十二一二 1 38 细胞生 各种适宜的条伴, 防止反应产物的扩散, 以保使用. 证达到 lt 实的 E 确定位 ( 四 ) 篝铁酸盐一锢 ( 鲁在亚挟酸铜 沉淀? 去 ( 二 ) 辛, 3 一二雪在基联苯膀 (D AB) 握示法 此法成功地用子过氧化物酶的定位研究 它为 GY'anham 和 Kal
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- 樟 柏
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1 : 细胞化学和细胞生化 ; 技术讲座 植物酶细胞化学的电子显微镜研究方法 陶在有机体生 ff 活动中的重要意义是众所 周知的 迄今, 已知酶的总数接近 1000 种, 其中约有 100 种可以在光学显微缸水半上, 通 过组织化学的定位刀法得到证实 自从电于显 微镜术用于细胞化学研究后, 使酶的定位研究 边入到一个情确的新阶段 近些年米, 这方面 的工作正活跃地广泛开展 现在, 已有近 40 种酶, 可以采用电于显微说术进行细胞化学的 亚显微结构应位 [1, 2, 3, 4] 本文是对植物酶的细 胞化学方法作一些简要的介绍 酶细胞化学的基本原理 酶的细胞化学是关于专一性酶在完整细胞 内固有部位的定位 一般是借助于在酶活性的 位置上, 形成一种不 j 在性的电子稠密的反应产 物, 从而口 J 在电子显微镜下豆接观察到它的 Æ 位 迄今所建立的显示方法可分为以下几类 : (-) 铅沉捷法 比法成功地应用于磷酸酶的定位 简令或 ( qi 国丰 l 学院植物研究所细胞 :;:;n Nai- McCully <1 960 Protoplasma 59:368-3'i3. [1 0J Spurr, A. R. (1969) J. Ultrastr. Res. 26: [l1j Sato, T. and M. Shamoto (973) 48: [1 2J 矶 Tarmke, H. E. and S. -L. J. Lee (1 976) Stain Technology 51: [13J L 巳 duce, E. 旺, Bcrnhard, W. (1967) J. Ultrastr. Res. 19: 圄 1-3 由版说明 乙二醇甲基丙烯醋黯薄切片 doo 和 Pratt(195 J) 在 Como ri (1 946) 组 91 化 学方法的基础上提出铅沉淀法, Wacnsêein 相 Me:sel(1957)[G] 在磷酸荫的组织化学研究 lþ, 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 证实了此陆的优越性, 于是该技术立县 ij 为 Novikoff 和他的同事们 (953)[6] 应用于电子 显微镜水平上的细跑化学研究 铅沉淀的基本原理是, 反应液中含有适合 的底物 ( 虫 11 磷酸内的及捕获剂硝酸铅, 底物 {J 二酶 活性的位置上被酶水解, 释放出无机磷酸盐, 它立即与捕获剂铅离子结合, 形成磷酸铅沉谊 物. 在电子显微镜下, 通过磷酸铅沉淀物的强 反差, 显示出定位的困相 需要注意的是, 的, 因此, 必须在释放后, 初始反应产物是可 j 在性 立即与捕获剂 如 Pb 2 +) 化合生成沉淀物, 否则, 就会发生扩散, 造成假豆豆位 最终产物的不 i 容性与反应派的 ph 值有关, 沉淀物运可能在脱水 包埋过程 中发生培 fú7(:. 因此, 在材料的培白反应阶段以 及脱水和包埋等一系列过程中, 均主导注意创造 1. 水稻成熟籽粒, ìlí 维管处 P= 有色细胞 (Pigment Strand Ce l1 s 沁人 = 糊粉 fæ 胞 (aleurone cells). vj:j't 黑染也 xl, OOO. 2. 水柏分柴节内的水质运输细胞 (T. lransf er cel1 s), X = 告状分子 PAS- 甲茫按蓝 -0 染色 x /1<.1'5 分柴节内的 统管束横叼面 S = iðj 皮部 ; X = 管状分子 {r 维宫 ' 束周围, 有许多吉淀粉粒的细胞 PAS- 甲苯胶蓝 染色 x 400 图 4-6 Spurr 民环氧树脂薄切片 1. 芹菜茎段外用体内的分生细胞 甲苯胶 ;;;'-0 染色 x 芹呆 ) 丘状休 甲苯胶监 -0 染色 x 芹菜离体细胞 碱性 M 红 - 亚甲 ldi 染包 x 400 杂志细杂志细胞生物学 细杂志
2 十二一二 1 38 细胞生 各种适宜的条伴, 防止反应产物的扩散, 以保使用. 证达到 lt 实的 E 确定位 ( 四 ) 篝铁酸盐一锢 ( 鲁在亚挟酸铜 沉淀? 去 ( 二 ) 辛, 3 一二雪在基联苯膀 (D AB) 握示法 此法成功地用子过氧化物酶的定位研究 它为 GY'anham 和 Kal'nOVS'( 丁.,' (1966) [7] 提出 其基本原理是 PAb 作为反应底物被酶氧化 后, 形成一种不溶性的口盲棋聚合物, 组织经销 酸固定后, 便在酶活性的位置上产生一种错化 的电子稠密的不济性沉捷物, 在电子显微镜下 1980 年 由于四瞠盐作为电子受体存在许多问题, 所以 Ogawa 等 [11] 提出用氨铁酸盐作电子受 体 在反应液中, 除昌铁酸盐外, 还包含电子 供体 ( 酶的生 ~W 底物 ) 和铜离子 ( 捕获剂 在酶 的催化作用下, 氨铁酸盐在支屈原成氨亚 tj( 酸 盐 该还原产物又立即与捕获剂铜离子结合, 形成氨亚铁酸铜 i 冗 i 定物 普 t 亚铁酸铜具有高度 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 很容易付到鉴刑 的变化如同示 : DAB 在 : 氧化 ;& 固定过和中 u-o 一 : 过 ULJU /1,,/ /,/ \\ -1" ~ " 一 \ 飞旷 / '\ι/'!~- UO \.-.11 飞,; f. DABì 容液见光迅速地变 ; 三, 因此, 液必须新配, 并在使用过程中避免光照 ( 王 ) 四睡盐 (l e i: razo l! um salt)!ui 示法 此 i 去用于脱氢酶的定 ( 立 在酶反应液中, 四哇盐被 mf~ 人工电子受体, 它被还原后产生 一种不 i 任性的红色甲 11\ 吕 j(fotn1aγ:ane), 具有唔 锹性, 组织经饿酸固定后, ijοi 饿阪肌削匹囚 l 饿化! 黑唱 f 已 " ηlβ: 江骂驳 it2: 介 V 衍 ( 不 { 吉性 i 川川川 íûtl 盯 ~ 元 q'j 饿的染色一一 电子反茬, 因 IÎlî 可在电子 ;IAi 棋院下识别 该方法的万 11~~ 改进之一, 是采用疏脂四略 作 ' 乏你 [101, 它在隅反应后形成的晴饿甲鹏是 不陆的, 层丘 tl U!. 较好, 囚 í ÍlI ik 何比较广泛的 川/ )dhv/飞反型 的不 j 容性, 它在脱水 包埋过理中都十分稳 定, 并表现出高度的电子不注明性, 甚至在染 色的情况下, 也能明显地鉴别 氨铁酸盐又易于 被许多带有自由 SH 基的底物所还原, 并且是 无毒的, 因此, 它被广泛地使用 其主要缺 点, 是渗入组织细胞中的速度比较慢 z 同时必 须在反应液中加入一种整合剂 ( 如酒石酸盐 ), 以阻止铜离子与反应液中其他成分形成沉注 物 ( 五 ) 偶氯撬料法 它是光学显微镜水平上酶的组织化学中普 遍采用的方法, 有很强的染色性 [3] 但在电 子显微镜下却不能产生高的电子密度, 得不 j1j 必需的反差, 因而受到限制 从以上方法可以明显地看出, 酶细胞化学 的根本原理和特征, 是形成一种不语性的 具 有高电子密度的反应产物 它的形成有两种情 况 : (a) 酶反应后的产物就是不溶性的, 如过 氧化物酶对 DAB 的氧化及脱氢酶对四哇盐的 还原 ; (b) 酶的初始反应产物是可 i 窑的, 必 须立即进行一次捕获反应才形成不溶性产物, 如磷酸酶的铅沉淀法和氧化还原酶的每铁酸盐 还原法 基本要求与关键性步骤 酶细胞化学的基本要求, 是在实际操作过 程中尽可能使酶的活性不受或少受崽响 ; 使酶 和酶的反应产物不发生扩散性位移 : 而且要尽 杂志细杂志细胞生物学 可能良好 J 也保持细胞的柏细结向 然而这些往 细杂志
3 υ结 2 卷第 4 期 细胞生 往是不易兼得的 关键性的步骤是材料的固定 以一般不进行初固定 和培育反应 ( 一 ) 材料的固定 " 固定, 在酶细胞化学中的主要作用是 : (a) 保持细胞的精细结掏 ; (h) 破除细胞膜 的半透性障碍, 增加试剂的渗透性 ; (c) 把酶 田庄在原米的位置上, 防止其扩散 所以, 在 培 fj 反应之前, 需要进行材料的初固定 然而 在实际工什 2 巾, 王若同时达纠 j 以上要求是困难 的, 往往是结的保存得越好, 酶的活性越低 因此, 在细胞化学工作中, 不能采用适宜于 形态学王作的一般的固定技术 为了达到固定 的效来, 需要注意以下几种因素 s (1) 固定剂的种类不同种类的固定剂对 细胞形态学和酶的活性有不同的效果, 酒精和 百四 IIj 可以相当良好地保存某些酶的活性, 但它 不能保持细胞形态学, 所以不能用于酶的定 位 饿酸 高垣酸拥及睦类一戊二醋 甲醒与 民始眩, 也产生相当良好的细胞形态学效应, 但对酶的活性有损害 饿酸和高撞酸饵会氧化 最白质, 使酶的洁性全部丧失, 因此也不能用 于初固定 甲酶对酶的失活作用比戊二酷和丙 蚓腥的小 玉米根细腥的氧化酶, 用 ) 戈二睦固 定坷, 酶 Jι1:1 全部被破坏 z 后, 尚保持足够的酶洁性 [IZ] 但是, 在甲腔国应 甲睦固定对核 武二磷酸略和芥于素酶的活性也无多大损窑, 但戊二睦则严茧损害这两种酶的活性 用戊二 眶租甲睦回应二磷酸腺试陶和过氧化物酶, 均 白色保持相当高的洁性问 (2) 固定剂的浓度与固定时间在形态学 工作中, 戊二睦 - 般采用 2-5%, 甲睦为 4-10% 在酶的细胞化学工作中, 为保持酶的活 性, 应该采用较低的战崖, 但浓度太低, 则结 梅保持不好, 晦也不能得到充分的固定而发生 扩歇 材抖的固立时间一般为 分钟 有 些屿, 如战战葡萄 JJ; 写啤和过氧化物酶, 在剧起 过程中很容易被吨化, 1 2:;1 此只能采用很短的固 立 IIJ II]j 泣的股 I 啤对国之刑 ['5)- 坡感, 所 (3) 罔定剂的杂质对峰活性的号响甲睦 中常含有甲醇, 它对酶具有很强的抑制作用, 所以最好在使用前, 用碱水解多聚甲醒来生产 新如甲醋 方法是, 在 65 'C 100 毫升蒸馆水中 溶解 40 克多聚甲醒, 然后滴入 40%NaOH, 再到溶议立成透明为止 戊二醒也含有不少杂质, 女 11 聚合物, 戊二 酸, 乙醇丰 11 磷酸盐等 竹 "ud Anderson(1967) [löj 用 蒸馆法和活性炭抽提法纯化戊二睦进行固定效 果的对比试验, 结果表明, 未经纯化的戌二睦 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 强烈抑制酶活性, 酶活性的保存显著提高 二 ) 培育反应 fj 甘经过茶馆纯化的戊二睦对 培自. 反应是酶细胞化学操作过程中的中心 环节, 必须注意以下一些方面 1 : (1) 反应浅的自己制在选择一种合适的自己 方后, 通常不宜对反应液的组成 { 乍很大的战 功. 因为个别成分的变功, 会破坏 i 容浓的平 衡状态, 引起沉淀, 并扰乱反应进程与效果 例如, A 丁 Pase 的反应掖中, PbZ+ 肖子与 ATP 能形成一种相当稳定的整合物, 比例关系为 1:1; 过量的游离铅离子会押制 ATPase 的活 性, 并促进 ATF 的非酶 / 扒解 ( 自然 7]( 解 ) 如 果 Pb Z + 对 ATP 的比率超过 2, 则 ATP 的自 然水解很强烈, 同时, 酶的活性受到严豆押 制, 若 Pb Z+ :A:TP 在 1 以下, 虽对酶的活性 有利, 但因游离铅 It~ 子的浓度过低, 不能立即 全部扑获酶解释放出来的无机磷酸盐, 以致发 生磷酸盐的扩散, 造成假定位 在飞 Nachstein 和 Meisc1 (1957) [5] 最初提出的反应 ; 在中, PbZ+ 浓度是 3.6mM, A'I 于是 O. 83mi\!1, Pb Z + : ATP 的比值大于七经 J acobsen 和 Jor,2,ensen(1969) [14] 等人的修改, 使游离铅离子 b Z +) i 农庭在 '111 左右, 这样, ATP 的自 然水解不严茧, 并能充分地捕获酶的反应产 物 因此, 对于合适的优良配立不要轻易变 动 当然, 为了适合某些特殊组织的市耍, 反 杂志细杂志细胞生物学 应成的全部成分而是可以川一口的 细杂志
4 40 细胞生 1980 年 所用的试剂应该是高质量的, 最好是保证 试剂旦少是分忻纯 因为试剂中含有的杂质 ( 女 [1 rr~ 金属 ) 会捕制酶的活性 在自己 ~jlj 过程中也 应防止其他杂饰的污染, 并防止溶液吸收 CO 2 而引起沉淀 若已形成沉淀, 则应在使用前过 拙 大多数反应掖应在使用前自己制, 不 J;!: 贮 存 (2) 反应浪的 ph 值酶的反应需要在一 定的 ph 下进行, 不同的酶有各自的适 : 旦 :ph 值, 例如, 酸性磷酸酶的适宜 ph 是 , 碱性磷酸酶是 , 三磷酸腺戒酶是 , 在实际工作中, 不仅应根据酶活性 所要求的 ph i 函, 而且还需要考虑 ph 对其他 因素, 特别是讨反应产物溶解性的影响, 例如 黄瓜子叶平呆酸盐合成酶洁性的适 ii ph { 直是 λ.3; 然而, ph 在 8 以上, 该酶的反应产物 是 i 吝解的 因此, 不用 8.3, 而是采用 叫 许多 71< 解鸥在水解过程中释放出酸, 为了 保证恒定的适直 PH 值, 反应浪必须选用具有 一定缓冲能力的缓冲浪 一般不能使用磷酸缓 冲浪, 因为许多金属离子 ( 如 Ca 2+, Pb 2 + 等 会使它形成沉淀 (3) 反应温度与时间材样一般在 37 0C 下进行 植物细胞的酶反应温度, 一般采用 30"C 左右 在较低温度下进行培 N 反应, 可以 获得更好的豆豆值放呆 温度对酶活性的彭响是 复杂的, 但可通过实验确定某一种酶的最适温 培育的适宜时间, 是根据酶的各个活性位 置上都产生能够良好鉴别的沉庭为标志 这种 适宜时间在不同晦 不同组织 甚至在不同细 胞之间都有差别 培育时间过长, 会增加扩散 的假像, 沉淀的定位细节也会变得模糊不清 但若培白时间过短, 酶活性弱的 J 也 ; 与则得不到 求址 为了获得满意的结果, 高 : 主 Zj 草行培宫时 间试验, 以选出适立的时间 ( 的反应浪的渗透酶细胞化学的主要问 题之一, 是反应试齐 11 不能很好地渗入组织细胞 内, 在许多情况 f, 苗常只有组织块的外国细 胞发生反应 HaIl 与 Sexton 在玉米根的酸 性磷酸酶的定位中观察到, 在培育 4 分钟后, 反应掖渗入组织块表面以下 60 微米, 2 小时 后进到 90 微米, 4 小时仅达 100 微米 14] 因 此, 必须精心地切取材料, {i 吏组织片尽可能的 小, 最好是 微米, 不宜超过 300 微 米 此外, 一些作者采取以 F 的克服办法 : ( a) 预培肖, 即在正式反应前, 将材料放入 没有底物的反应液中, 在 4 0 C 下预培自 分钟 ; (b) 在反应液中加入 5-10% 二甲亚 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 枫 (DMSO), 以增大渗透性 ; (c) 在反应过 程中适当地摇动反应液 (5) 对照为了鉴另 IJ 定位的真伪, 需要同 时进行对照反应 - 般采用以下几种对照 z (a) 反应液中不加底物 ; (b) 反应液中加入 酶的专一性抑制剂 ; (c) 将组织块放在固定剂 中加热以钝化酶活性 些酶崽佳的具体方法, 目前, 可以在电子显微镜下进付细胞化学 定位的酶近 40 种, 主要包括 7]( 解酶, 氧化还 原酶和转移酶 本文只重点介绍一些有代表性 的酶 Gomori (-) 酸性磷酸酶 (acid paosphatase) 酸性磷酸酶的细胞化学起佳, 基本上采用 的光学显微镜下的组织化学技术, 稍 作修改 主要问题是试剂渗入慢, 所以必须采 用很薄的组织片 此种方陆的基本操作程序如 下 : 片 (1) 制备材料切取小于 0.3 毫米的组织 (2) 初周定用 50mM 二甲肺酸的 (Nacacodylaée) 缓冲液 (ph7.2) 配制的 2.5% 戊 二醒和 4% 甲醒混合国立法 ( 或 3% 戊二睦固 定液 ), 在 4 0 C 或豆且 F 固立主 小时 (3) 沈涤用 ph7.2 的二甲肺酸的洗两 次, 再用 60mM Tris 一顺丁烯二酸缓 ìll~ (ph6.2) 洗 2 次, 共历时 8 小时以上, 彻底除 杂志细杂志细胞生物学 去固起剂. 细杂志 l 夜
5 第 2 ::0 第 4 用细胞生 41 小时 (4) 培育反应 阻击 '1 反应液 z 贮存液 用量最终浓度 毫升 ) (mm) 0.2 M T1'is 顺丁烯二酸 缓 ìrr 液, ph5.2 O.lM ß- 廿油磷酸纳 时硝酸铅 页蒸水 30 材料在以上反应液中, 于 22 0 C 下培育 2 对照反应 : (a) 反应液中不加 H 一甘油磷 酸的 (h) 反应液中加入 O.OlM 氟化纳 ( 的沈 f 条用二甲肺酸锅缓冲浪 (ph7.2) 洗 次, 历时 1 小时 (6) 罔定用二甲肺酸纳缓冲液 (ph7.2) 配制的 2% 饿酸固定液, 在 o oc-4 oc 下固定 2 小时或过夜 (7) 脱水 包埋没涤后, 按常规脱水 包 :!:ITl 超薄切片和电镜观寨 ( 二 三磷酸腺试酶 (ATPase) 由于 ATPase 对于有机体生命活动的能 量供应具有重要作用, 它与许多生理过程有密 切关系 因此, 对于 ATPase i 舌性的细胞化 学研究已做了大量的工作 [ 旬, 叫 其活性普遍 而稳定地分布于民膜上, 也广泛地分布于细胞 核 线粒体 高尔基体 质体 内质网和液泡 中 定位方洁的程序如下 : (1) 材料的初固定用二甲肺酸制缓冲液 (ph7. 引自己 í lj 'l 的 4% 甲醒和 2.5% 戊二醒固定 剂, 在室温或 o oc-4 OC 下固定 1-2 小时 (2) 洗涤固定后, 究用 ph7.2 的二甲 肿民主纳缓冲液洗 2 次, 烯二暇接冲液 (ph7.2) 洗 小时 中含 2 然后再用 T l'í s- )Jfiñ 丁 次, 共历时 (3) 培育反应反应液的组成如下 2 50mM Tris-)I 国丁烯二酸缓冲掖 (ph7. 到 ATP( 的盐 2mM M;~S04 [ 或 M;', (N03 )zj 2 mm Pb(N0 3 )z m M 材料在此反应液中, 于 37 0 C 戎室温下培 芮 30 分钟至 2.5 小时 对照反应 : (a) 反应液中不加 ATP. (b) 反应液中加入 O.OlM NaF (4) 沈涤培 i 亏后, 用二甲肺酸纳缓冲液 (ph7.2) 说 2-3 次, 历时 1 小时左右 e (5) 第二次固定用 ph7.2 的二甲肺酸 铀缓冲液自己制的 2% 饿酸于 C 下固定 过夜 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 3 /J 日才 (6) 洗涤用蒸馆水洗涤 3-4 次, 历时 (7) 脱水 邑埋用各级酒精 ( 或丙嗣 脱 水, 环氧树脂包埋 ( 三 ) 腺试环化酶 (adenylate cyclase) 此酶活性主要分布于质膜上, 它催化环化 AMP(cAMP) 的形成, 反应式是 z 腺前环化酶 ATP '''~H'_ :-'_=-=; camp + PP 川焦磷酸盐 ) Howell 和 Whitfield(1972) [17] 用一种专 一性底物亚胶二磷酸腺吉 \; [adenylyl 一 -imid 一 diphospha-ce(amp-pnp) J, 首次成功地在动 物细胞内对腺试环化晦进行了定位 AL Azzawi 和 Hall(1976)[18] 按 Howell 和 Whiefield 方法对玉米和豌豆根尖细胞内腺音环 化酶的定位也获得良好的结果 实验方法的程 序如下 z (1) 材料的固定用二甲肺酸纳缓冲液 (ph7.4) 自己制的 1% 戊二醉, 在室温下固定 1 小时 ( 或在 o 0_ 4 oc 下固定 2 小时 (2) 洗涤先后用冷却的二甲肺酸销缓冲 浪 (ph7.4) 和 Tris 一顺丁烯二酸缓冲掖 (ph 7.4) 洗涤, 至少 6 小时 (3) 培育反应反应液的组成 : 80mM Tris- 顺丁烯二酸缓冲浪 (ph7.4) 中含 AMP PNP O. õmm. MgS042mM, Pb( N0 3 )z4mm, 葡萄糖 8% 材料在此反应液中, 在 30 0 C 下 杂志细杂志细胞生物学 培育 分钟 细杂志
6 42 细胞生 1980 年 (4),t;J; 用二 ftl 月中酸的缓冲浪洗涤 3 次, 历 H.J' 4.ñ 分钟 (5) 弟二次固定用二甲肿酸呐缓 ìlj:j 1r: 汪 (ph7.4) 配制的 1 %( 或 2 %) 铺酸固定液, 于 -4 0 C 下固定 2 小时 1.5/J ßto 超薄切片 (6) 沈 f 条用菜情水洗涤数次, 历时 1- (7) 脱水 包埋按常规 j 去脱木 包理 ( 四 过毒 i{. 七物酶 (peroxidase) Cral;ilm 和 Kal novs l y (1 966 )17 1 首次用 3.3' 一二刽主联苯胶 (DAE) 成功地对动物细胞 的过氧化物陷进行了细胞化学研究 植物材料 可采用 Hall 和 ] Sex on (l 972) [1 9j 稍经修改的 方法 (1) 材料的初周定用 50mM 二甲肺限 制缓冲浪 (ph7.0) 阳市 IJ 的 3% 戊二醒, 于 o oc 下罔定 1 小时 (2) 沈涤用 Tris-HCl 缓冲液 (ph7.0) 洗涤 4 次, 历时 3 小时 (3) 切片将材料进一步切小, 切片厚度 不超过 100 微米 (4) 培育 A 应反应浓命接冲的 DA13 烙 液 ( 即 50 毫克 DAB 溶于 50 毫升 50mM Tris HCl 缓冲液中 ph7.0) 8 毫升, 0.1%HiJz 2 毫升 切片在此反应液中, 于 23 0 C 下培育 15 分钟 (5) 洗涤用二甲肺酸的缓冲液 (ph7.0) 彻底洗涤 (6) 第二次固定用 ph7.0 的二甲肺酸 铀缓冲液配制的 2% 饿酸, 于 0 一 4 0 C 下第 二次固定 2 小时或过夜 (7) 脱水 包埋按常规脱木 包理 ( 五 ) 过氧化氢酶 (catalase) 过氧化氢晦是微体中的一种特征性酶 它 使过氧化氢还原成水, 并放出氧 植物细胞过 氧化氢酶的亚显微结梅定位是 Frederick 和 Newcomb (1969) [20] 按 Novikoff-Goldfisçher 方法 [21 ] 首次在烟草叶片细胞的研究中获 得成功, 共 ;)~ ~ 应程序如 i" ; (1) 付 1 干的初固定月 j f:)üm iì / 磷酸饲 l 线 ; 中液 (ph6. 的自己 fljlj 的 3% 戌 -- 膛, 在室陆 Ho'iI 定 1. 5 一 2 小时 (2) 洗涤用磷阪饵缓冲液 (p H 6.8) 洗涤 8 次, 为时 分钟 (3) 培育反应反应液含 50m.VT 甘氨酸 -NaOH 缓冲浪 (ph10.0) 5 毫升, l)ab 10 毫 克, 3%H z 毫升, 使用前阻击 1], 在放入 材料前, 将 ph 调节到 9 0 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 将材料移入以上反 应液中, 于 37 0 C 下培育 ω-60 分钟 对照反应 : (a) 标瓜反应浪中不加 Hz'. Î 20 (b) 在合 O.02Mg 一氨基 -1, 2.4 一三哩 (3 a Jluno- 1, 2, 4-triazole) 的甘氨酸 -NaCH 级 ;11 1 液中 预培育 分钟, 随后在含 O.02M3- 氨 基 -1, 2, 4 一三吨的标准反应液中进行培育 (c) 在含 0.01M KCN 的甘氨酸 NaOH 缓 ;I!I 浪 中预培育 分钟, 随即在含 O.OlM CêJi; 0.001M)KCN 的标准反应液中进行松自 (4) 洗涤培育后, 用 50mM? 碎百.:~t 押缓 冲液 (ph6. 窍 ) 漂洗几次, ))j 时 分钟 (5) 第二次固定用 50mNI 磷酸饵绞 ìlj" I 夜 (ph6. 的配制的 2% 饿酸田庄 液, 第二次固 定 2 小时 的洗涤用磷酸押缓冲液 (ph6.8) 漂洗 数次, 历时 分钟 (7) 脱水 包埋 J[j 各级丙隅脱水, Aγaldhe-Epon enase) 包埋 ( 六 唬甜酸脱氢酶 (σsuccini 忖 c d 母呻 hy 抖 drl 叼 3λ 咱 命 g- ' 由于此晦对固定剂很敏感, 所以材料一般 不进行初固定, 即用新鲜材料进行培育反应 方法如 r( 根据 Ekes 1970( 叫 ): (1) 反应浅的配制.5kI i 国石酸 1 1 f1 专 I~ U 容于磷酸盐缓冲液, ph7.6) 3 毫升, 0.3 M CuS 毫升.1M 唬王自酸的 0.7 毫升, 0.05M 氨铁酸饵 0.15 毫升, 0.1M 磷酸盐缓 杂志细杂志细胞生物学 冲液 (ph7.6)0.8 毫升 (2) 培育反应将材料放入以上反应汶 细杂志
7 第 2 卷第 4 期细胞生 43 申, 在室泪下培育匀 ~BO 分钟 对照反应 : (a) 反应液中加入 140mM 丙 二酸呐 (h) 在培育前, 先用 5mM 氯秉基苯 甲酸盐 (p-chloromercuribenzoate, 溶于 0.1 M 磷酸盐续冲液中 ) 处理材料 (3) 洗涤用 O.lM 磷酸盐缓冲液 (ph 7. 别在海 15 分钟 (4) 固定用 O.lM 磷酸盐缓冲液 (ph 7.2) 回制的 5% 戊二阱在 O 4 0 C 下固定 2~ 2.5 小时 涤 (5) 洗涤用磷酸盐缓冲液 (ph7.2) 洗 (6) 第二次周定用 M i11 0nig 缓冲液 (ph7.4) 用制的 1% 饿酸, 在 0'-4 0 C 次固定 1~ 1. 5 小时 ( 七 细胞色素氧化酶 (cytochrome oxidase) (7) 税水 包埋按常规脱永与包理 下第二 细胞色素氧化隅是线粒体内氧化磷酸化的 末瑞氧化酌, 它使还原的细胞色素恢复到雪之化 状态, 并在最后催化 z 还原成 HzO. Se1igman 等 (1968)[23J 将 DAB 用于细胞色素氧化 悔的细胞化学研究 细胞色素 c 是天然的氧化 剂, 它能氧化 DAB, 还原态细胞色素 c 在细 胞色素氧化酶的催北节, 又恢复到氧化状态 如 以 t )i, 厅述, 氧化后的 DAB 经饿酸固定后, 会 形成一种不 j 容性的械化聚合物, 因此可在电子 显何情下得到定位的图像 Opik(1975)[ 叫用此法对水稻胚芽喃线粒 休的细胞色素氧化酶活性的定位获得十分良好 的结果 其实验程序是 2 (1) 材料的初固定用磷酸盐缓冲液 (ph 7.2) 配制的 3% 戊二醋在室温下固定 1 小时 (2) 洗涤 m ph7.2 磷酸盐缓冲液洗涤 4 次, 历 Ht 30 分钟 (3) 培育反应反应浓的组成是, 50mM 磷酸盐缓冲液中含布 DAB 2.5 毫克 / 毫升, 蔚 糖 O.lM, ph6.2 将材料放入此反应液中, 在 27 0 c 下培育 小时 同时以反应掖中 不加 DAH 的平行反应 ('n 才照 (4) 洗涤培育后, 用 ph7.2 磷防检绥 J 中被洗涤 4 5 次, Jjj rlt 1 小 Il l", (5) 第二次固定用磷酸盐缓冲浪 (ph 7.2) 配制的 2% 饿酸进行第二次固定 (6) 脱水 包埋按常规脱水与包理 (}\) 醋 RI (li pase) Gomori (1945) 首次用组织化学方法证实 醋酶的存在 Nagata 和 Murata (1972) 和 Na 写 ata(1974) 成功地进行了亚思微结构的定 位 [470 以 Tween 80 作底物, 该底物被附因鲁 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 木解时产生一种不 i 容性的吗皂, 然后用 Pb (N03 )z i 容诚处理, 形成铅皂 (1) 反应泣的配方 5%Tween 60 或 80 1 毫升.2MTris- 顺丁烯工酸缓 冲 ; 在 (ph7.2) 2.5 毫升 10%CaC12 il 毫升 2.5% 牛横胆酸的 2.5 毫升 芙情永 13 毫升 (2) 培育冰凉切片在以上反应掖巾, 于 37 0 c 培育 1~18 小时 (3) 洗涤用 2%EDTA 一二甲肿酸饷缓 冲液 (ph7.2) 短暂的洗涤, 以隐去 CaE+ (4) 处理在 O.15%Pb(N0 3 )2 溶液中处 理 10 分钟 (5) 洗涤用 ph7.2 二甲肺酸饷绥冲液 洗涤 8 次, 历时一小时 (6) 周定用二甲肿酸情缓冲液 (ph7.2) 自己制的 2% 饿酸进行固定 (7) 脱水 包埋用亲情 7}( 洗海 丙嗣迅 速脱水 环氧树脂包埋 参考文献 [ 1] Hayat, M. A. ed., Electron Microscopy of Enzymes, Vol.l (973); Vol.2 (974); Vol.3 (974); Vol.4 (975); Vol.5 (1977). Van Nastrand Reinhold Company, New York. [ 2 ] Lewis, P. R &υ. P. Knight 1 日 77: 杂志细杂志细胞生物学 细杂志
8 u 细胞生 1980 作 Staining methods for sectioned materia1, PP. l37-287, North-Holland publishing Company, Amstcrdam. Ncw York. Oxford. [ 3 J Pearse A. G. E.: Histochemistry: theoretica1 & app1ied, 3rd edn.. Vo1. 1 (968); Vo1. 2 (972). Churchil1 London [ 4 J Sexton, R. & J. L. Ha111978: Enzyme Cytochemistry. In: "Electron Microscopy and Cytochemistry of plant Cells". 0. L. Hall ed). [ 5 J Wachstein. M. & E. Meise11957: Amer. J. Clin. Path.. 27: [ 6 J Essner, 1 二. & A. B. Novikoff et al : J. Biophys. Biochem. Cyto!.. 4: [ 7 J Granham,R.C. & M.J. Karnovsky 1966: J. Histochem. Cytochem.. 14: [8] Treleasc. R. N. et al : J. CellBiol.. 60: [9] Se1igman, A. M. et al : J. Hi stochem. Cytochem., 15:1-13. [10J Kalina. M et a1., 1972: J. Histochem. Cytochem.. 20: [11] Ogawa. K. et al : J. Histochem. Cytochem. 16:19-~7. [12J Nir, 1. & A. M. Seligman 1972: J. Histochem. Cytochem. 19:6 门 [13J Anderson. P J 1967: J Histochem. Cytochem.. 15: [1 4J Jacobsen, N. O. & P. L. Jorgensen 1969: J. Histochem. Cytochem., 17: [1 日简令成等, 1980: 实可衍生物学报, 曰 : (2) [16J Nakagaki, 1. et a1., 1978: J. Histochem. Cytochem., 26: [17] Howell. S. L. & M. Whitfield 1972: J. Histochem. Cytochem.. 20: [13J AL-AZZawi. M. J. & J. L. Hal1 1976: Plant Sci. Lett.. 6: [19J Hall. J. L. & R. S( 丁文 ton 1972: Planta 108: [20J Frederick. S E. & E. H. Newcomb 1969: J. Cell Biol.. 43: [21] Novikoff. A. B & Goldfischer. S. 1968: J. Histochem. Cytochem.. 16:507. [22J Ekes. M. 1970: PLantα94: [23J Seligman. A. N. et al., 1968: J CeH Biol.. 38: 1 一 14. [24J Opik. H. 1975: J. Cell Sci.. 17: 细胞生杂志细杂志细胞生细胞 植物细胞生物学讲习班在兰州举办 中国植物学会细胞专业组于 1980 年 7 月 22 日至 8 月 5 日在兰州兰州大学举办植物细胞生物学讲习班, 邀 请有关专业的教员和科研人员共 12 名为教员, 并邀请美国密执安大学细胞遗传学教授戴维 Ijifl~ 香港大学植物系 徐是雄博士讲课 主要讲课内容有 2 植物细胞的溶酶体 液泡及微体系统, 生物膜和线粒休的结构和 l 功能, 植 物细胞的遗传修饰, 细胞间的联络和协质运输, 叶绿体的结构和功能, 问期核的结构与功能, 有丝分裂与减数 分裂 内膜系统与微梁系统, 基因表达, 植物细胞对低温 干导和盐碱的适应性变化, 扫描电战及其在植物学 上的应用, 植物原生质体培养及细胞分化 等方面 学员来白全国各大专院校的教师及科研系统有关专业的 科技工作者共 195 名 讲习班主要日的 g 1 提高教育科研人员的植物细胞学水平 2 为 ; 可等院校开课创造条 件 9 为教育及科研在细胞学方面交流情况创造条件 除讲课外还组织各种形式的照谈会, 互相交流教学经验, 并请郑同辑 郝水教授介绍开讲细胞生物学课程的经验体会 学员主要都是中年骨干教师, 为开仔细胞生物学课 程作好准备, 教师们学习情绪高涨, 课前课后纷纷交流经验, 认真讨论各专业的内容, 互相学习, 为提刮目前 细胞生物学水平而努力 杂志细杂志细胞生物学 植生 F 斤细胞生理室王熊 细杂志
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