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蜃全
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1 生物工程学报 Chinese Journal of Biotechnology DOI: /j.cjb February 25, 2015, 31(2): Chin J Biotech, All rights reserved 工业生物技术 231 絮凝基因 FLO1 及 FLO1c 高表达提高工业酿酒酵母乙酸耐受性及发酵性能杜昭励 1,2, 程艳飞 1, 朱卉 1,2, 何秀萍 1, 张博润 1 1 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室, 北京中国科学院大学, 北京杜昭励, 程艳飞, 朱卉, 等. 絮凝基因 FLO1 及 FLO1c 高表达提高工业酿酒酵母乙酸耐受性及发酵性能. 生物工程学报, 2015, 31(2): Du ZL, Cheng YF, Zhu H, et al. Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance of industrial Saccharomyces cerevisiae by overexpression of flocculent gene FLO1 and FLO1c. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 摘要 : 乙酸是生物质乙醇发酵过程中酵母细胞面临的重要抑制剂之一, 对细胞生长及发酵性能有强烈的抑制作用增强酵母菌对乙酸胁迫的耐受性对提高乙醇产率具有重要意义用分别带有完整絮凝基因 FLO1 及其重复序列单元 C 发生缺失的衍生基因 FLO1c 的重组表达质粒分别转化非絮凝型工业酿酒酵母 CE6, 获得絮凝型重组酵母菌株 6-AF1 和 6-AF1c 同时以空载体 pycpga1 转化 CE6 的菌株 CE6-V 为对照菌株与 CE6-V 相比, 絮凝酵母明显提高了对乙酸胁迫的耐受性在 0.6% (V/V) 乙酸胁迫下,6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产率分别为对照菌株 CE6-V 的 1.56 倍和 1.62 倍 ; 在 1.0% (V/V) 乙酸胁迫下,6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产率分别为对照菌株 CE6-V 的 1.21 倍和 1.78 倍可见絮凝能力改造能明显提高工业酿酒酵母的乙酸胁迫耐受性及发酵性能, 而且 FLO1 内重复序列单元 C 缺失具有更加明显的效果关键词 : 工业酿酒酵母, 絮凝基因 FLO1c, 乙酸胁迫耐受性, 发酵性能 Received: May 9, 2014; Accepted: May 23, 2014 Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA022106). Corresponding author: Xiuping He. Tel: ; hexp@im.ac.cn 国家高技术研究发展计划 (863 计划 ) (No. 2012AA022106) 资助

2 232 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2015 Vol.31 No.2 Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance of industrial Saccharomyces cerevisiae by overexpression of flocculent gene FLO1 and FLO1c Zhaoli Du 1,2, Yanfei Cheng 1, Hui Zhu 1,2, Xiuping He 1, and Borun Zhang 1 1 CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing , China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing , China Abstract: Flocculent gene FLO1 and its truncated form FLO1c with complete deletion of repeat unit C were expressed in a non-flocculent industrial strain Saccharomyces cerevisiae CE6 to generate recombinant flocculent strains 6-AF1 and 6-AF1c respectively. Both strains of 6-AF1 and 6-AF1c displayed strong flocculation and better cell growth than the control strain CE6-V carrying the empty vector under acetic acid stress. Moreover, the flocculent strains converted glucose to ethanol at much higher rates than the control strain CE6-V under acetic acid stress. In the presence of 0.6% (V/V) acetic acid, the average ethanol production rates of 6-AF1 and 6-AF1c were 1.56 and 1.62 times of that of strain CE6-V, while the ethanol production rates of 6-AF1 and 6-AF1c were 1.21 and 1.78 times of that of strain CE6-V under 1.0% acetic acid stress. Results in this study indicate that acetic acid tolerance and fermentation performance of industrial S. cerevisiae under acetic acid stress can be improved largely by flocculation endowed by expression of flocculent genes, especially FLO1c. Keywords: industrial Saccharomyces cerevisiae, flocculen gene FLO1c, acetic acid tolerance, fermentation performance 随着资源能源和环境问题的日益呈现, 以生物质为原料通过生物转化生产能源产品及高值化学品受到高度关注 [1] 作为生物技术领域非常重要的微生物之一, 酵母菌在生物质高效转化方面的应用一直是相关领域关注的热点 [2-3] 在生物质原料预处理过程中产生的弱酸类醛类和酚类等抑制物对细胞生长和代谢具有抑制作用其中弱酸类化合物中的乙酸含量最高乙酸由木质纤维素预处理过程中半纤维素脱乙酰作用生成, 终浓度大约在 1 10 g/l [4-5] 当培养基的 ph 值低于乙酸的解离常数 (pka 4.76) 时, 分子态的乙酸可通过自由扩散或水甘油通道蛋白 Fps1p 以及转运蛋白 Ady2p 和 Jen1p 转运入酵母细胞内 [6-7], 从而导致胞内环境酸化及乙酸根阴离子的积累, 严重抑制细胞的生长和代谢因此增强酵母菌的乙酸胁迫耐受性对提高底物利用率和产物产率具有重要意义 [8-9] 酵母菌絮凝是指酵母细胞之间相互聚集形成絮状或颗粒状细胞团, 并迅速沉降到发酵液底部的一种生理特性, 絮凝的发生是一种无性的钙依赖的可逆的过程良好的絮凝特性有利于工业发酵过程中酵母细胞和发酵液的有效分离, 因此对简化生产工艺降低生产成本提高产品品质具有重要意义 [10-13] 絮凝的发生依赖于絮凝蛋白与邻近细胞表面寡聚甘露糖链间的结合,FLO1 是酿酒酵母中典型的絮凝蛋白编码基因, 含有大量衔接重复序列, 根据其编码氨基酸序列的一致性, 这些重复序列可以划

3 233 分为 A B C 和 D 4 个重复单元 [14] 重复序列是基因内高度活跃的成分, 通过驱动基因内或基因间的滑移和重组, 改变基因内重复序列的数量或排列方式, 从而影响絮凝蛋白的结构和功能 [14-15] 分别缺失 FLO1 内部重复序列单元 B C D 提高了絮凝蛋白的构象稳定性, 使酵母细胞絮凝特性表现出对环境酸碱变化的广泛适应性 [16-17] 经乙醇胁迫两性霉素 B 或过氧化氢处理后, 絮凝酵母的细胞存活率是非絮凝酵母的倍 [18], 表明絮凝也可能是细胞抵抗有害环境的一种保护机制絮凝是否能赋予酵母菌对其他环境胁迫的耐受性, 以及重复序列变化引发的絮凝特性变化是否影响酵母菌应对环境胁迫的能力目前还不清楚本研究将完整 FLO1 基因与 FLO1 内重复单元 C 缺失的衍生基因 FLO1c 在工业酿酒酵母中进行表达, 分析比较其对工业酿酒酵母胁迫耐受性及发酵性能的影响 1 材料与方法 1.1 菌株质粒和培养基本研究所用菌株和质粒见表 1 表 1 本研究所用菌株及质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study Plasmids/strains Description Source or reference Plasmids YCp50 Escherichia coli-saccharomyces cerevisiae shuttle vector, Amp r, URA3, CEN4 This laboratory pfa6a-kanmx6 Amplify G418 resistant gene KanMX6 This laboratory pycf1 Amplify the coding sequence and terminator of FLO1 [17] pycf1c Amplify the coding sequence and terminator of FLO1c [17] pycpg Insert KanMX6 in YCp50 at SalⅠand ApaⅠsites This work pycpga1 Insert the promoter of ADH1 in pycpg at EcoRⅠand BamHⅠsites This work pygaf1 pygaf1c Strains E. coli DH5α Saccharomyces cerevisiae Insert the coding sequence and terminator of FLO1 in pycpga1 at BamHⅠ and SalⅠsites Insert the coding sequence and terminator of FLO1c in pycpga1 at BamHⅠ and SalⅠsites supe44 lacu169 (φ80lacz M15) hsdr17 reca1 enda1 gyra96 thi-1 rela1 This work This work This laboratory YS59 MATα FLO1 leu2-3,112 his4-519 trp1-719 ura3-52 This laboratory CE6 Non-flocculent industrial S. cerevisiae This laboratory CE6-V CE6 with vector pycpga1 This work 6-AF1 CE6 with plasmid pygaf1 This work 6-AF1c CE6 with plasmid pygaf1c This work cjb@im.ac.cn

4 234 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2015 Vol.31 No.2 大肠杆菌保存和培养用 LB 培养基 [19], 筛选大肠杆菌转化子用含 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基 ; 酵母菌常规培养用 YPD 培养基 [20], 筛选酿酒酵母转化子用含 500 μg/ml G418 的 YPD 培养基, 比较不同乙酸浓度下细胞生长时, 将 YPD 培养基 ph 调到 4.5; 发酵培养基为 EFM 培养基 (100 g/l 葡萄糖,6 g/l 酵母粉,10 g/l 蛋白胨,5 g/l 尿素,1 g/l 磷酸二氢钾,15 g/l 硫酸镁,0.55 g/l 无水氯化钙 ) 1.2 主要试剂和工具酶高保真 DNA 聚合酶 KOD 及三磷酸脱氧核苷酸混合物 (dntps) 购自 TOYOBO 公司,T4 DNA 连接酶和限制性内切酶购自 TaKaRa 公司, DNA marker 购自全式金公司,DNA 胶回收试剂盒和 PCR 产物回收试剂盒购自 Axygen 公司, 酵母菌质粒提取试剂盒购自 Bio-tek 公司, 氨苄青霉素购自华北制药股份有限公司,G418 购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司, 其他试剂均为国产分析纯试剂 1.3 DNA 操作和序列分析大肠杆菌感受态细胞制备转化及质粒 DNA 的提取参照文献 [19] 进行酵母菌基因组 DNA 提取及完整细胞转化参照文献 [20] 进行使用 OMEGA 酵母质粒提取试剂盒 (Bio-tek, 美国 ) 提取酵母菌质粒絮凝基因表达水平分析参照文献 [21] 进行引物合成序列测定由 Invitrogen 公司完成 1.4 重组表达质粒构建本研究所用引物序列见表 2, 以质粒 pfa6a- KanMX6 为模板, 利用引物 Kan-F 和 Kan-R 进行 PCR 扩增, 获得约 1.5 kb 的 KanMX6, 经 SalⅠ 和 ApaⅠ 酶切后的 KanMX6 插入到载体 YCp50 上, 获得重组表达质粒 pycpg 以酿酒酵母 YS59 的基因组为模板, 利用引物 ADH-F 和 ADH-R 克隆 ADH1 启动子序列, 经 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 酶切后, 插入到质粒 pycpg 获得重组质粒 pycpga1 分别以质粒 pycf1 和 pycf1c 为模板, 利用引物 FLO1-F 和 FLO1-R 分别克隆到完整 FLO1 及其衍生基因 FLO1c 的编码序列和终止子序列, 将其连接到载体 pycpga1 的 BamHⅠ 和 SalⅠ 酶切位点之间, 分别获得重组表达质粒 pygaf1 和 pygaf1c 表 2 本文所用引物 Table 2 Primers used in this study Primers Kan-F Kan-R ADH-F ADH-R FLO1-F FLO1-R Sequence (5 3 ) a CGCGTCGACAGGCGCGCCAGATCTGTT TAGC GACGGGCCCGCGCCGTTAGTATCGAAT CGGAC GACGAATTCCATAACCGCT AGAGTACTTTGAAGA GACGGATCCTGTATATGAGATAGTTGAT TGTATG GACGGATCCATGACAATGCCTCATCGCT ATATGT GACGTCGA CGCATTTTTCCTCGTTAATAATAAGT a Restriction sites are underlined. 1.5 酵母菌絮凝能力测定絮凝能力的常规测定参照文献 [17] 进行, 所用非絮凝缓冲液为 50 mmol/l 乙酸钠 (ph 4.5), 絮凝缓冲液为含 6.8 mmol/l 氯化钙的 50 mmol/l 乙酸钠 (ph 4.5) 测定乙酸对酵母菌絮凝影响时, 在菌悬液中分别添加不同浓度乙酸 1.6 酵母菌胁迫耐受性分析活化后的酵母菌接种于 2 ml YPD 培养基

5 235 中, r/min 培养 16 h, 离心收集细胞, 经无菌水洗涤两次后, 细胞重悬于 2 ml 无菌水中, 并进行梯度稀释, 室温下静置 2 h 将 5 μl 稀释度分别为的菌悬液接种于含不同浓度乙酸乙醇或糠醛的 YPD 平板上,30 培养 2 d, 记录各菌株生长情况参照文献 [22] 分析比较各菌株在液体培养基中的乙酸胁迫耐受性将活化后的酵母菌接种于 50 ml YPD 培养基中, r/min 培养 18 h, 以初始接种 OD 600 为 0.15 的接种量分别转接到 50 ml 含有不同浓度乙酸的 YPD 培养基 (ph 4.5) 中, r/min 培养, 定时取样测定细胞干重, 绘制生长曲线分别取对数早期中期和后期的数据进行分析, 以 (AM/AW)/(BM/BW) 的比值表示不同菌株的乙酸胁迫耐受性, 其中 AM 是重组菌株在乙酸胁迫条件下的细胞干重,AW 是对照菌株在乙酸胁迫条件下的细胞干重,BM 是重组菌株在无乙酸 2 结果与分析 2.1 絮凝基因在工业酿酒酵母中的表达分别用空载体 pycpg 带有完整絮凝基因 FLO1 及重复序列单元 C 缺失衍生基因 FLO1c 的重组表达质粒 pygaf1 和 pygaf1c 转化工业酿酒酵母 CE6, 在含 500 μg/ml G418 的 YPD 培养基上筛选转化子对转化子进行 G418 抗性比较絮凝能力目测酵母菌质粒提取和 PCR 分析, 以及絮凝基因表达水平分析, 获得具有相同 G418 抗性和絮凝基因 FLO1 FLO1c 表达水平的重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 各 6 株, 以及 3 株带有空载体的对照菌株 CE6-V 絮凝能力分析结果表明, 宿主菌 CE6 及空载体转化菌株 CE6-V 均没有表现出絮凝特性, 而重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 均表现出明显的絮凝特性, 絮凝能力约为酵母菌株 YS59 的 1.5 倍 ( 图 1) 检测的 6 株 6-AF1 之间絮凝能力没有明胁迫时的细胞干重, 而 BW 是对照菌株在无乙酸胁迫时的细胞干重 1.7 酵母菌发酵性能分析将活化后的酵母菌接种于 50 ml YPD 培养基中, r/min 培养 18 h, 以初始接种 OD 600 为 1.0 的接种量分别转接到 100 ml 含有 0,0.6%,0.8% 或 1.0% (V/V) 乙酸的 EFM 培养基 (ph 4.5) 中添加乙酸后, 培养基 ph 明显降低, 具体为 3.70 (0.6% 乙酸 ) 3.61 (0.8% 乙酸 ) 和 3.56 (1.0% 乙酸 ) r/min 培养 6 h 后, 进行厌氧发酵, 定时取样检测各项发酵性能指标实验重复 3 次, 每次每个条件设 3 个重复细胞生物量发酵液中葡萄糖和乙醇含量测定参照文献 [23] 进行图 1 不同酵母菌株絮凝能力比较 Fig. 1 Flocculation ability of different yeast strains. The flocculation ability was analyzed using the standard method. Data are presented as the means of the results of three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. cjb@im.ac.cn

6 236 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2015 Vol.31 No.2 显差异,6 株 6-AF1c 之间絮凝能力也没有明显差异其中表达 FLO1 内重复序列单元 C 完全缺失的衍生基因 FLO1c 的工业酿酒酵母 6-AF1c 的絮凝能力是表达完整絮凝基因 FLO1 的工业酿酒酵母 6-AF1 絮凝能力的 96.4% 与 FLO1 和 FLO1c 在实验室单倍体酵母菌株中表达的结果基本一致 [17] 2.2 絮凝基因表达对酵母菌胁迫耐受性影响在含不同浓度乙醇糠醛及乙酸的 YPD 固体培养基上比较不同酵母菌株的生长情况, 发现在乙醇和糠醛胁迫条件下, 对照菌株 CE6-V 与重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 之间没有表现出明显的生长差异, 但表达絮凝基因的工业酿酒酵母在乙酸胁迫条件下的细胞生长明显优于对照菌株 ( 图 2) 检测的所有 6-AF1 和 6-AF1c 菌株均表现出对乙酸胁迫的耐受性表明絮凝基因的表达对工业酿酒酵母 CE6 的乙醇和糠醛胁迫耐受性没有明显影响, 但提高了酵母菌应对乙酸胁迫的耐受性进一步在含不同浓度乙酸的 YPD 液体培养基中比较不同酵母菌株的生长情况结果发现在 0.6% 1.0% (V/V) 乙酸胁迫下, 重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 的乙酸胁迫耐受性分别是对照菌株的倍和倍 ( 图 3), 说明通过表达絮凝基因赋予工业酿酒酵母絮凝特性可以明显提高酵母菌应对乙酸胁迫的耐受性, 而且絮凝基因内重复序列单元 C 缺失使工业酿酒酵母表现出更高的乙酸胁迫耐受性 2.3 乙酸胁迫下的发酵性能比较乙醇发酵实验结果表明, 在无乙酸胁迫条图 2 空载体转化菌株 CE6-V 及絮凝型重组酵母菌 6-AF1 和 6-AF1c 在不同胁迫条件下的生长情况 Fig. 2 Growth of yeast cells under various stress conditions. Mid-exponential cultures (OD 600 of 1.0) of yeast strains CE6-V, 6-AF1 and 6-AF1c were diluted serially. 5 L of each dilution ( ) was spotted onto YPD plates or YPD plates containing different concentrations of ethanol, furfural or acetic acid and incubated at 30 for 48 h.

237 件下, 对照菌株 CE6-V 与重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 表现出非常相似的发酵性能, 发酵 12 h 后葡萄糖消耗完, 乙醇浓度在 15 h 达到最高 ( 图 4A) 在乙酸胁迫条件下, 对照菌株和重组菌株的细胞生长和发酵速率均受到明显抑制, 但絮凝型的重组菌株表现出了更高的乙醇产率在 0.6% (V/V) 乙酸胁迫条件下 (ph 3.

56), 对照菌株 CE6-V 重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产量分别在 100 h 70 h 和 60 h 时达最高值, 其中 6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产率分别是对照菌株 CE6-V 的 1.21 倍和 1.

7 237 件下, 对照菌株 CE6-V 与重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 表现出非常相似的发酵性能, 发酵 12 h 后葡萄糖消耗完, 乙醇浓度在 15 h 达到最高 ( 图 4A) 在乙酸胁迫条件下, 对照菌株和重组菌株的细胞生长和发酵速率均受到明显抑制, 但絮凝型的重组菌株表现出了更高的乙醇产率在 0.6% (V/V) 乙酸胁迫条件下 (ph 3.70), 酵母菌株 CE6-V 6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产率分别为 1.6,2.5 和 2.6 g/(l h) ( 图 4B); 当乙酸浓度为 0.8% (V/V) 时 (ph 3.61), 酵母菌株 CE6-V 6-AF1 和 6-AF1c 乙醇产率分别为 0.9,1.2 和 2.5 g/(l h) ( 图 4C); 乙酸浓度增加到 1.0% (V/V) 时 (ph 3.56), 对照菌株 CE6-V 重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产量分别在 100 h 70 h 和 60 h 时达最高值, 其中 6-AF1 和 6-AF1c 的乙醇产率分别是对照菌株 CE6-V 的 1.21 倍和 1.78 倍 ( 图 4D) 在所有实验条件下, 带有空载体的对照菌株 CE6-V 表现出与宿主菌 CE6 相同的发酵性能检测的所有 6-AF1 菌株之间或 6-AF1c 菌株之间发酵性能没有明显差异添加乙酸使发酵培养基的 ph 有所降低, 增强了乙酸的细胞毒性在乙酸毒性增加的条件下, 絮凝型重组菌株 6-AF1 和 6-AF1c 表现出明显优于对照菌株的发酵性能可见絮凝基因的表达可以明显提高工业酿酒酵母的乙酸胁迫耐受性, 缩短乙酸胁图 3 酵母菌在不同乙酸胁迫下的相对生长能力比较 Fig. 3 Relative growth of different yeast strains under acetic acid stress in liquid cultures. (A) 0.6% acetic acid. (B) 0.8% acetic acid. (C) 1.0% acetic acid. Data at three time points were analyzed for each strain under different acetic acid stress, 1: early logarithmic phase; 2: middle logarithmic phase; 3: late logarithmic phase. Data are presented as the means of the results of three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. 迫条件下的发酵周期 ; 特别是 FLO1 内重复序列单元 C 缺失后使这种效果更加明显, 使酵母菌株在乙酸胁迫条件下表现出更高的乙醇生产速率发酵结束后收集酵母细胞, 检测各酵母菌株的絮凝能力 ( 图 5) 宿主菌 CE6 及空载体转化菌株 CE6-V 没有表现出絮凝特性,6-AF1 和 6-AF1c 均表现出明显的絮凝特性在无乙酸胁 cjb@im.ac.cn

8 238 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2015 Vol.31 No.2 图 4 酵母菌在不同乙酸胁迫下的发酵性能比较 Fig. 4 Fermentation performances of different yeast strains under acetic acid stress. (A) Fermentation without acetic acid. (B) Fermentation with 0.6% (V/V) acetic acid. (C) Fermentation with 0.8% (V/V) acetic acid. (D) Fermentation with 1.0% (V/V) acetic acid. CE6-V: residual glucose ( ), ethanol ( ); 6-AF1: residual glucose ( ), ethanol( ); 6-AF1c: residual glucose ( ), ethanol (Δ). Data are presented as the means of the results of three independent experiments. Error bars indicate standard deviations (P<0.05). 迫条件下发酵结束后,6-AF1 和 6-AF1c 的絮凝能力是在常规 YPD 培养基中培养细胞絮凝能力的 1.4 倍一方面发酵液中较高浓度乙醇可能增强以 ADH1p 为启动子的絮凝基因的表达, 另一方面发酵后期酵母细胞表面特性 ( 细胞壁构象细胞表面电荷及疏水性等 ) 发生不同于常规 YPD 培养的变化, 从而影响细胞之间相互作用的强度 [24] 在乙酸胁迫条件下发酵结束后, 酵母细胞的絮凝能力明显降低 ; 而且与菌株 6-AF1c 相比, 乙酸对菌株 6-AF1 的絮凝表现出更强的抑制作用一方面乙酸可能影响絮凝基因的表达, 另一方面乙酸影响絮凝蛋白的构象将无乙酸胁迫条件下发酵结束收集到的 6-AF1 和 6-AF1c 细胞重新悬浮于含不同浓度乙酸的絮凝缓冲液中, 测定絮凝能力, 结果发现不同浓度乙酸对絮凝能力的影响与相应乙酸浓度下发酵结束时菌株的絮凝能力变化趋势基本一致说明不同乙酸胁迫下絮凝能力的变化可能主要来源于乙酸对絮凝蛋白功能的影响而且与完整的絮凝蛋白 Flo1 相比,Flo1c 在乙酸胁迫压力

239 高 2 倍 [18] 在本研究中, 絮凝型重组菌株及其非絮凝原始菌株在乙醇胁迫下的细胞生长没有明显的差异, 这种与 Smukalla 等的研究结果的不一致性可能与宿主菌的遗传背景有关 [18] 然而, 本研究首次发现在工业酿酒酵母中表达絮凝基因可以明显提高酵母菌应对乙酸胁迫的耐受性, 从而缩短乙酸胁迫条件下的发酵周期, 提高产物生成速率而且, 絮凝基因 FLO1 中重复序列单元 C

Error bars indicate standard deviations.

9 239 高 2 倍 [18] 在本研究中, 絮凝型重组菌株及其非絮凝原始菌株在乙醇胁迫下的细胞生长没有明显的差异, 这种与 Smukalla 等的研究结果的不一致性可能与宿主菌的遗传背景有关 [18] 然而, 本研究首次发现在工业酿酒酵母中表达絮凝基因可以明显提高酵母菌应对乙酸胁迫的耐受性, 从而缩短乙酸胁迫条件下的发酵周期, 提高产物生成速率而且, 絮凝基因 FLO1 中重复序列单元 C 发生缺失使酵母菌表现出更强的图 5 不同酵母菌株乙酸胁迫发酵结束时絮凝能力比较 Fig. 5 Flocculation ability of different strains at the end of fermentation. Data are presented as the means of the results of three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. 下的空间构象更稳定这使得在高浓度乙酸胁迫条件下,6-AF1c 表现出了比 6-AF1 更高的絮凝能力, 这可能是菌株 6-AF1c 在乙酸胁迫条件下具有更高乙醇生产速率的重要原因 3 讨论酵母菌在发酵过程中常常面临多种环境胁迫, 严重地制约着发酵工业的生产效率增强发酵菌种的工业环境适应性和鲁棒性对提高生产效率降低生产成本具有重要意义絮凝, 作为细胞之间粘附的一种方式, 不仅是工业发酵过程提供细胞分离及产品澄清的有效方法, 同时也是细胞应对环境胁迫的一种保护机制一方面通过絮凝形成细胞团, 外层细胞可以为内层细胞提供保护屏障, 另一方面絮凝过程的发生可能激发细胞内环境的重构, 从而产生对外环境的适应性 Smukalla 等的研究发现絮凝可以使酵母细胞在乙醇压力下的细胞存活率提乙酸胁迫耐受性和胁迫条件下更高的乙醇产率, 这与重复序列单元 C 缺失的絮凝蛋白 Flo1cp 比絮凝蛋白 Flo1p 具有更高的构象稳定性有关 [17] 乙酸胁迫条件下发酵结束后, 菌株 6-AF1c 表现出比 6-AF1 高的絮凝能力也说明了这一点表达重复序列单元 C 缺失衍生基因 FLO1c 在提高工业酿酒酵母乙酸胁迫耐受性上的有效性, 不但为提高生物质乙醇发酵效率提供了技术途径, 也将为提升酵母菌所参与的其他发酵工业过程效率提供重要思路在对酿酒酵母遗传修饰中, 宿主菌遗传背景有时对遗传修饰效果产生一定影响 [25-26] 通过对酵母菌絮凝能力的遗传改造增强酵母细胞对乙酸胁迫的耐受性是否受宿主菌遗传背景影响还需进一步研究, 以便更好地指导絮凝特性在发酵工业中的应用 REFERENCES [1] Tan K, Lee K, Mohamed A. Role of energy policy in renewable energy accomplishment: the case of second-generation bioethanol. Energ Policy, 2008, 36(9): [2] Benjaphokee S, Hasegawa D, Yokota D, et al. Highly efficient bioethanol production by a Saccharomyces cerevisiae strain with multiple stress tolerance to high temperature, acid and cjb@im.ac.cn

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌