表 1. Thermo Scientific Pierce NHS- 活化磁珠的特性成分 : N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 功能基团固定于磁珠表面磁性 : 超顺磁 ( 无磁力记忆 ) 平均直径 : 1 μm ( 标称 ) 密度 : 2.0 g/cm 3 磁珠浓度 : 于 DMAC 中 10 mg

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稳庞
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1 说明书 Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP( 免疫沉淀 / 免疫共沉淀 ) 试剂盒货号描述 Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP 剂盒, 包含足够进行 40 次反应的试剂 ( 每次使用 25 µl 磁珠固相化抗体 ) 目录试剂盒组分 : Pierce NHS- 活化磁珠,1 ml, 贮存于 N,N- 二甲基乙酰胺 (DMAC), 浓度为 10 mg/ml IP 裂解 / 洗涤缓冲液,2 50 ml,ph 7.4,0.025M Tris,0.15M NaCl,0.001M EDTA,1% NP40,5% 甘油洗脱缓冲液,25 ml,ph 2.0 中和缓冲液,0.5 ml,ph 8.5 淬灭缓冲液,25 ml,3 M C 2 H 7 NO( 乙醇胺 ),ph 9.0 硼酸盐缓冲液,1 ml,0.67 M BupH 硼酸盐缓冲液,0.05 M Na 2 B 4 O 7 10H 2 O( 硼酸钠 ), 溶于终体积 500 ml 的超纯水中 ph 8.5 非还原型泳道标记样品缓冲液 (5 ), 5 ml,ph 6.8,0.3M Tris HCl,5% SDS,50% 甘油, 泳道标记示踪染料 ;ph 6.8 贮存条件 :4 C 储存, 冰盒运输产品简介... 1 流程概述... 2 重要产品信息... 2 哺乳动物细胞裂解流程... 3 Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP 试剂盒手动操作流程... 4 Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP 试剂盒自动操作流程... 5 常见问题及解决方案... 7 网站附加信息... 8 Thermo Scientific 相关产品... 8 产品简介 Thermo Scientific Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP 试剂盒可使抗原高效地发生免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 反应活化的磁珠包含 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 功能基团, 通过与抗体上的伯胺基团反应而形成稳定的酰胺键在不含胺基的缓冲液中, 抗体首先偶联到 NHS 活化的磁珠上洗涤偶联抗体的磁珠, 去除未共价结合的抗体并终止反应将上述磁珠与抗原样品孵育, 洗涤去除未结合的物质, 最后用低 ph 的洗脱液分离抗原试剂盒包含获得高抗原产量和低非特异结合的优化缓冲液同时还包含用于 SDS-PAGE 分析的泳道标记样品缓冲液磁珠可使用磁力架从溶液中手动分离, 或使用仪器自动分离, 如 Thermo Scientific KingFisher Flex 仪器自动仪器适用于多种样品的大规模筛选 1

2 表 1. Thermo Scientific Pierce NHS- 活化磁珠的特性成分 : N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 功能基团固定于磁珠表面磁性 : 超顺磁 ( 无磁力记忆 ) 平均直径 : 1 μm ( 标称 ) 密度 : 2.0 g/cm 3 磁珠浓度 : 于 DMAC 中 10 mg/ml 结合能力 : 26 μg 兔 IgG/mg 磁珠流程概述 1. 用冰上预冷的 1 mm HCl 洗涤磁珠 2. 将抗体与磁珠孵育分钟 3. 用洗脱缓冲液洗涤磁珠两次 4. 用淬灭缓冲液终止反应分钟 5. 用改良的硼酸盐缓冲液洗涤磁珠一次, 再用 IP 裂解 / 洗涤缓冲液洗涤磁珠一次 6. 将细胞裂解液与偶联抗体的磁珠在室温下孵育 2 小时, 或 4 ºC 过夜 7. 用 IP 裂解 / 洗涤缓冲液洗涤磁珠两次, 再用纯水洗涤一次 8. 洗脱结合的抗原重要产品信息磁珠对湿度敏感为保护磁珠, 吸取悬浮液后立即将瓶子封口, 并用实验封口膜包裹, 储存于 4ºC 请勿离心干燥或冷冻磁珠, 这些操作可能导致磁珠聚集而降低结合能力可通过蛋白定量方法 ( 如 Thermo Scientific Pierce 660nm 蛋白定量试剂盒, 产品货号和 22662), 用蛋白上样量减去流穿液中的蛋白量估计偶联在磁珠上的蛋白量如需直接测定磁珠上的蛋白量, 可使用 Thermo Scientific Pierce Micro BCA 蛋白定量试剂盒 ( 产品货号 23235, 参阅网站技术提示 #75: 测定 Pierce NHS- 活化磁珠上的蛋白结合量 ) 为使抗体偶联于磁珠上, 抗体储液中不能含蛋白稳定剂 ( 如 BSA 明胶 ), 这些成分会抑制抗体与磁珠的偶联使用 Thermo Scientific Pierce Antibody Clean-up 试剂盒 ( 产品货号 44600, 参阅网站技术提示 #55: 使用 Melon Gel 去除抗体储液中的 BSA 和明胶 ) 去除蛋白稳定剂含有伯胺基的缓冲液 ( 如 Tris 和甘氨酸 ) 会抑制蛋白和磁珠的偶联利用透析 ( 如 Thermo Scientific Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes,10K MWCO,3 ml, 产品货号 87730) 或脱盐 ( 如 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns,7K MWCO,0.5 ml, 产品货号 89882) 去除缓冲液中的伯胺基为获得最佳结果, 尽量使用亲和纯化后的抗体尽管也可使用血清, 但血清样品中针对目的抗原的特异性抗体含量可能仅占 IgG 总量的 1-2%, 因此将导致抗原的产量低 IP 裂解 / 洗涤缓冲液已进行过代表性细胞类型的检测, 包括但不限于下列细胞系 : HeLa,Jurkat,A431, A549,MOPC,NIH 3T3 和 U2OS 通常情况下,10 6 的 HeLa 细胞可以产生约 10 mg 的细胞团块, 按照 ~3 μg/μl 的配比使用 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 ( 即 100 μl IP 裂解 / 洗涤缓冲液可以裂解 ~300 μg 细胞团块 ) 2

3 为尽量减少蛋白质的降解, 请在制备细胞裂解液的过程中加入蛋白酶抑制剂 ( 如 Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail,EDTA-free, 产品货号 78425) IP 裂解 / 洗涤缓冲液可兼容 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒 ( 货号 :23225) 低 ph 洗脱的最佳孵育时间为 5 分钟如未获得预期的抗原产量, 重复一次低 ph 洗脱有助于洗脱剩余的结合抗原哺乳动物细胞裂解操作流程 A. 其他所需材料磷酸盐缓冲液 (PBS,100 mm Na 3 PO 4, 100mM NaCl;pH 7.2; 产品货号 28372) 培养的细胞方案 I: 裂解单层 ( 贴壁 ) 细胞培养物 1. 小心去除细胞中的培养基 2. 用 PBS 清洗细胞一次 3. 将冰上预冷的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液加入细胞中 ( 表 2) 冰上孵育 5 分钟并定期混匀表 2. 不同标准的细胞培养皿 / 板中 IP 裂解 / 洗涤缓冲液的建议添加量培养皿 / 板的尺寸或表面积 IP 裂解 / 洗涤缓冲液体积 mm µL mm µL 6- 孔板 μL 每孔 24- 孔板 μL 每孔 4. 将细胞裂解液转移到微量离心管中, g 离心 10 分钟以沉淀细胞碎片 5. 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析方案 II: 裂解悬浮细胞培养物 1. 将细胞悬浮液在 1000 g 下离心 5 分钟以沉淀细胞弃掉上清 2. 将细胞团块用 PBS 重悬洗涤一次 1000 g 离心 5 分钟再次沉淀细胞 3. 将冰上预冷的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液加到细胞团块中每 50 mg 湿重细胞团块加入 500 μl IP 裂解 / 洗涤缓冲液 ( 即 10:1 体积 / 质量 ) 如果裂解大量细胞, 可首先添加 10% 终体积的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液到细胞团块中, 用移液管 / 移液器上下吹打细胞团块以混匀, 然后再向细胞悬浮液中添加剩余的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 4. 将细胞裂解液在冰上孵育 5 分钟并定期晃动 g 离心 10 分钟去除细胞碎片 5. 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析 3

4 Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP 试剂盒手动操作流程 A. 其他所需材料磁力架 ( 如 Thermo Scientific Magnabind Magnet, 适用于 ml 离心管, 产品货号 21359) 1.5 ml 微量离心管冰上预冷的 1 mm 盐酸用于偶联的抗体免疫沉淀所需的抗原样品超纯水 B. 将抗体偶联于 NHS- 活化磁珠注 : 以下操作方案是针对 25 µl 磁珠固相化 5 µg 抗体进行优化的, 但同样适用于 2-10 µg 抗体的固相化当制备大量抗体偶联磁珠时, 此方案可按比例放大 1. 涡旋 NHS- 活化磁珠的瓶子, 以获得均一的悬浮液向微量离心管中加入 25 µl 磁珠将离心管置于磁力架上 1 分钟, 收集磁珠去除储存液 2. 向离心管中加入 400 µl 冰上预冷的 1 mm HCl, 轻微涡旋混匀 5 秒钟通过磁力架收集磁珠, 去除上清 3. 制备抗体稀释液 : 向抗体储存液中加入 10 µl 硼酸缓冲液 (0.67 M), 并加入超纯水至终体积 100 µl 抗体的终浓度为 5 µg/100 µl, 硼酸缓冲液的终浓度为 M 注 : 若 IP 反应中抗体用量不是 5 µg, 需调整抗体稀释缓冲液的用量 4. 向磁珠中加入 100 µl 制备好的抗体稀释液, 轻柔混匀, 在室温条件下于旋转器上孵育分钟孵育过程中, 每分钟轻微涡旋磁珠, 使磁珠处于悬浮状态 5. 用磁力架收集磁珠, 除去上清, 保存以备分析 6. 向磁珠中加入 100 µl 洗脱缓冲液, 轻微涡旋或颠倒混匀用磁力架收集磁珠, 去除上清重复一次注 : 洗脱液去除非共价结合的抗体 7. 向磁珠中加入 500 µl 淬灭缓冲液轻柔混匀, 在旋转器上孵育分钟 8. 用磁力架收集磁珠, 去除上清 9. 为每个 IP 反应制备 0.5 ml 的改良型硼酸盐缓冲液, 将 25 µl IP 裂解 / 洗涤缓冲液稀释于 475 µl 硼酸盐缓冲液 ( 由 Thermo Scientific BupH 硼酸盐缓冲液溶于 500 ml 超纯水制成 ) 10. 向离心管中加入 500 µl 步骤 9 中制备的改良型硼酸盐缓冲液, 轻微涡旋或颠倒混匀用磁力架收集磁珠, 去除上清 11. 向磁珠中加入 500 µl IP 裂解 / 洗涤缓冲液, 轻微涡旋或颠倒混匀用磁力架收集磁珠, 去除上清重复一次 4

5 C. 抗原免疫沉淀 1. 用 IP 裂解 / 洗涤缓冲液稀将细胞裂解液 ( 参阅哺乳动物细胞裂解操作流程 ) 稀释至 1-2 mg/ml 2. 将 500 µl 稀释后的裂解液加入含有抗体偶联磁珠的离心管中在室温条件下于旋转器或混匀器上孵育 2 小时孵育过程中, 每分钟轻微涡旋磁珠, 使磁珠处于悬浮状态 3. 用磁力架收集磁珠, 除去未结合的样品, 保存以备分析 4. 向离心管中加入 500 µl IP 裂解 / 洗涤缓冲液, 轻柔混匀收集磁珠, 去除上清重复此操作一次 5. 向离心管中加入 500 µl 超纯水, 轻柔混匀用磁力架收集磁珠, 去除上清 6. 向离心管中加入 100 µl 洗脱缓冲液在室温条件下于旋转器或混合器上孵育 5 分钟用磁力架分离磁珠, 保留含有目的抗原的上清每 100 µl 洗脱液加入 10 µl 中和缓冲液以中和低 ph 注 : 如未获得预期的抗原产量, 重复一次低 ph 洗脱有助于洗脱剩余的结合抗原 Pierce 磁珠法直接 IP/Co-IP 试剂盒自动操作流程 A. 其他所需材料 KingFisher Flex 系统, 具有 96 深孔板磁头 ( 产品货号 ) Thermo Scientific Microtiter 96 深孔板,V 型底, 聚丙烯 ( µL; 产品货号 ) KingFisher Flex 96 深孔板磁套 ( 产品货号 ) 冰上预冷的 1 mm 盐酸用于偶联的抗体免疫沉淀所需的抗原样品超纯水 B. 自动化抗体偶联和抗原免疫沉淀流程注 : 以下实验方案适用于 KingFisher Flex 仪器实验方案可根据需要, 使用仪器提供的 Thermo Scientific BindIt 软件进行修改注 : 实验流程中用到的裂解液来自哺乳动物细胞裂解部分 1. 使用外部计算机, 按照表 3 将直接法免疫沉淀实验方案输入到 BindIt 软件 2. 将实验方案从外部计算机导入 KingFisher Flex 实验方案的导入请参考 BindIt 软件用户手册的详细介绍 3. 根据表 3 设置板子 5

6 表 3. 适用于 Microtiter 96 深孔板的自动化移液设置板子 # 板子名称成分体积时间 / 速度 1 磁珠 NHS 活化磁珠 25 µl 冰上预冷的 1mM 盐酸 175 µl 收集磁珠 2 盐酸洗涤冰上预冷的 1mM 盐酸 400 µl 5 秒 / 慢 3 偶联抗体样品 100 µl 30 分钟 / 慢 4 洗脱缓冲液 1 洗脱缓冲液 100 µl 10 秒 / 慢 5 洗脱缓冲液 2 洗脱缓冲液 100 µl 10 秒 / 慢 6 终止淬灭缓冲液 500 µl 30 分钟 / 慢 7 洗涤液 1 改良型硼酸盐缓冲液 500 µl 30 秒 / 慢 8 洗涤液 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 500 µl 30 秒 / 慢 9 2 结合裂解液 500 µl 2 小时 / 慢 10 洗涤 1 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 500 µl 30 秒 / 慢 11 洗涤 2 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 500 µl 30 秒 / 慢 12 洗涤 3 超纯水 500 µl 30 秒 / 慢 1213 洗脱洗脱缓冲液 100 µl 5 分钟 / 慢 14 磁套板 KingFisher Flex 深孔板磁套 4. 通过仪器的方向键选择实验方案, 点击开始详细信息请查阅 KingFisher Flex 仪器的用户手册 5. 滑动打开仪器防护罩的门 6. 将磁套板 ( 板子 #14) 置于仪器中, 点击开始仪器将磁套置于磁头部 7. 移动磁套板 8. 根据实验方案要求, 将板子 #1-8 置于仪器中 ; 将每块板子置于相同的方向确认各操作后点击开始 9. 板子 #8 完成样品处理后, 仪器将暂停并指导移除每个单独处理的板子, 同时将剩余的六个板子, 板子 #9-14 置于仪器中例如, 移出板子 #1 并将板子 #9 置于相同位置确认各操作后点击开始 10. 样品处理完成后, 根据仪器显示的指导移除板子移除每个板子后点击开始移除所有板子后点击结束注 : 在将板子 #1 和 2 置于仪器之前, 立即加入冰上预冷的 1 mm 盐酸和磁珠, 以保证磁珠水解最小化为中和低 ph 洗脱液, 孵育结束后立即向各孔中加入中和缓冲液, 每 100 µl 洗脱液加入 10 µl 中和缓冲液如果用到的孔少于 96 个, 每个板子使用同样的孔例如, 如果使用 A1 到 A12 孔, 则所有板子均使用同样的孔联接磁套和 96 深孔板更多指导请参阅仪器用户手册 6

7 常见问题及解决方案问题可能原因解决方案偶联效率低偶联之前缓冲液中的伯胺基并未彻底对样品进行透析或脱盐, 彻底去除 Tris 和甘去除氨酸添加蛋白延迟洗涤后立即将蛋白和磁珠混合偶联缓冲液的 ph 不合适使用不含伯胺基的偶联缓冲液,pH 7-9 偶联缓冲液中存在不溶解蛋白蛋白具有疏水性用至多含 20% DMSO 的偶联缓冲液溶解蛋白磁珠聚集磁珠被冷冻或离心过依据实验指导正确处理磁珠偶联过程中磁珠聚集在孵育之前和 / 或之中磁珠未被彻底混匀磁珠表面蛋白与离心管塑料材质发生粘附终止后, 加入 0.05% 去垢剂 ( 例如,Tween - 20 去垢剂 ) 洗涤注 : 偶联过程中请勿使用去垢剂在洗脱的抗原中检测出抗体交联步骤后的洗涤没有将未结合的抗体去除干净 ( 步骤 5) 使用还原剂 ( 如, DTT 或 β-me) 处理抗体交联的树脂, 还原抗体并将抗体片段洗脱, 或抗体片段没有与树脂共价结合交联后增加洗脱缓冲液的洗涤次数使用不含还原剂的缓冲液抗原没有被洗脱洗脱条件过于温和延长洗脱缓冲液的孵育时间至 15 分钟, 或使 IP 裂解 / 洗涤缓冲液组份干扰抗原 - 抗体的结合用强度较高的洗脱缓冲液使用其它缓冲液进行免疫沉淀和洗涤 ( 例如, 含有 0.5% CHAPS 的 TBS) 回收蛋白量低蛋白质降解加入蛋白酶抑制剂用于结合的磁珠量不够提高捕获免疫复合物所使用的磁珠量样品中的目标蛋白量不够提高抗原样品量回收蛋白失活洗脱条件强度过高使用温和洗脱缓冲液 ( 例如, Thermo Scientific Gentle Elution Buffer, 产品货号 21034) 7

8 网站附加信息常见问题及解决方案技术提示 #43: 蛋白质的稳定性和储存技术提示 #55: 使用 Melon Gel 去除抗体储液中的 BSA 和明胶技术提示 #75: 测定 Pierce NHS 活化磁珠上的蛋白结合量有关 KingFisher 的产品信息请访问网站在美国, 请从 Fisher Scientific 购买 KingFisher 产品美国以外购买 KingFisher 产品, 请联系当地的 Thermo Fisher Scientific 办公室 Thermo Scientific 相关产品 Pierce NHS-Activated Magnetic Beads(NHS 活化磁珠 ) Pierce Protein A/G Magnetic Beads( 蛋白 A/G 磁珠 ) Pierce Protein A Magnetic Beads( 蛋白 A 磁珠 ) Pierce Protein G Magnetic Beads( 蛋白 G 磁珠 ) Pierce Classic Magnetic IP/Co-IP Kit( 经典磁珠法免疫沉淀 / 免疫共沉淀试剂盒 ) Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit( 交联磁珠法免疫沉淀 / 免疫共沉淀试剂盒 ) Pierce Streptavidin Magnetic Beads( 链霉亲和素磁珠 ) Pierce Glutathione Magnetic Beads( 谷胱甘肽磁珠 ) Micro BCA Protein Assay Kit( 微量 BCA 蛋白定量试剂盒 ) Pierce Antibody Clean-up Kit( 抗体 Clean-up 试剂盒 ) 自产品文件说明书和 / 或产品包装内所附文件 ( 文件 ) 中所说明的销售之日起, 本公司担保本产品 ( 产品 ) 的运行或性能完全符合已公布的产品说明书, 并且担保产品在材料和工艺上没有缺陷除非另外以书面形式进行明确授权, 本产品仅可用于研究目的本产品不适合应用于 FDA 监管的领域只有当本产品由经过适当培训的人员使用时, 此处所提供的担保才有效除非在文件中另有说明, 否则本担保只限于从产品装运之日起一年本担保不会扩展至除了本产品的原始购买方 ( 买方 ) 之外的任何一方公司不提供其它任何明示或暗示的保证条款, 包括但不限于商业适售性特定目的之适用性或者非侵权证明等暗示性保证在质保期间, 买方对于不合格产品的唯一赔偿仅限于更换不合格的产品或者退回货款如果由于下述原因之一造成产品故障, 本公司没有义务对产品进行更换 :(i) 事故灾难或不可抗力事件 ;(ii) 买主的错误使用过错或疏忽 ;(iii) 将该产品以其设计范围之外的方式使用 ; 或者 (iv) 不正确储存和操作该产品如果需要传真的复印件, 请拨打或与当地经销商联系 2011 Thermo Fisher Scientific Inc. 版权所有除非另有说明, 所有商标都是 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的财产 8

产品简介 Thermo Scientific Pierce 经典磁珠式免疫沉淀 / 免疫共沉淀试剂盒能够高效完成抗原免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 实验, 抗体用量小于 10 μg 且无需离心首先, 将特异性的抗体加入样品中与目标抗原形成免疫复合物, 然后将其结合在蛋白 A/G

产品简介 Thermo Scientific Pierce 经典磁珠式免疫沉淀 / 免疫共沉淀试剂盒能够高效完成抗原免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 实验, 抗体用量小于 10 μg 且无需离心首先, 将特异性的抗体加入样品中与目标抗原形成免疫复合物, 然后将其结合在蛋白 A/G 说明书 Pierce 经典磁珠式免疫沉淀 / 免疫共沉淀试剂盒 88804 2287.3 货号描述 88804 Pierce 经典磁珠式免疫沉淀 / 免疫共沉淀试剂盒, 包含足够完成 40 个反应的试剂, 每个反应使用 25 µl 磁珠试剂盒组成 : Pierce 蛋白 A/G 磁珠 1 ml, 贮存于含有 0.05% NaN3 的水中, 浓度为 10 mg/ml Pierce 免疫沉淀裂解 /