主要内容 狂犬病在我国的流行情况及疫苗的作用探讨 狂犬病疫苗的生产情况及特点 狂犬病疫苗质量控制 狂犬病疫苗质量控制方法的研究

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1 人用狂犬病疫苗质量控制研究 李玉华 中国食品药品检定研究院 2015 年 11 月 日广州

2 主要内容 狂犬病在我国的流行情况及疫苗的作用探讨 狂犬病疫苗的生产情况及特点 狂犬病疫苗质量控制 狂犬病疫苗质量控制方法的研究

3 我国人用狂犬病疫苗流行及疫苗效果 狂犬病是由狂犬病病毒感染引起神经系统损伤性疾病, 一旦发病, 几乎 100% 死亡, 给人们的健康构成了严重威胁 历史上出现了 3 次流行发病高峰 :1956 年 (1942 例 ) 1981 年 (7037 例 ) 2007 年 (3300 例 ) 1981 年达到建国以来最高发病水平,7000 余例 1990 年代中期, 疫情得到有效控制,1996 年仅报告 159 例 疫苗大量使用 / 疫苗效价提高 / 政府出台限制养犬条例等 2007 年, 再次升高达到 3300 例 / 年 : 之后采取了一系列联防措施 养犬管理 疫苗暨被动免疫制剂质量监管等 我国 年报告狂犬病

4 狂犬病疫苗质量的提高使狂犬病疫情大幅度下降 系列举措促进了狂犬病疫苗质量的显著提高 2005 年狂犬病疫苗实施批签发, 有佐剂疫苗停止签发 2007 年加强监管, 多次飞行抽检 2009 年 DNA 残留纳入批批检 上市后疫苗的市场监督评价性抽验 2010 年药典增加了抗生素 宿主蛋白指标 放行效价不低于 4.0IU/ 剂 狂犬病疫情自 2007 年达到高峰以后, 自 2008 年持续下降,2012 年全国报告 1400 例狂犬病例 ;2014 年全国报告 924 例狂犬病例 2014 年发病数首次降低到 924 例, 比 2007 年高峰期下降了 234%

5 我国人用狂犬病疫苗的生产现状 企业名称生产用毒种细胞病毒培养生产基质规格剂型程序 辽宁成大 PV 发酵罐 Vero 细胞 0.5ml/ 支, 冻干, 0.5ml/ 支, 液体 5 针 4 针 广州诺诚 ag 发酵罐 Vero 细胞 1.0ml/ 支, 冻干 5 针 辽宁依生 CTN 转瓶 Vero 细胞 0.5ml/ 支, 冻干 5 针 吉林迈丰 ag 发酵罐 Vero 细胞 1.0mL/ 支, 液体 5 针 长春长生 ag 发酵罐 Vero 细胞 1.0mL/ 支, 液体 5 针 宁波荣安 ag 转瓶 Vero 细胞 1.0mL/ 支, 液体 5 针 吉林亚泰 ag 转瓶 PHK 细胞 1.0mL/ 支, 液体 5 针 大连汉信 ag 转瓶 PHK 细胞 1.0mL/ 支, 液体 5 针 兰州所 ag 转瓶 PHK 细胞 0.5ml/ 支, 冻干 5 针 河南远大 ag 转瓶 PHK 细胞 1.0ml/ 瓶液体 5 针 中科生物 ag 转瓶 PHK 细胞 1.0ml/ 瓶液体 5 针 成都康华 PM 发酵罐 MRC-5 National 1.0ml/ Institutes 瓶, for 冻干 Food and Drug Control 5 针

6 人用狂犬病疫苗的生产工艺及质控点 Vero PHKC MRC-5 种毒 CTN PV ag PM 株 转瓶 细胞工厂 生物反应器 病毒培养 成品质量控 冷冻干燥 收获病毒液 保护剂研制 半成品质量控制 柱层析纯化 澄清过滤 超滤浓缩灭活

7 国内人用狂犬病疫苗生产工艺

8 我国人用狂犬病疫苗的质量管理 上市前 上市 上市后 制度及措施 疫苗上市许可 许可证制度 批签发制度 国家计划性抽验 法规 中华人民共和国药品管理法 中华人民共和国药品管理法实施条例 中华人民共和国药品注册管理办法 药品非临床试验质量管理规范 (GLP) 药品临床试验质量管理规范 (GCP) 中华人民共和国药典 药品生产质量管理规范 (GMP) 生物制品批签发管理办法 疫苗流通和预防接种管理条例 药品不良反应报告和监督管理办法. 法规 条列等等

9 年批签发情况

10 2011 年 年批签发批次和人份数及其变化 企业 辽宁成大 细胞基质 剂型 规格 批 人份 批 人份 批 人份 批 人份 批 人份 冻干 液体 长春长生 冻干 0.5 / / / / / / 液体 / / / / / / 宁波荣安 Vero 冻干 1.0 / / / / / / 液体 / / / / 广州诺诚冻干 吉林迈丰液体 河南远大 液体 1.0 / / / / / / 中科生物 PHKC 液体 1.0 / / / / / / / / 大连汉信 液体 / / 兰州所液体 / / / / / / 成都康华 MRC-5 冻干 1.0 / / / / / / 印度诺华 鸡胚细胞 冻干 / / / / / / 合计

11 我国人用狂犬病疫苗的质量控制 批签发 为了加强狂苗质量管理,2005 年 8 月国家药监局将狂犬病疫苗作为第一个二类疫苗纳入批签发管理 批签发前提 : 药品批文号 GMP 证 批签发方式 : 采用批记录摘要审查和实验室检验相结合 批记录审查 + 部分检验 ( 中检院 ) 批记录审查 + 全检检验 : 新申请批签发 工艺发生变更 质量出现偏差等 ( 中检院 ) 无菌和异常毒性检查 ( 授权的省药检所 ) 批批全检 ( 进口疫苗, 中检院 ) 依据 : 企业注册标准和国家药典

12 批签发依据 ( 冻干 ) 人用狂犬病疫苗 (vero 细胞 ) 质量标准 检验项目质量标准检验方法 鉴别试验采用酶联免疫法检查, 应证明含有狂犬病病毒抗原酶联免疫法 外观 应为澄明液体, 无异物 灯检法 水分 ( 冻干 ) 应不高于 3.0% 费休氏法 ph 值 7.2~8.0 电位法 效价测定 不低于 2.5IU/ 剂, 出厂标准 4.0IU/ 剂 NIH 法 牛血清白蛋白残留量 应不高于 50ng/ 剂 酶联免疫法 抗生素残留量 应不高于 50ng/ 剂 酶联免疫法 Vero 细胞 DNA 残留量 应不高于 100pg/ 剂 斑点杂交法 Vero 细胞宿主蛋白质残留量 应不高于 4μg/ 剂 酶联免疫法 无菌检查 应无菌生长 薄膜过滤法 异常毒性检查 接种小鼠和豚鼠, 结果判定时应动物健存, 体重增加, 动物法无异常反应 细菌内毒素应不高于 50EU/ 剂凝胶限度法

13 批签发依据 人用狂犬病疫苗 ( 地鼠肾细胞 ) 质量标准 检验项目质量标准检验方法 鉴别试验采用酶联免疫法检查, 应证明含有狂犬病病毒抗原酶联免疫法 外观应为澄明液体, 无异物灯检法 装量 应不低于标示量 重量法 ph 值 7.2~8.0 电位法 硫柳汞 应不高于 50μg/ml 滴定法 效价测定 不低于 2.5IU/ 剂, 出厂标准 4.0IU/ 剂 NIH 法 牛血清白蛋白残留量 应不高于 50ng/ 剂 酶联免疫法 抗生素残留量 应不高于 50ng/ 剂 酶联免疫法 地鼠肾细胞宿主蛋白质残留量应不高于 24μg/ 剂酶联免疫法 无菌检查应无菌生长薄膜过滤法 异常毒性检查 接种小鼠和豚鼠, 结果判定时应动物健存, 体重增加, 无异常反应 动物法 细菌内毒素应不高于 50EU/ 剂凝胶限度法 2015 年版中国药典 : 液体剂型人用狂犬病疫苗已经不再被收录

14 我国狂犬病疫苗标准与国际标准比较 (1) 编号检定项目 2010 年版中国药典欧洲药典 WHO 规程 毒种 生产用细胞 病毒收获液的病毒滴度病毒收获无菌和支原体检查 病毒收获液鉴别 ag 株 : PHK 或 Vero 细胞 CTN 株 :Vero 细胞生产 PM 株 : 人二倍体细胞, 国外引进 PV 株 : Vero, 国外引进 地鼠肾原代细胞 (PHK) Vero 细胞二倍体细胞 6.0logLD50 (Vero 细胞 ) 5.5logLD50(PHK 细胞 ) PM 株 :Vero 和二倍体细胞 Flury 株 : 鸡胚细胞 Vero 细胞二倍体细胞鸡胚原代细胞鸭胚需检测, 无标准 例举出的毒种 : CTN Vnukovo -32; PM Flury 全部推荐 要求测定, 不规定合格标准 无菌 支原体无检测项无菌 真菌 支原体 无要求 无检测项 要求鉴别实验, 确认为狂犬 病毒 14

15 我国狂犬病疫苗标准与国际标准比较 (2) 编号检定项目 2010 年版中国药典欧洲药典 WHO 规程 原液检定 病毒灭活验证病毒灭活验证病毒灭活验证 蛋白残留量 : 不高于 80µg/ 剂抗原含量 : ELISA 法检测, 按批准的标准执行 无检测项 免疫学方法, 检测糖蛋白含量, 在允许的限度内 无检测项 抗原含量 : EELISA 法检测糖蛋白 8 原液生产的一致性监测体系 无要求 无要求 要求 : 企业内部建立以病毒滴度和抗原含量为指标的生产一致性监测体系 15

16 我国狂犬病疫苗标准与国际标准比较 (3) 成品检定 检定项目 2010 年版中国药典欧洲药典 WHO 规程 ph 无检测项 无要求 硫柳汞 <100µg/ 剂, 冻干剂不允许添加加 无检测项 如添加则需检测, 按 NRA 标准执行 灭活剂 甲醛 100µg/ml 不要求 β- 丙内酯不检测 效价 出厂标准 4.0IU/ 剂效期内 2.5IU/ 剂 效期内 2.5IU/ 剂 效期内 2.5IU/ 剂批签发可做单一稀释度法 热稳定性 液体 :37 14 天冻干 :37 28 天效价仍 2.5IU/ 剂 无 不要求 抗生素残留 < 50ng/ 剂无不要求 宿主细胞蛋白残留 PHK:24 µg/ 剂 Vero:4 µg/ 剂 无要求 无要求 Vero 细胞 DNA 不高于 100pg/ 剂 原液中检测不高于 10ng/ 剂 原液中检测不高于 10ng/ 剂 16

17 批签发内容 批签发资料审核 -- 审查表 原材料 成品 趋势分析 生产全过程的控制

18 毒种 生产用毒种 : 获得国务院 CFDA 批准 ; 建立毒种三级种子库 : 原始种子批 主种子批 工作种子批, 并使用规定代次 : 来源 历史清楚 不同批的工作种子也不能混用 能满足制品质量可控性要求, 保证产品批间一直性的毒种库量 保存温度 时间应符合符合规定

19 细胞基质 人用狂犬病疫苗生产用细胞 : 原代地鼠肾细胞 Vero 细胞 : 人二倍体细胞 :MRC-5,2BS, KMB 生产用细胞基质 : 获得国务院 CFDA 批准 ; 建立细胞三级种子库, 原始细胞库 主细胞库 工作细胞库 每级库的代次应符合规定 ; 不能超过研究结果和国际上公认的最高限定代次 传代细胞超过一定代次后, 致瘤性会增强 ; 生产用原代细胞的动物有明确的规定 : 狂犬病疫苗生产用动物必须是清洁级或清洁级以上动物, 并符合实验动物微生物学及寄生虫学检测要求, 来自封闭式房所内饲养的动物, 须检测与使用动物相关的特殊病毒

20 要求 : 原辅料 辅料是经过国家审批的, 在标准里有要求 : 满足中国药典要求 若有 药用级 的原辅料, 就应该使用 药用级或者是 制定出符合产品生产和质量控制要求的标准 不得随意添加未经批准的添加物质, 如 Dnase 牛血清 : 应满足 中国药典 附录 XIII D 要求 支原体 病毒检查 细胞培养法 : 非血吸附法 血吸附法 免疫荧光抗体检查法 : 牛腹泻病毒 牛腺病毒 牛细 小病毒 呼肠孤病毒 狂犬病毒 牛副流感病毒 胰蛋白酶 : 应检测无外源病毒的污染 :PCV?

21 生产过程控制 生产过程必须符合 GMP 要求, 任何违犯 GMP 原则生产的制品, 即使符合 中国药典, 亦不能认为其符合规定 ; 生产的工艺应与批准的工艺一致 关键设备变更 规模放大应先完成相应的申报程序, 再变更生产 投入量 产出量需物料平衡

22 年 年制品质量分析 2011 年度 A 公司人用狂犬病疫苗效价 ED50 趋势分析 均值 +3SD 均值 +2SD 均值均值 -2SD 均值 -3SD 年度 A 公司人用狂犬病疫苗效价 ED50 趋势分析 均值 +3SD 均值 +2SD 均值均值 -2SD 均值 -3SD 2.40

23 2013 年 年制品质量分析 年度 A 公司人用狂犬病疫苗效价 ED50 趋势分析 均值 +3SD 均值 +2SD 均值均值 -2SD 均值 -3SD

24 2015 年制品质量分析

25 批签发检验的主要试验及频率 主要项目 : 效力试验 ph 值 DNA 残留量宿主细胞蛋白质残留量牛血清蛋白质残留量内毒素检查无菌检查 异常毒性检查 工艺稳定性 频率 : 按照规定随机抽检

26 人用狂犬病疫苗效价国家标准品 ED50 趋势分析 (1) 年度中检院人用狂犬病疫苗效价第七批国家标准品 ED50 趋势分析 均值 +2SD 均值 年度中检院人用狂犬病疫苗效价第八批国家标准品 ED50 趋势分析 均值 +3SD 均值 -2SD 均值 -3SD National 14 Institutes 15 for Food and Drug Control 均值 +3SD 均值 +2SD 均值 均值 -2SD 均值 -3SD 第七批标准品 ED50 2.0~2.90 第七批 第八批标准品 ED

27 人用狂犬病疫苗效价国家标准品 ED50 趋势分析 (2) 年度中检院人用狂犬病疫苗效价第八批国家标准品 ED50 趋势分析 均值 +3SD 均值 +2SD 均值 均值 -2SD 均值 -3SD 年度中检院人用狂犬病疫苗效价第八批国家标准品 ED50 趋势分析 均值 +3SD 均值 +2SD 均值 均值 -2SD 均值 -3SD

28 中检院对企业批签发抽验效力趋势分析

29 2011 年 年批签发检验出不合格情况 年份 不符合规定批数 3 批效力测定不符合规定 1 批效力测定不符合规定 3 批无菌检查不符合规定 4 批效价不符合规定 ; 1 批效价不符合规定 1 批宿主细胞蛋白残留量不符合规定

30 批签发结论 只有当批记录摘要审查和实验检验均符合规定了, 该批制品才能符合规定

31 对不符合规定产品的处理 中检院 / 授权药品检验机构 资料审查不符合 批签发不合格通知书 省药监局 监督 样品检验不符合 生产企业 不合格批次产品销毁 依据 生物制品批签发管理办法 ( 局令第 11 号 ) 销毁信息反馈 存档

32 2013 年狂犬病疫苗评价抽验总体结果 51 批 企业为 6 家 21 个省份 汉信 亚泰各 1 批 : 符合规定 检验项目 标准规定 辽宁依生 (17 批 ) 辽宁成大 (9 批 ) 广州诺城 (19 批 ) 吉林迈丰 (4 批 ) ph 值 7.2~8.0 符合规定符合规定符合规定符合规定 效价测定 (IU/ 剂 ) 2.5 符合规定符合规定符合规定符合规定 牛血清白蛋白残留量 (ng/ 剂 ) 抗生素残留量 (ng/ 剂 ) Vero 细胞 DNA ( pg/ 剂 ) Vero 细胞宿主蛋白 (μg/ 剂 ) 50 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 50 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 100 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 4 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 2013 年国家评价性抽验结果全合格, 说明我国狂犬病疫苗质量是得到了提高

33 近几年国家抽验结果比较 年份 抽检批次 抽检率 (%) 涉及企业数 涵盖省份 检验合格 不合格批 % 3 批 % 2 批 % 无 2013 年国家评价性抽验结果全合格, 说明我国狂犬病疫苗质量是得到了提高

34 问题 2013 年国抽结果与批签发效价结果比较提示 企业 A 制品稳定性? 效期合理性?

35 谢谢

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