目 录 1. 简介... (2) 2. 实验条件与设备... (2) 2.1 实验室要求... (2) 2.2 仪器设备... (2) 2.3 常用工具与耗材... (3) 3. 实验动物... (3) 4. 实验试剂及配置... (3) 4.1 实验试剂... (3) 4.2 试剂配制... (3

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1 膜片钳技术系列手册 (7) 大鼠背根神经节细胞急性分散方法 刘振伟 编写 (2015 年 6 月 27 日 )

2 目 录 1. 简介... (2) 2. 实验条件与设备... (2) 2.1 实验室要求... (2) 2.2 仪器设备... (2) 2.3 常用工具与耗材... (3) 3. 实验动物... (3) 4. 实验试剂及配置... (3) 4.1 实验试剂... (3) 4.2 试剂配制... (3) 5. 实验操作... (4) 5.1 准备工作... (4) 5.2 剥离背根节... (4) 5.3 消化 分散与接种... (4) 6. 神经元形态观察... (4) 7. 注意事项... (6) 8. 膜片钳实验... (6) - 1 -

3 1. 简介 背根神经节 (Dorsal root ganglion, DRG) 又称脊神经节, 位于脊神经的后根上, 节内富含多种假单极初级感觉神经元胞体, 负责将躯体和内脏的感觉信号 ( 如痛觉 温觉 触觉 压觉 牵拉觉等 ) 传入 至脊髓后 ( 背 ) 角, 完成初级感觉信息的传递 ( 图 1) DRG 初级感觉神经元是各种感觉信息从外周到 中枢的重要中转站和加工站, 其膜上的受体 离子通道以及所释放的神经递质现已成为痛觉机制研究和 新型镇痛药开发的重要靶标 DRG 神经元从胞体发出一个突起, 然后呈 T 形分支, 分别走向脊髓后角 ( 为中枢突 ) 和沿脊神经走向外周组织 ( 周围突 ), 走向外周的部分经其末梢形成感受器 背根节 DRG 神经元 脊髓后角 脊神经 交感节 后根 前根 脊髓侧角 脊髓前角 灰交通支 白交通支 躯体感觉传入纤维 内脏感觉传入纤维 图 1. 背根神经节的位置及纤维联系 本文介绍急性分散大鼠 DRG 神经元常用的方法, 该方法不仅可以获得形态非常好的 DRG 分散神经 元, 还非常适合于膜片钳技术实验 此外, 本方法也可为培养 DRG 神经元提供参考 2. 实验条件与设备 2.1 实验室要求细胞急性分离要求有独立无菌的细胞培养间, 需要无菌操作, 要求工作环境和条件必须保证无微生 物污染 细胞培养间内要配备常用设备, 如紫外灯 倒置显微镜等 细胞培养间一般包括更衣间 ( 更换工作服 拖鞋 ) 缓冲间 ( 放置冰箱 无菌器械及物品 ) 与洁净室 ( 操作间, 放置超净工作台 培养箱 离心机 倒置显微镜等 ) 培养间内最好有空气过滤 层流装置 2.2 仪器设备必需的设备 :CO 2 培养箱 CO 2 气瓶 超净工作台 解剖显微镜 倒置显微镜 低速台式离心机 (1,000-1,500 rpm) 电子天平 (0.1 mg) ph 计 纯水机 冰箱 高压消毒锅 恒温水浴锅 恒温振荡 - 2 -

4 器 电烤箱 酸缸 选配的设备 : 渗透压仪 倒置荧光显微镜 数码相机 图像采集卡 酶标仪等 2.3 常用工具与耗材培养皿 (35 mm) 200 目筛网 滤器及微孔滤膜 (0.2 μm) 各种规格移液枪 酒精灯 血球计数器 常用手术器械 ( 眼科镊 显微手术镊 手术剪等 ) 常用玻璃器皿 ( 试管 离心管 吸管 滴管等 ) 各 种培养液储存器 3. 实验动物 体重 180 g 左右的成年雄性 Wistar/SD 大鼠 每次实验需要 2 只 4. 实验试剂及配置 4.1 实验试剂表 1 DRG 神经元急性分散常用试剂名称英文生产厂家备注 DMEM/F12 培养基 Dulbecco s Modified Eagle Medium/F12 Gibcol DMEM:F12 = 1:1 胎牛血清 fetal bovine serum Gibcol/Hyclone/ 国产 马血清 equine serum Gibcol/ Hyclone/ 国产 HEPES HEPES Sigma 胰蛋白酶 Trypsin Gibcol/ 国产 胶原酶 I Collagenase Sigma 胰蛋白酶抑制剂 Trypsin Inhibitor SIgma TypeⅡ-S L- 多聚赖氨酸 poly-l-lysine Sigma 分子量 : kda 青霉素 Penicillin 国产 ( 如华北制药 ) 80 万单位 / 支 链霉素 Streptomycin 国产 ( 如华北制药 ) 100 万单位 / 支 注 :(1) 无机盐 葡萄糖等采用国产的即可, 但要求为分析纯 (2) 所用蒸馏水至少为双蒸水 如果采用纯水机, 可直接使用纯水 (3)F12 含有大量的无机盐与氨基酸 维生素等营养成分 4.2 试剂配制 (1) 多聚赖氨酸液用于使神经元贴壁 取 L- 多聚赖氨酸 25 mg, 用双蒸水溶解并稀释至 250 ml, 终浓度为 0.1 mg/ ml, 用 0.2 μm 的微孔滤膜过滤,4 C 保存备用 (2) 青链霉素储备液用于防止细菌污染 取青霉素 80 万单位, 用 20 ml 双蒸水溶解 ; 取链霉素 100 万单位, 用 25 ml 双 蒸水溶解 两种溶液按照 1:1 比例混匀, 分装, 冻存 (3) 解剖液分离并剪碎神经组织用液 要求是不含钙镁的平衡盐溶液, 高压蒸汽消毒 取葡萄糖 3.0 g, 蔗糖 7.5 g,nacl 8.0 g,kcl 0.4 g,na 2 HPO 4 7H 2 O 0.18 g,kh 2 PO g, 酚红 1 mg,5 ml 青链霉素储备液, 用 9.0 mmol/l HEPES 缓冲液溶解, 并加到 1,000 ml,ph 7.3, 渗透压调至 mosm 用 0.2 μm 的微孔滤膜 过滤,4 C 保存备用 - 3 -

5 (4)DMEM/F12 培养基取 DMEM/F12 培养基一个包装, 用双蒸水溶解, 用双蒸水稀释并加到 1,000 ml, 调 ph 值为 7.3 用 0.2 μm 的微孔滤膜过滤 4 C 保存备用 (5) 消化液水解神经元间结构蛋白的连接 消化纤维组织, 从而分离细胞 将 8 mg 胶原酶 4 mg 胰蛋白酶加 入到 DMEM/F12 培养基 8 ml 中, 可用于 2 只大鼠的 DRG 神经元消化 此消化液要在临用前现配 (6) 饲养液马血清 10 ml, 胎牛血清 10 ml, 青链霉素储备液 0.5 ml, 加 DMEM/F12 培养基溶液至 100 ml, 使用前数小时配置, 并置于培养箱中备用 5. 实验操作 5.1 准备工作 细胞培养间和超净工作台消毒 准备已消毒好的器械和物品 包被培养皿 / 玻片 : 使用前 1-2 d, 在无菌条件下取 35 mm 塑料培养皿 ( 来自 Corning/Nunclon/ NORMAX 等 ), 每皿加多聚赖氨酸 1 ml, 均匀涂抹后去除多余的多聚赖氨酸, 置于超净工作台内 2 hr, 自 然干燥备用 如果采用玻片, 可将玻片浸在多聚赖氨酸溶液中 5 min 取出, 室温过夜备用 包被前玻片要用 75% 乙醇溶液清洗 配置消化液和饲养液 : 使用前数小时配制, 并置于 37 C 5% CO 2 培养箱中备用 5.2 剥离背根节 取 180 g 左右雄性 Wistar/SD 大鼠 2 只, 腹腔注射乌拉坦麻醉后, 置于解剖台上, 背面朝上 沿大鼠背部正中线剪开皮肤和肌肉层, 暴露出脊柱, 然后用剪刀剪开脊椎, 在双侧椎孔内取出 腰 (L6 L5 L4) 节段背根神经节, 置于盛有 4 解剖液的培养皿中 超净工作台内, 解剖镜下, 用手术镊剥离神经节上附着的结缔组织和包膜, 再用镊子逐个将剥 离干净的神经节撕成小块 5.3 消化 分散与接种 将神经节组织放入配置好的盛有 8 ml 消化液的小锥形瓶中, 置于 37 5%CO 2 培养箱中消化 35 min 每隔 10 min 左右摇晃小锥形瓶数次, 使神经节碎片充分散开, 以利于酶的充分消化 消化 35 min 后, 加入胰蛋白酶抑制剂以终止消化 将消化好的细胞悬液以 1,000 rpm 的速度离心 2 min, 弃去上清液, 加入饲养液, 用细口滴管 ( 尖 端直径 1-2 mm) 轻轻地反复吹打使细胞均匀分散, 最后用 200 目滤器过滤, 制成细胞悬液 将细胞悬液均匀接种到 3 个涂好多聚赖氨酸的 35 mm 培养皿中, 置于 37 5%CO 2 的孵温箱中培 养 2-3 hr 后, 多数细胞均已贴壁, 此时可对神经元进行形态结构分析 生化组化测定以及进行膜片钳 实验记录 6. 神经元形态观察 倒置相差显微镜下观察, 培养 2-3 hr 后, 急性分散的 DRG 神经元大多数已经贴壁, 呈圆形 椭圆形, 部分神经元可见断裂卷曲的突起残端, 良好的神经元胞体光泽明亮 核与核仁清楚 胞膜边界清晰光滑 ( 图 2) 根据其直径大小可分为小 (~20 µm) 中 (20-40 µm) 大 (> 40 µm) 等 3 种类型 - 4 -

6 随着在显微镜下记录的时间延长, 细胞光泽逐渐退去 核与核仁逐渐模糊 细胞边界逐渐不清晰 ( 图 3) 记录 2 hr 后, 大多数细胞不能用来进行膜片钳实验记录, 需要使用培养箱中的下一皿细胞 图 2. 急性分散的大鼠 DRG 神经元 细胞大小不一, 标记有 号的显示可以进行膜片钳实验记录的良好细胞 (x 400) 图 3. 急性分散的大鼠 DRG 神经元 标记有 号的显示已经变得不好的细胞 ( 胞体光泽退去 核与核仁模糊 细胞边界不清晰 )(x 400) ( 引自参考文献 2) - 5 -

7 7. 注意事项 1. 无菌操作 : 无论是配置液体还是取材 使用工具, 急性分散的整个操作过程都要在无菌条件下进行 2. 剥离神经节 : (1) 为保证 DRG 神经元接种的质量和数量, 游离脊柱要快速, 剥离 DRG 要完整 ; (2) 取出 DRG 时, 要尽量夹持其两端神经纤维, 避免 DRG 神经元的损伤 ; (3) 剥离 DRG 时, 要尽量剥离掉 DRG 上附着的结缔组织和包膜 3. 选择血清 : 不同批号 / 批次的各类血清之间可能存在较大差异, 这对神经元影响很大, 要预先筛 选适合的血清 4. 胰蛋白酶 : (1) 不同批号的胰蛋白酶的消化能力可能差距, 这对实验结果影响较大 应确定浓度后进行预 实验, 确定具体的消化时间, 一般在 min 不等 ; (2) 胰蛋白酶使用量与所取 DRG 的组织量 / 大鼠的数量有关, 消化时间长短与胰蛋白酶浓度有关, 这可能需要在实验中摸索 8. 膜片钳实验 DRG 神经元在培养箱中培养 2 hr 后即可开始膜片钳实验记录 可记录到各种电压门控性离子通道电 流 配体门控性离子通道电流 电流钳模式下, 也能诱发出动作电位 但一般难以记录到神经元的自发 活动 膜片钳实验开始前, 要将饲养液更换为通道记录液 (Recording solution) 更换时, 先将饲养液倒掉, 然后倒入 1 ml 左右记录液, 轻晃清洗, 可清洗 1-2 次, 最后倒入 ml 记录液 注意 : 事先最好对记录液进行过滤 实验时, 无论是记录液还是电极内液, 都要根据膜片钳记录模式 实验目的 所欲记录的离子通道 等要求来配制 例如, 记录 DRG 神经元全细胞 Ca 2+ 电流的记录液 ( 细胞外液 ) 配方可以是 (mmol/l): NaCl 140,KCl 5,CaCl 2 2,MgCl 2 1,HEPES 10, 葡萄糖 10,TTX 0.001,4-AP 1,TEA 10, 调 ph 值为 7.3 电极内液 ( 细胞内液 ) 配方可以是 (mmol/l): CsCl 140,HEPES 10,EGTA 10,Na 2 ATP 2, 用 CsOH 调 ph 为 7.3 而记录全细胞 TTX 不敏感型钠离子通道 (TTX-R) 电流的配方, 可在上述配方的细胞外液中加入 µmol/l 的 TTX, 电极内液中用 CsF 代替 CsCl 图 4. DRG 神经元全细胞记录的 TTX-R 钠离子通道电流 ( 引自参考文献 1) - 6 -

8 参考文献 1. 邱方等. 用于膜片钳研究的大鼠背根节细胞急性分离技术的改良. 北京医学, 2012 (34);8: 李明颖等. 草酸铂对大鼠神经节细胞元细胞膜上钠离子通道电流影响的实验研究. 中国临床药理学杂志, 2009(25); 3: ( 完 ) - 7 -

3 4 5 1 1-20 4 2, 260mOsm/kg 320 mosm/kg HEPES ph 7.2-7.4 ph ph (7.4-7.7), ph (7.0-7.4) NaHCO 3 CO 2 CO 2 CO 2 5 2

3 4 5 1 1-20 4 2, 260mOsm/kg 320 mosm/kg HEPES ph 7.2-7.4 ph ph (7.4-7.7), ph (7.0-7.4) NaHCO 3 CO 2 CO 2 CO 2 5 2 1 (1) (2) ( ) (3) (4) (5) (1) (2) (3) 2 (1) ( ) (2) (3) (4) 1 2 1 3 4 5 1 1-20 4 2, 260mOsm/kg 320 mosm/kg HEPES ph 7.2-7.4 ph ph (7.4-7.7), ph (7.0-7.4) NaHCO 3 CO 2 CO 2 CO 2 5 2 NaHCO 3 1.97g/L CO 2

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