西药成分, 混合使用镇静剂, 中毒的可能性会更大目前, 有关镇静催眠类保健食品中非法添加化学成分的现象已经受到了社会的广泛关注镇静剂类药物的测定方法主要有薄层色谱法 (TLC) [3] 酶联免疫分析法 (ELISA) [4] 高效液相色谱法 (HPLC) [5 8] 气相色谱串联质谱法 (GC

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参西酆
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1 犇犗犐 : / 犾犺犼狔犺狓超高效液相色谱串联质谱法测定保健食品中 7 种非法添加的化学镇静剂王璐 1,2,3 (1. 辽宁省分析科学研究院, 沈阳 ; 2. 辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心, 沈阳 ; 3. 辽宁省分析测试技术研究重点实验室, 沈阳 ) 摘要 : 采用固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定保健食品中 7 种非法添加的化学镇静剂的含量保健食品样品以甲醇为溶剂进行提取, 经高速离心处理后, 取上清液, 经 OasisMCX 固相萃取柱净化所得净化液以 Zorbax SB C18 色谱柱为分离柱, 以不同体积比的 0.1%( 体积分数 ) 甲酸溶液和乙腈混合液为流动相进行梯度洗脱, 采用电喷雾正离子源多反应监测模式检测 7 种的质量浓度均在 0.10~30.0μg L -1 范围内与其峰面积呈线性关系, 方法的测定下限 (10S/N) 在 0.1~2.1μg kg -1 之间在 0.30,3.0,10.0μg L -1 等 3 个浓度水平进行加标回收试验, 在 76.7%~104% 之间, 测定值的相对标准偏差 ( 狀 =6) 在 2.1%~9.8% 之间关键词 : 超高效液相色谱串联质谱法 ; 固相萃取 ; 保健食品 ; 化学镇静剂中图分类号 :O 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 犝犘犔犆犕犛 / 犕犛犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 7 犐犾犲犵犪犾狔犃犱犱犲犱犆犺犲犿犻犮犪犾犛犲犱犪狋犻狏犲狊犻狀犎犲犪犾狋犺犆犪狉犲犉狅狅犱 1,2,3 犠犃犖犌犔狌 (1. 犔犻犪狅狀犻狀犵犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃狀犪犾狔狋犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲, 犛犺犲狀狔犪狀犵 , 犆犺犻狀犪 ; 2. 犔犻犪狅狀犻狀犵犚犲狊犲犪狉犮犺犆犲狀狋犲狉狅犳犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔狅犳犛狋犪狀犱犪狉犱犻狕犪狋犻狅狀犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀, 犛犺犲狀狔犪狀犵 , 犆犺犻狀犪 ; 3. 犔犻犪狅狀犻狀犵犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犃狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犜犲狊狋犻狀犵犜犲犮犺狀犻狇狌犲狊, 犛犺犲狀狔犪狀犵 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 : UPLC MS /MSwasappliedtothedeterminationof7ilegalyaddedsedativedrugsinhealthfoods withsolidphaseextraction.thehealth carefoodsample wasextracted with methanol,andafterhigh speed centrifugation,thesupernatantwastakenandpurifiedonoasismcxspesolumn.zorbax SB C18chromatographic columnwasusedasstationaryphase,andmixturesof0.1% ( φ )formicacidsolutionandacetonitrileinvarious ratioswereusedasmobilephaseingradientelution.esi + andmulti reactionmonitoringwereadoptedinms/ms. Linearrelationshipsbetweenvaluesofpeakareaandmassconcentrationofthe7compoundswerekeptinthesame rangeof μg L -1,withlowerlimitsofdetermination(10S/N)intherangeof μg kg -1. Testsforrecoveryandprecisionweremadebystandardadditionmethodattheconcentrationlevelsof0.30,3.0, 10.0μg L -1,givingvaluesofrecoveryand s( 狀 =6)intherangesof76.7%-104% and2.1%-9.8% respectively. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : UPLC MS /MS;Solidphaseextraction;Health carefood;chemicalsedatives 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 辽宁省自然科学基金 ( ) 作者简介 : 王璐 (1982-), 女, 辽宁沈阳人, 助理研究员, 主要从事食品安全检查工作 E mail:wanglushenyang@163.com 近年来保健食品产业发展迅速, 但有一些不良商家在号称纯中药制剂的保健品中添加了化学类镇静剂, 长期服用会不可避免地存在药物的副作 [1 2] 用此外, 一些商家在保健食品中添加不止一种 629

2 西药成分, 混合使用镇静剂, 中毒的可能性会更大目前, 有关镇静催眠类保健食品中非法添加化学成分的现象已经受到了社会的广泛关注镇静剂类药物的测定方法主要有薄层色谱法 (TLC) [3] 酶联免疫分析法 (ELISA) [4] 高效液相色谱法 (HPLC) [5 8] 气相色谱串联质谱法 (GC MS/ MS) [9 11] 及高效液相色谱串联质谱法 (HPLC MS/ MS) [12 15] 等其中 TLC GC MS/MS 和 HPLC MS/MS 等方法的灵敏度较低, 容易受到复杂基质的干扰, 选择性和特异性均较差 ;GC MS/MS 需要进行衍生化, 处理方法相对复杂已报道的 HPLC MS/MS, 缺少对提取液的净化过程, 且对于复杂基质保健食品的分析缺少针对性样品前处理方法的选择直接影响基质效应, 提取净化较差的方法, 会放 [16 17] 大基质效应, 对目标的分析产生干扰, 并 [18 19] 影响测试结果的准确性因此有必要选择较理想的样品前处理方法来减少基质效应的影响按照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准文件 , 中的样品处理方法, 样品要沉淀过夜, 处理时间较长, 且需使用大量的有害物质三氯甲烷本工作采用固相萃取技术建立了超高效液相色谱串联质谱法 (UPLC MS/MS) 测定保健食品中常见和常检的 7 种镇静剂类药物含量的方法 1 试验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent1200LC/6410BMS/MS 型液相色谱三重四极杆串联质谱仪 ;Q3200DB 型超声清洗器 ; Beckman 型高速冷冻离心机 ;HSC 12A 型氮气吹干仪 ;OasisMCX 固相萃取柱 (150mg/6mL) 标准储备溶液 :1.00g L -1, 称取三唑仑阿普唑仑艾司唑仑地西泮硝西泮奥沙西泮和氯氮卓标准品各 10.0mg, 用甲醇溶解并定容至 10mL 棕色容量瓶中, 于 -20 保存混合标准溶液 :100mg L -1, 移取上述各标准储备溶液用甲醇稀释配制而成乙腈甲醇和甲酸为色谱纯, 盐酸和氨水为分析纯, 试验用水为超纯水 1.2 仪器工作条件 1) 色谱条件 Zorbax SB C18 色谱柱 (2.1mm 150mm,3.5μm), 柱温 30 ; 流量为 0.3 ml min -1 ; 进样量 10μL 流动相 :A 为 %( 体积分数, 下同 ) 甲酸溶液,B 为乙腈梯度洗脱程序 :0~1min 时,A 为 80%;1~3min 时,A 由 80% 降至 50%;3~8 min 时,A 由 50% 降至 20%;8~10min 时,A 由 20% 升至 80% 2) 质谱条件电喷雾离子源 (ESI), 正离子电离模式 ; 干燥气温度 350, 干燥气流量 9.0L min -1 ; 电喷雾电压 4000V, 扫描方式为多反应监测 (MRM), 其他质谱参数见表 1, 其中为定量离子母离子表 1 犜犪犫.1 质荷比犿 / 狕质谱参数犕犛狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊子离子锥孔电压 /V 碰撞能量 /V 三唑仑 , ,20 阿普唑仑 , ,30 艾司唑仑 , ,15 地西泮 , ,25 硝西泮 , ,20 奥沙西泮 , ,20 氯氮卓 , , 试验方法 1) 样品提取取供试品 ( 片剂 : 取数片, 研细 ; 胶囊剂 : 取数粒, 倾取内容物, 研细 ; 口服液直接量取 ), 称取试样 g( 或移取 0.50mL) 于 50mL 离心管中, 加入甲醇 10 ml, 超声处理 10 min, 以 12000r min -1 转速高速离心 10 min, 取上层清液, 并用盐酸调节 ph 至 3~4 2) 样品净化 OasisMCX 固相萃取柱依次用甲醇水和 0.1mol L -1 盐酸溶液各 6mL 进行活化, 将上清液过柱, 弃去流出液, 用甲醇和水各 4mL 淋洗, 再用 5%( 体积分数, 下同 ) 甲醇氨溶液 6mL 洗脱, 氮气吹干洗脱液, 用初始比例流动相 1mL 溶解, 过 0.2μm 微孔滤膜, 上清液按仪器工作条件进行测定 2 结果与讨论 2.1 质谱行为 7 种镇静剂的二级质谱图见图液相条件的选择试验分别考察了流动相为甲醇水, 乙腈水体系时的离子化效率和分离效果结果表明 : 使用甲醇水体系作为流动相时, 地西泮阿普唑仑和三唑仑的峰形较宽, 且保留时间较长 ; 使用乙腈水体系

3 (a) 三唑仑 (b) 阿普唑仑 (c) 艾司唑仑 (d) 地西泮 (e) 硝西泮 (f) 奥沙西泮图 1 二级质谱图 Fig.1 MS 2 spectra (g) 氯氮卓作为流动相时, 色谱峰峰形对称, 基线稳定, 可实现的分离在流动相中添加低浓度的甲酸后, 可促进各组分在 ESI + 时的离子化, 提高质谱测定的灵敏度流动相中甲酸的体积分数为 0.1%,0.5%,1% 时, 各组分的峰面积变化不大综合考虑, 试验选择以乙腈和 0.1% 甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱 2.3 固相萃取条件的选择固相萃取柱试验考察了 OasisHLB Oasis MCX 和 Bond Elut Al N 等 3 种不同类型的固相萃取小柱对空白加标样品 ( 加标水平为 3μg L -1 ) 的提取的影响结果发现 : 目标在 BondElut Al N 小柱上几乎无保留 ; 用 OasisHLB 小柱, 上样速度慢, 柱子堵塞现象比较明显, 不理想 ; 用 Oasis MCX 小柱,7 种镇静剂的提取效果较理想试验选择 OasisMCX 固相萃取小柱作为分析柱样品提取液的酸度 OasisMCX 固相萃取柱的填料是一种混合型强阳离子交换吸附剂, 对于碱性具有良好的净化效果通常需要调节上样溶液呈酸性, 使碱性保持阳离子状态, 与萃取柱的填料发生相互作用然后用水甲醇淋洗, 除去弱酸性和中性, 最后用 5% 甲醇氨溶液调节 ph 为碱性, 此时, 目标为中性从而被洗脱下来试验考察了上样溶液的酸度对固相萃取的影响, 结果见图 2 由图 2 可知 : 将上样溶液的 ph 调至酸性后, 7 种中除了奥沙西泮外, 其余 6 种的 631

4 1-pH3;2-pH4;3-pH5;4-pH2;5-pH1 图 2 上样溶液不同酸度对 7 种镇静剂的影响 Fig.2 Efectofdiferentacidityofloadingsolutionon valuesofrecoveryof7sedatives 均有不同程度的提高但酸度过低, 即 ph 在 1~2 之间时, 氯氮卓和三唑仑在固相萃取柱上几乎无保留, 仅为 10% 左右当上样溶液为弱酸性 (ph 5) 时, 阿普唑仑的提取回率较低, 仅为 50% 只有当 ph 调至 3~4 时,7 种镇静剂药物的才能获得满意的结果试验选择用盐酸调节 ph 至 3~ 洗脱剂的用量各目标的加标水平为 3μg L -1 时, 试验考察了洗脱剂 (5% 甲醇氨溶液 ) 用量分别为 3, 6,9,12mL 时对其提取的影响, 每个用量水平重复测定 3 次, 结果见表 2 表 2 洗脱剂洗脱体积对 7 种镇静剂的影响 ( 狀 =3) 犜犪犫.2 犈犳犲犮狋狅犳犲犾狌狋犻狅狀狏狅犾狌犿犲狅犳狋犺犲犲犾狌犪狀狋狅狀狏犪犾狌犲狊狅犳狉犲犮狅狏犲狉狔狅犳 7 狊犲犱犪狋犻狏犲狊 3mL 6mL 9mL 12mL 三唑仑阿普唑仑艾司唑仑地西泮硝西泮奥沙西泮氯氮卓由表 2 可知 : 当甲醇氨溶液的用量为 3mL 时, 各的偏低 ; 当甲醇氨溶液的用量为 6mL 时, 各的较好 ; 当用量超过 6mL 时, 各的无明显增加综合考虑, 试验选择洗脱剂的用量为 6mL 2.4 净化效果的比较将空白片剂胶囊剂和口服液混合后作为空白基质试验比较了在空白基质中加入 1μg L -1 混合标准溶液后, 甲醇提取液的色谱图和经 Oasis MCX 固相萃取柱净化后的色谱图, 结果见图 3 (a) 加标提取液净化前 (b) 加标提取液净化后 1- 氯氮卓 ;2- 奥沙西泮 ;3- 硝西泮 ;4- 艾司唑仑 ;5- 三唑仑 ;6- 阿普唑仑 ;7- 地西泮图 3 总离子流图 Fig.3 TICchromatograms 由图 3 可知 : 经固相萃取后净化效果显著, 有效地降低了基质的干扰, 各的峰高明显增加 632

5 2.5 绝对基质效应的比较基质效应较大时会影响方法的准确性, 给测定 [18] 带来误差因此,LC MS/MS 分析时必须考察 [20] 基质效应试验分别选择 3 组含有相同质量浓度的混合标准溶液系列, 即纯溶剂标准系列组 (a), 经固相萃取 (SPE) 净化的空白基质标准系列组 (b) 和未经过净化的空白基质配制标准系列 (c), 比较了 0.30,3.0,10.0μg L -1 等 3 个加标水平目标的色谱峰面积, 按公式 (1) 和 (2) 计算净化后的绝对基质效应 ( 犈 1) 和未净化的绝对基质效应 ( 犈 2) 犈 1 = 犃 b/ 犃 a 100% (1) 犈 2 = 犃 c/ 犃 a 100% (2) 式中 : 犃 a 为纯溶剂标准溶液的色谱峰面积 ; 犃 b 为经 SPE 净化的空白基质标准溶液的色谱峰面积 ; 犃 c 为未经净化的空白基质标准溶液的色谱峰面积结果见表 3 表 3 净化后与未净化的基质效应比较犜犪犫.3 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犿犪狋狉犻狓犲犳犲犮狋狊狑犻狋犺犪狀犱狑犻狋犺狅狌狋犛犘犈狆狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀加标量 ρ /( μg L -1 ) 未经纯化处理基质效应固相萃取处理三唑仑 ± ± ± ± ± ±3.8 阿普唑仑 ± ± ± ± ± ±7.6 艾司唑仑 ± ± ± ± ± ±7.7 地西泮 ± ± ± ± ± ±6.8 硝西泮 ± ± ± ± ± ±6.1 奥沙西泮 ± ± ± ± ± ±8.1 氯氮卓 ± ± ± ± ± ±5.8 由表 3 可知 : 未经净化的基质效应在 39.3%~ 85.5% 之间, 存在明显的基质抑制效应 ; 经 SPE 柱净化后, 基质效应在 87.2%~105% 之间, 基质干扰相对较小试验采用基质加标法进行定量分析 2.6 标准曲线和测定下限移取空白基质溶液配制 0.10,0.30,1.0,3.0, 10.0,30.0μg L -1 的混合基质标准溶液, 以各的定量离子对的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线结果表明 : 各的质量浓度均在 0.10~ 30.0μg L -1 范围内呈线性, 其线性回归方程相关系数和测定下限 (10S/N) 见表 4 表 4 线性参数与测定下限犜犪犫.4 犔犻狀犲犪狉犻狋狔狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊犪狀犱犾狅狑犲狉犾犻犿犻狋狊狅犳犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀线性回归方程相关系数测定下限狑 /( μ g kg -1 ) 三唑仑狔 =134.5 狓阿普唑仑狔 =189.3 狓艾司唑仑狔 =383.4 狓地西泮狔 =456.1 狓硝西泮狔 =134.7 狓奥沙西泮狔 =283.1 狓氯氮卓狔 =95.31 狓精密度与回收试验向空白样品中添加 3 个浓度水平的混合标准溶液并进行测定, 结果见表 5 表 5 精密度和回收试验结果 ( 狀 =6) 犜犪犫.5 犚犲狊狌犾狋狊狅犳狋犲狊狋狊犳狅狉狆狉犲犮犻狊犻狅狀犪狀犱狉犲犮狅狏犲狉狔加标量回收量 ρ /( μg L -1 ) ρ /( μg L -1 ) 三唑仑阿普唑仑艾司唑仑地西泮硝西泮奥沙西泮氯氮卓

6 由表 5 可知 :7 种的在 76.7%~ 104% 之间, 相对标准偏差在 2.1%~9.8% 之间 2.8 样品分析按试验方法测定了市售多个品牌和不同批次的 28 批具有镇静安神催眠功效的保健食品, 结果表明 7 种镇静剂均未检出本工作建立了固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定保健食品中 7 种镇静剂含量的方法本法采用固相萃取提高净化效果和检测灵敏度, 减少了有毒试剂的使用, 缩短了分析时间方法灵敏度高重现性好实用性强, 能满足国家标准检测的要求, 具有很好的实际应用价值参考文献 : [1] 谢梅, 戴德银, 徐力. 镇静催眠药的临床应用进展 [J]. 现代医药卫生,2006,22(20): [2] 朱正东, 肖水源. 苯二氮 ( 卓 ) 类药物使用现状分析 [J]. 中国药物依赖性杂志,2011,20(5): [3] 肖丽和, 刘吉金, 关潇滢, 等. 镇静安神类中成药及保健食品中非法添加化学成分的快速筛查方法研究 [J]. 中国当代医药,2009,16(14): [4] HUANG W,MOODY D.Immunoassaydetectionof benzodizepinesandbenzodiazepinmetebolitesinblood [J].JournalofAnalyticalToxicology,1995,19(6): [5] 林芳, 李涛, 李继, 等.HPLC DAD 法快速测定改善睡眠类保健食品中违法添加的 14 种精神药物 [J]. 食品科学,2013,34(22): [6] HEH,SUNC,WANGXR,etal.Solid phaseex tractionofmethadoneenantiomersandbenzodiazepines inbiologicalfluidsbytwopolymericcartridgesforliq uidchromatographicanalysis[j].journalofchroma tographyb,2005,25(2): [7] LAURA M,FRANCESCAB,EMSTK,etal.Simul taneous determination of the antipsychotic drugs levomepromazineandclozapineandtheirmainmetabo litesinhumanplasmabya HPLC UV method with solid phaseextraction[j].journalofchromatography B,2007,846: [8] MARIAE,DEVASISH B.Directinjection micelar liquid chromatographic determination of benzodiaz epinesinserum[j].journalofchromatographyb, 2002,25(2): [9] 朱小红, 马鹏飞, 徐翔. 气相色谱质谱联用定性检测保健食品和中成药中非法添加的镇静催眠类药物 [J]. 中国药业,2012,21(19): [10] PAPOUTISISII,ATHANASELIS S A, NIKO LAOUPA,etal.Developmentandvalidationofan EI GC MSmethodforthedeterminationofbenzodiaz epinedrugsandtheirmetabolitesinblood:applica tionsinclinicalandforensictoxicology[j].journalof Pharmaceuticaland Biomedical Analysis,2010,52 (4): [11] 王占良, 张建丽, 张亦农. 气相色谱质谱联用法检测保健品中 8 种安眠镇静类药物 [J]. 质谱学报,2009, 30(5): [12] 朱琳, 阮丽萍, 刘华良, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定保健食品中的 23 种精神药品 [J]. 色谱,2013,31 (7): [13] SIMONSENK W,HERMANSSON S,STEENTOFT A,etal.Avalidatedmethodforsimultaneousscreen ingandquantificationoftwenty threebenzodiazepines andmetabolitespluszopicloneandzaleploneinwhole bloodbyliquid liquidextractionandultra perform anceliquidchromatography tandem massspectrome try[j].journalofanalyticaltoxicology,2010,34 (6): [14] 芦丽, 宫旭, 谭力. 高效液相色谱离子阱质谱法快速筛查改善睡眠类保健食品中非法添加的 24 种镇静催眠药 [J]. 色谱,2015,33(3): [15] 潘小红. 超高效液相飞行串联质谱检测改善睡眠类保健食品中 22 种非法添加化学物质方法的研究 [J]. 食品安全质量检测学报,2014,5(5): [16] 王立琦, 贺利民, 曾振灵, 等. 液相色谱串联质谱检测兽药残留中的基质效应研究进展 [J]. 质谱学报, 2011,32(6): [17] 周莉, 王新全, 徐浩, 等. 液相色谱串联质谱法测定叶菜类蔬菜中 16 种农药的基质效应的研究 [J]. 理化检验化学分册,2011,47(12): [18] 向平, 沈敏, 卓先义. 液相色谱质谱分析中的基质效应 [J]. 分析测试学报,2009,28(6): [19] 史俊文. 液相色谱串联质谱外标法定量分析中基质效应的评估 [J]. 理化检验化学分册,2012,48(11): [20] KINGAR,BORTFIGLIOA R,FERNANDEZ MET ZLERC,etal.Mechanisticinvestigationofionization suppressioninelectrosprayionization[j].journalof AmericanSocietyfor MassSpectrometry,2000,11 (11):

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