从复合物中解离出来, 被还原剂还原成二价铁, 再与亚铁嗪直接作用生成紫红色复合物, 与同样处理的铁标准液比较, 即可求得血清铁含量 图 6-2 亚铁嗪法检测血清铁的反应过程

7 实验原理 血清 TIBC 是指血清中运铁蛋白能与铁结合的总量 将过量铁标准液加到血清中, 使之与未带铁的运铁蛋白结合, 多余的铁被轻质碳酸镁粉吸附除去, 然后测定血清中总铁含量, 即为总铁结合力 图 6-3 运铁蛋白被饱和及剩余铁的清除过程

8 注意事项 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围临床意义 1. 使用水必须经过去离子处理 测定时不要使用玻璃器皿, 应用塑料制品, 一般不会有污染问题 2. 溶血标本对测定有影响, 应避免溶血 如果铁测定用原子吸收光谱法, 不能采用 EDTA 血浆, 其他抗凝剂不受影响 3. 标准液呈色可稳定 24 小时, 血清呈色反应在 30 分钟内保持稳定, 稳定期后呈色程度缓慢增加, 大约每小时吸光度值增加 血清铁还存在着日间变异 (26.6%) 一天中血清浓度变化超过 12.9%, 其峰值出现在午后 2 小时左右 室温 (20 0 C) 稳定 3 天,4 0 C~8 0 C 稳定 1 周

9 注意事项 5. 计算式中的 0.97 时体积校正值 (0.165/0.170) 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围临床意义 6. 所用试剂应为含铁量极微的高纯度分析试剂 7. 全自动生化分析血清 TIBC 时应严格控制各反应阶段的 ph, 以保证检测过程中铁的释放 结合 呈色反应准确进行 8. 影响亚铁嗪法检测铁准确度的可能因素 :1 反应混合液的 ph;2 高浓度的铁蛋白 ;3 高脂血症和高胆红质血症 ;4 蛋白质沉淀

10 实验准备 一 试剂 mol/L 甘氨酸 / 盐酸缓冲液 (ph2.8) 0.4mol/L 甘氨酸溶液 58ml,0.4mol/L 盐酸溶液 42ml 和 TritonX-100 3ml 混合后加入无水亚硫酸钠 800mg, 使溶解 2. 亚铁嗪显色剂称取亚铁嗪 [3 (2 吡啶基 ) 5,6 双 (4 苯磺酸 ) 1,2,4 嗪 ;ferrozine] 0.6g 溶于去离子水 100ml 中 mmol/L 铁标准储存液 精确称取优级纯硫酸高铁铵 [FeNH 4 (SO 4 ) 2 ) 12H 2 O] g, 置于 1L 容量瓶中, 加入去离子水约 50ml, 逐滴加入浓硫酸 5ml, 溶解后用去离子水定容至刻度, 混匀 置棕色瓶中可长期保存 umol/L 铁标准应用液 吸取铁标准贮存液 2ml, 加入去离子水约 50ml 及浓硫酸 0.5ml, 再用去离子水稀释至 100ml 刻度, 混匀 umol/L TIBC 铁标准液准确吸取铁标准贮存液 10ml, 加入去离子水约 50ml 及浓硫酸 0.5ml, 在用去离子水稀释至 100ml 刻度, 混匀 6. 轻质碳酸镁粉 二 器材 型分光光度计 低速离心机 恒温水浴箱等 2. 玻璃移液器 试管 离心管等

11 操作步骤 1. 血清铁测定取试管 3 支标明空白管 标准管和测定管, 按表 6 2 亚铁嗪比色法测定血清铁操作步骤 表 6 2 亚铁嗪比色法测定血清铁操作步骤 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围临床意义 加入物 (ml) 空白管 标准管 测定管 血清 0.45 铁标准应用液 0.45 去离子水 0.45 甘氨酸 盐酸缓冲液 混匀, 于 562nm 波长处, 以空白管调零, 读取测定管吸光度 ( 血清空白 ) 亚铁嗪显色剂 混匀, 放置室温 15min 或 37 0 C10min, 再次读取各管吸光度

12 操作步骤 亚铁嗪法检测血清铁过程

13 操作步骤 2. 血清 TIBC 测定在试管中加入血清 0.45ml,179umol/L TIBL 铁标准液 0.25ml 及去离子水 0.2ml, 充分混匀后, 放置室温 10min, 加入碳酸镁粉末 20mg, 在 10min 内振摇数次,3000rpm 离心 10min 取上清液 ( 代替血清 ) 与血清铁测定同样操作 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围临床意义 表 6 3 亚铁嗪比色法测定血清总铁结合力操作步骤 加入物 (ml) 空白管 标准管 测定管 上清液 umol/L 铁标准应用液 0.45 去离子水 0.45 甘氨酸 盐酸缓冲液 混匀, 于 562nm 波长处. 以空白管调零, 读取测定管吸光度 ( 血清空白 ) 亚铁嗪显色剂 混匀, 放置室温 15min 或 37 0 C10min, 再次读取各管吸光度

14 操作步骤 TIBC 检测血清预处理过程

15 结果计算 血清铁 ( mol/l ) 测定管吸光度 -( 血清空白光吸光度标准液吸光度 0.97) 35.8 实验背景 实验原理注意事项 血清总铁结合力 ( mol/l ) 测定管吸光度 -( 血清空白 管吸光标准液吸光度 度 0.97) 71.6 实验准备 操作步骤 结果计算 参考范围 由于两次测定吸光度时溶液体积不同, 故应将血 清空白吸光度乘以 0.97 校正 临床意义

16 参考范围 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围临床意义 血清铁成年男性 :11 μmol/l~30μmol/l(600~1700μg/l) 成年女性 :9 μmol/l~27μmol/l(500~1500μg/l) 血清总铁结合力成年男性 :50 μmol/l~77μmol/l(2800~4300μg/l) 成年女性 :54

17 参考范围 实验背景实验原理注意事项实验准备操作步骤结果计算参考范围临床意义

18 临床意义 1. 血清铁增高 (1) 红细胞破坏增多, 如溶血性贫血 (2) 红细胞再生或成熟障碍性疾病, 如再生障碍性贫血, 巨幼红细胞性贫血等 (3) 铁的利用率减低, 如铅中毒或维生素 B 6 缺乏引起的造血功能减退 (4) 贮存铁释放增加, 如急性肝细胞损害 坏死性肝炎等, 从受损的肝细胞释出贮存铁, 释出铁蛋白 (5) 铁的吸收率增加, 如血色素沉着症 含铁血黄素沉着症 反复输血治疗或肌肉注射铁剂引起急性中毒症等 2. 血清铁降低 (1) 机体摄取不足如营养不良 胃肠道病变 消化性溃疡 慢性腹泻等, 引起进量不足和吸收量不足, 导致缺铁性贫血, 血清铁可低于 8.9umol/L 以下 (2) 机体失铁增加如失血, 包括了大量和隐性失血, 特别是肾炎 肾结核 阴道出血 溃疡病等, 泌尿生殖道和胃肠道的出血

19 临床意义 (3) 体内铁的需要量增加又未及时补充 如妊娠, 婴儿生长期等也有血清铁减少的倾向 (4) 体内贮存铁释放减少, 如急性和慢性感染, 尿毒症 恶液质等均可引起单核巨噬细胞系统的铁释出减少 (5) 某些药物治疗, 如促肾上腺皮质激素或肾上腺皮质激素治疗时亦可引起血清铁减少 3. 血清总铁结合力增高 (1) 慢性缺铁, 如缺铁性贫血, 促使运铁蛋白的合成增加 (2) 单核巨噬细胞系统急性损害, 如肝细胞的坏死使得铁蛋白释出增加 4. 血清总铁结合力降低 (1) 运铁蛋白的丢失如肾病 尿毒症等 (2) 运铁蛋白的合成不足如遗传性运铁蛋白缺乏症 (3) 铁蛋白缺少见于肝硬化, 血色素沉着症等 5. 血清铁饱和度 ( 血清铁 /TIBC) 可用于缺铁性贫血的鉴别诊断和治疗监测 (1) 降低 : 伴有运铁蛋白水平升高, 见于缺铁性贫血 (2) 升高 : 伴有运铁蛋白正常或降低, 见于再生障碍性贫血

20 临床意义 6-5 铁代谢疾病特有的临床试验室结果 疾病 FERR TRF Fe Tfs 血液学检查 铁缺乏性贫血 n - Hb 缺少性巨细胞性贫血 铁分布性疾病 n - n - n - Hb 缺少性正性细胞性贫血 慢性疾病 FERR, 类似 Fe 过多 铁过多 溶血 n - n - n - 网织红细胞增多和出现溶血现象 无效红细胞生成 n - n - n - 有潜在原发病时, 血红细胞计数发现 网织红细胞减少 医源性铁过多 有潜在原发病或时, 血红细胞计数发 现网织红细胞减少 血红蛋白沉着症 出现继发性器官损伤症状

21 思考题 1. 阐述血清铁和总铁结合力测定的原理 2. 在血清铁和总铁结合力测定中不同的 ph 的作用? 参考料 [1] 朱汉民, 沈霞主编. 临床实验室诊断学, 上海科学技术出版社,2004. [2] 姜旭淦主编. 临床生物化学检验实验指导 ( 第 2 版 ), 中国医药科技出版社,2010.

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