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1 中国病理生理杂志, ( ): - 杂志网址 : : [ 文章编号 ] - ( ) - - 视网膜神经节细胞凋亡对延迟 * 整流钾电流的影响赵瑛, 徐亚吉, 路雪婧, 段俊国 ( 成都中医药大学视觉生理重点实验室, 四川成都 ; 成都大学生理教研室, 四川成都 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察视网膜神经节细胞 (, ) 凋亡对延迟整流钾电流 ( -, ) 的影响方法 : 将原代培养 ~ 的乳大鼠分为对照组加压. 组加压组加压. 组和加压组, 对照组为常规培养 ; 其它各组常规培养后用自行设计的加压装置加压 -, 时间分别为.. 和, 通过连续波长多功能微孔板检测仪检测各组线粒体的荧光强度 ; 通过全细胞膜片钳技术观察各组细胞膜电容 (, ) 的变化, 观察对照组与加压组和的变化结果 : 对照组线粒体的荧光强度与加压. 组比较差异无统计学显著性, 而加压. 和各组线粒体的荧光强度显著低于对照组 ( <. ); 对照组的细胞与加压. 组比较差异无统计学显著性, 其余各组的细胞显著低于对照组 ( <. ) 与对照组比较, 加压能使电流幅度显著增加, 在刺激电位为 ~ 时, 加压组的电流密度明显大于对照组 ( <. ) 加压组的值明显高于对照组 ( <. ), 显著小于对照组 ( <. ), 两组间比较值的差异无统计学显著性结论 : 视网膜神经节细胞凋亡伴有通道电导增加, 增大 [ 关键词 ] 延迟整流钾电流 ; 视网膜神经节细胞 ; 加压 ; 细胞凋亡 [ 中图分类号 ] ; [ 文献标志码 ] : -, -, -, - [ 收稿日期 ] - - [ 修回日期 ] - - *[ 基金项目 ] 国家科技部重大新药创制资助项目 ( - ); 四川省教育厅重点项目 ( ) 通讯作者 : - ; - (,,, ;,,, - ) [ ] : ( ) ( ) : ~ -,.,,.,.,,., ( ) - - :. ( <. )., ( <. ), ( <. ) - ( ) - - ( ) ( <. ), :

2 [ ] ; ; ; 青光眼是不可逆致盲性眼病, 病理基础是视网膜神经节细胞 (, ) 凋亡, 视野缺损, 因此探索凋亡机理对预防和治疗青光眼有重要意义越来越多的研究表明, 细胞内钾离子浓度降低是多种细胞凋亡途径的重要因素, 胞内钾外流是引起老年痴呆患者海马神经元凋亡的关 [ ] 键, 随着凋亡细胞内的丢失, 细胞内促凋亡因 [ ] 子表达增加使细胞凋亡我们前期的研究发现, 青光眼大鼠的促凋亡因子增加, 凋亡 [ ] 抑制因子 - 的表达减少, 的凋亡增多然而尚不清楚在凋亡过程中的电流是如何变化的为此, 本研究探讨压力诱导凋亡时延迟整流钾电流 (, ) 的变化, 探索凋亡的机理, 为防止青光眼视神经疾病奠定基础实验动物及分组乳鼠 ( 出生材料和方法 ~ ), 雌雄不拘, 由成都中医药大学实验动物中心提供将分离培养的乳鼠分为对照组加压. 组加压组加压. 组和加压组对照组为常规培养 ; 其余各组为常规培养后用自行设计的加压装置加压, 时间分别为.. 和主要试剂与仪器多聚鸟氨酸多聚赖氨酸胰蛋白酶 - 和 ( ); 层黏连蛋白 ( ); 胎牛血清 -. 单克隆抗体和二甲基亚砜 ( ); 羊抗鼠 ( 北京中杉金桥生物科技有限公司 ); 宁夏枸杞多糖 ( 由香港大学脑与认知科学国家重点实验室馈赠 ) 膜片钳系统 ( ); - 电极拉制仪 ( ); 倒置显微镜 ( ); 倒置显微成像系统 ( ); 体视显微镜 ( ) 方法 [ ]. 的培养用文献报道的方法分离培养取出生 ~ 内的乳鼠, % 乙醇消毒, 断颈处死, 无菌条件下取眼球, 置入含青霉素的液中在体视显微镜下沿角膜剪开, 去除晶状体和玻璃体, 钝性分离视网膜将视网膜放入终浓度. % 的胰蛋白酶中, 吸管轻轻吹打, 消化, 加入胎牛血清终止消化, 用目无菌钢筛网过滤, 滤液离心次,, 每次, 弃上清液向沉淀中加入培养液 ( 含 % % 胎牛血清青霉素链霉素 ), 吸管吹打使之分散均匀制成单细胞悬液将视网膜细胞悬液加入经羊抗鼠和小鼠抗大鼠 -. 单克隆抗体包被的培养皿中, 在 % 培养箱中孵育, 使视网膜与 -. 单克隆抗体充分结合去除悬液, 用无血清培养液反复漂洗, 清除培养皿表面未黏附细胞用. % 胰蛋白酶消化黏附的细胞, 小牛血清终止消化收集细胞, 离心, 去上清, 加入含胎牛血清的培养液, 用吸管反复吹打, 使细胞分散均匀, 制成细胞悬液, 计数, 将细胞悬液按每孔个接种于经多聚鸟氨酸层黏连蛋白包被的孔板中, 置于培养箱中培养. 线粒体膜电位的检测用. % 胰蛋白酶消化黏附的细胞, 小牛血清终止消化, 收集细胞, 离心, 加入液使细胞悬浮, 将悬液加入酶标板中, 静置贴壁, 加入已配置好的 μ, 每孔 μ, 使终浓度至. μ, 孵育, 用洗涤次, 用连续波长多功能微孔板检测各组线粒体膜荧光强度, 激发光波长为, 发射光波长为, 重复次实验. 全细胞膜片钳记录在室温条件 ( ~ ) 下记录各组的膜电容 (, ) 以及对照组与加压组的采样频率为, 低通滤波频率, 保持电位钳制在, 以的阶跃, 从去极化至, 钳制时间为电极液 ( ): -., 用调节值至. ; 细胞浴液 ( ):...., 用调节值至. 统计学处理采用. 和. 软件进行数据处理并作图, 采用. 软件进行统计学分析,

3 实验数据以均数 ± 标准差 ( ± ) 表示, 两组间比较采用独立样本检验, 多组间进行比较采用单因素方差分析 ( - ), 各组均数间两两比较采用法, 以 <. 为差异有统计学意义结果加压对线粒体膜电位的影响线粒体膜电位与荧光强度成正比, 因此可通过荧光强度间接观察线粒体膜电位的变化对照组与加压. 组比较差异无统计学显著性, 加压组加压. 组和加压组显著低于对照组 ( <. ), 见图 - - ± = * <., ** <. 图加压时间延长引起线粒体膜电位减小加压对细胞的影响为了观察加压诱导凋亡细胞体积的变化, 我们在电生理实验中观察了加压不同时间的细胞, 对照组和加压. 组细胞的差异无统计学显著性, 加压. 和组细胞的均显著低于对照组 ( <. ), 而加压. 和组细胞的差异无统计学显著性, 见图凋亡的的改变加压能使发生凋亡, 因此, 本研究采用全细胞电压钳制脉冲刺激模式记录对照组和加压组的选择胞体光泽好细胞膜光滑立体感强的细胞进行实验与对照组比较, 加压能使电流幅度显著增加各阶跃电压下的电流大小以电流密度 ( 电流膜电容 ) 表示, 做电流 - 电压 ( - ) 曲线, 与对照组比较, 在刺激电位为 ~ 时, 加压组的电流密度明显大于对照组, 差异有统计学显著性 ( <. ), 见图 - - ± = 图加压时间延长引起细胞膜电容减小凋亡的从的动力学改变 * <. 电流 - 电压曲线中获得数据并转化为电导值, 以标准化电导值对膜电位作图, 用方程 = { [ ( ) ] } 拟合, 得到最大电导值 ( ) 电流激活曲线半数激活电压 ( ) 和斜率值加压组的与对照组的比较差异有统计学显著性 ( <. ), 加压组的与对照组比较差异有统计学显著性 ( <. ); 两组比较值间的差异无统计学显著性, 见图表讨论青光眼是全世界第二位致盲性眼病, 据流行病学调查显示, 目前, 我国岁以上人群中, 青光眼患者达到万人, 且青光眼患者数量呈逐年上升的 [ ] 趋势, 青光眼的主要病理变化是视网膜神经节细胞的凋亡及视神经的永久性损害, 视野缺损, 因此, 探索青光眼视网膜神经节细胞凋亡的机制尤为重要细胞凋亡是细胞死亡的主要形式之一, 诱导凋亡的方法根据研究者们研究的对象和目的而采取不同的方法, 国内外研究己证实外来机械压力可导致 [ ] [ - ] 淋巴细胞凋亡, 神经节细胞的损伤或凋亡本实验室早已建立了成熟的加压诱导细胞凋亡的方法, 发现加压能诱发凋 [ ] 亡, 采用加压的方法诱导凋亡模拟了眼球在高压状态下引起凋亡及损伤的情况线粒体在细胞凋亡过程中发挥积极主动的调控作用, 而且处于多种凋亡调控通路和信号的中心地 [ ] 位正常的线粒体膜电位是生存所必须的, 当细

4 :, ; : ; : ( )- ( ) ± = * ** <., <. 图加压组与对照组的变化 - - ± = 图加压组和对照组的电导 - 电压曲线表两组的动力学特征 ( ± ) ( ) ( ) ± ± ± ± * ± ± ** * <, ** <. 胞受到凋亡诱导因素作用后, 线粒体膜受到破坏使其膜电位降低, 导致线粒体内促凋亡蛋白分子释放, 使细胞凋亡是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料, 是一种线粒体跨膜电位的指示剂, 荧光与线粒体膜电位呈线性关系我们的研究显示随着加压时间大于, 荧光强度降低, 该研究结果与凋亡的大脑纹状体 [ ] 神经细胞内颗粒荧光强度降低, 缺氧诱导的大鼠皮层神经细胞线粒体膜电位降低一 [ ] 致荧光强度的降低可能与加压引起线粒体膜完整性破坏有关, 从线粒体中释放出活性氧 ( -, ) - - 等促 [ - ] 凋亡蛋白可能引起压力诱导的凋亡我们的研究还发现, 加压. 会引起的的差异, 细胞变小, 而加压. 与加压无明显间接反映了细胞体积的大小, 这与细胞凋亡时细胞体积变小的基本形态学特性一致我们的这些研究结果也再次证明了加压

5 可引起凋亡大量的研究发现, 多种细胞凋亡伴有细胞内钾离子的外流增加, 本研究发现加压引起细胞增大, 左移变小, 增加, 这一研究结果与文献报道的 [ ] 神经细胞凋亡时外向钾电流增加一致, 说明凋亡也伴有外向钾电流增加, 增加的原因可能是细胞膜上的通道数开放增多, 电导增大, 但并不能说明通道开放的速度增快此外, 外向钾电流的增加, 细胞内容物减少, 促进了细胞体积变小, 这也可能是细胞凋亡时体积变小的原因然而, 凋亡时外向钾电流增加是否是凋亡的必要条件, 钾通道在凋亡过程中的作用是什么哪种类型的钾通道参与凋亡我们还要做进一步的研究致谢 : 感谢苏国辉院士为本研究提供宁夏枸杞多糖 [ 参考文献 ] [ ] 金宏伟电压依赖性钾通道在老年痴呆相关的神经细胞凋亡中的作用研究 [ ] 北京 : 中国协和医科大学, [ ] 杨巧云钾离子调节转录因子活性参与神经元凋亡机制的探讨 [ ] 上海 : 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所, [ ] 赵瑛, 刘立夏, 黄燕, 等枸杞多糖对高眼压大鼠视网膜神经节细胞的影响 [ ] 中医眼耳鼻喉杂志,, ( ): - [ ] 张虹, 钟杰, 李贵刚, 等压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞存活及轴突生长的影响 [ ] 中华眼科杂志,, ( ): - [ ],,, : - [ ],, ( ): - [ ],,, - - [ ],, ( ): - [ ],,, [ ],, ( ): - [ ],,, [ ],, ( ): - [ ] 曾洁萍及其成分对体外培养鼠视网膜神经节细胞影响的实验研究 [ ] 成都 : 成都中医药大学, [ ],, - : [ ],, ( - ): - [ ], [ ],, ( ): - [ ] 魏楚蓉, 刘路宽, 田立兵, 等硫化氢对缺氧诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ] 应俊, 潘若望, 王茂峰, 等藻蓝蛋白诱导喉癌 - 细胞凋亡的实验研究 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ] 刘俊, 张雪林, 任永生, 等表达下调通过活化依赖的线粒体通路诱导阳性胃癌细胞凋亡 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - [ ],,, - - [ ],, ( ): - ( 责任编辑 : 卢萍, 罗森 )

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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