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1 食品中鲑亚科鱼成分鉴定方法研究 李进波 1,2, 李想 2*, 谌鸿超 2, 李正 2, 宋青 2, 潘良文 (1. 华东理工大学生物工程学院, 上海 ;2. 上海出入境检验检疫局, 上海 ) 2* 摘要 : 根据鲑亚科鱼类生长激素 (growth hormone,gh) 基因保守序列设计特异性引物和探针, 建立了一种鉴定食品中鲑亚科鱼类成分的实时荧光 PCR 方法 结果表明建立的检测方法高度特异于鲑亚科鱼类检测, 鲑科的另两个亚科 白鲑亚科和茴鱼亚科样品均无扩增曲线 对建立的实时荧光 PCR 方法的检测下限 (LOD) 进行了测试 结果表明, 采用 6 种常见鲑亚科鱼品种可稳定检测到的最低 DNA 量为 100 pg; 分别将大西洋鲑鱼和北极红点鲑鱼肉混入玉米 鸡肉和鲫鱼样品中测定的相对 LOD 为 0.01 % (W/W) 检测方法的可重复性测试结果表明 Ct 值标准偏差和相对标准偏差均在可接受范围内 运用建立的实时荧光 PCR 检测方法对 25 份市售实际样品进行测试, 有 4 份标识含有 三文鱼 的样品未检测出鲑亚科鱼类成分 因此, 本研究建立的实时荧光 PCR 检测方法特异性好, 灵敏度高, 可重复性好, 能快速 准确鉴定食品中鲑亚科鱼类成分 关键词 : 实时荧光 PCR; 鲑亚科 ; 生长激素基因 ; 鉴定 Identification of Salmoninae in Food LI Jin-bo 1,2, LI Xiang 2*, Chen Hong-chao 2, Li Zheng 2, Song Qing 2, PAN Liang-wen 2* (1. School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai , China; 2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai , China) Abstract:To indentify the ingredients of Salmoninae in food, specific primers and probe for real-time PCR were designed according to the conservation region of growth hormone gene of Salmoninae. Results showed that the developed method was highly specific for Salmoninae detection. The detection limits of the esteblished method were 100 pg using six species of Salmoninae as the templates. The relative detection limits were 0.01% (w/w) by mixing the fish of Salmo Salar or Salvelinus alpinus with maize, chicken or crucian. Standard deviations and relative standard deviations of Ct values of five concentrations of DNA were all in the acceptable range. Twenty five commercial products which was labeled containing salmon were tested by the developed real-time PCR assay, and four samples were found without Salmoninae ingredient. Thus, considering the high specificity, sensitivity and repeatability of the real-time PCR method, we believed that the eateblished method can be used to rapidly and accurately identify the Salmoninae ingredient in food. Key words:real-time PCR; Salmoninae; Growth hormone gene; Identification 中图分类号 :TS207.3 文献标识码 :A 文章编号 : 鲑科 (Salmonidae) 鱼隶属于硬骨鱼纲 (Osteichthyes), 辐鳍亚纲 (Actinopterygii), 鲑形目 (Sahnonnifames), 鲑亚目 (Salmonoidei), 是重要的世界型名贵经济鱼类, 也是世界三大养殖鱼类之一 鲑科鱼又分为 3 个亚科 7 属 36 种 [1], 主要为鲑亚科 (Salmoniae), 白鲑亚科 (Coregoninae) 和茴鱼亚科 (Thymallidae) 其中鲑亚科有 5 属, 即大马哈鱼属 (Oncorhynchus) 红点鲑属(Salvelinus) 哲罗鲑属(Hucho) 收稿日期 : 基金项目 : 本研究获得上海市技术性贸易措施应对专项 (12TBT011) 十二五 农村领域国家科技计划课题 ( 863 项目 )(2011AA100807) 和上海出入境检验检疫局科技计划项目 (HK ) 支持 作者简介 : 李进波 (1987-), 男, 硕士研究生, 研究方向为分子生物学 jinbo_li@live.com * 通信作者 : 李想 (1978-), 女, 高级工程师, 博士, 研究方向为分子生物学 idealne@163.com 潘良文 (1966-), 男, 研究员, 博士, 研究方向为分子生物学 panlw888@126.com 1

2 细鳞鲑属 (Brachymystax) 和鲑属 (Salmo), 囊括了鲑科中多数的食用性经济鱼类, 因此需求量最大, 经济价值也最高 [1,2] 目前市场上以 三文鱼 为商品名称的鲑鳟鱼均属于鲑亚科鱼类 由于鲑科鱼肉含有丰富的蛋白质 ω3 脂肪酸 (EPA DHA 和 DPA) 和维生素, 营养价值高, 近几年需求量逐年增加 我国是 三文鱼 等鲑鳟鱼类的主要消费国, 而且我国每年的出口量也在日益增大 2009 年的数据显示, 世界鲑鳟鱼产量达到 万吨, 其中我国鲑鳟鱼进口量达到了 22 万吨 [2] 在鱼制品需求量大增的同时, 不断有报道显示国内外市场上鱼类商品标识名称混乱, 很多国家市场上鱼类制品假冒替代现象严重, 仅在美国每年就有约 34% 水产品乱贴标签, 以次充好, 为此 2010 年国家质检总局曾发布第 57 号进口食品 化妆品警示通报, 要求对美国输华水产品加强标签检验和品种鉴别 [3] 为保证保费者权益, 规范鲑科鱼类销售市场, 促进我国鱼类及其制品出口, 防止名不副实 以次充好现象的发生, 基于物种分子特征性序列建立鲑亚科鱼类特异性检测鉴定方法至关重要 目前基于 DNA 的检测方法由于快速 灵敏 省时省力等优点越来越多地应用到物种鉴定中 [4-9] 其中实时荧光 PCR 技术以其快速 灵敏 特异等优点, 广泛地应用在食品检测中 [10-16] 本研究旨在基于鱼类生长激素基因 (growth hormone,gh) 的特异性序列运用实时荧光 PCR 方法检测鉴定食品中鲑亚科鱼成分, 确保食品质量安全 1 材料与方法 1.1 材料鲑科鱼样本分别由青海民泽龙羊峡生态水产养殖有限公司 黑龙江水产研究所提供或购自北京及新疆, 国外鱼种样品来自本实验室储备 收集到的鲑科鱼类样本信息详见表 1 表 1 收集的鲑科鱼类样本信息 Table 1 Species and Information of the collected Salmonidae Samples 亚科 Subfamily 鲑亚科 Salmoninae 白鲑亚科 Coregoninae 茴鱼亚科 Thymallidae 属 Genus 大马哈鱼属 Oncorhynchus 红点鲑属 Salvelinus 哲罗属 Hucho 细鳞鲑属 Brachymystax 鲑属 Salmo 白鲑属 Coregonus 茴鱼属 Thymallus 种 Species 产地 Location 数量 ( 条 ) Amount 虹鳟 (O. mykiss) 北京 青海 美国 10 大麻哈鱼 (O. keta) 黑龙江 日本 俄罗斯 10 山女鳟 (O. masou masou) 日本 18 北极红点鲑 (S. alpinus alpinus) 日本 9 白点鲑 (S. leucomaenis) 日本 10 太门哲罗鲑 (H. taimen) 黑龙江 10 尖吻细鳞鲑 (B. lenok) 黑龙江 10 青海 挪威 加拿大 澳大利亚 英国 大西洋鲑 (S. salar) 40 法罗群岛 褐鳟 (S. trutta) 澳大利亚 挪威 智利 15 乌苏里白鲑 (C.ussuriensis Berg) 黑龙江 3 高白鲑 (C. Peled) 新疆 青海 13 齐尔白鲑 (C. nasus) 青海 10 图贡白鲑 (C. tugun) 青海 10 目笋白鲑 (C. muksun) 青海 10 海浪河茴鱼 (T. thymallus) 黑龙江 10 鸭绿江茴鱼 (T. arcticus yaluensis) 黑龙江 3 北极茴鱼 (T. arcticus arcticus) 黑龙江 3 黑龙江茴鱼 (T. grubii) 黑龙江 3 下游黑龙江茴鱼 (T. brevirostris) 黑龙江 3 同时收集购买鲑科鱼类的近缘科 目的鱼类, 包括狗头鱼 (arthron hispicus) 白斑狗鱼 (Esox lucius) 2

3 银鱼 (Hemisalanx prognathus Regan) 黄菇鱼(Nibea albiflora) 白菇鱼(Argyrosomus argentatus) 大眼菇鱼 (Atrobucca alcocki) 左口鱼(Pseudorhombus swinhonis) 格陵兰庸鲽鱼(Hippoglossus) 巴沙鱼(Pangasius bocourti) 金线鱼(Nemipterus virgatus) 金枪鱼(Thunnus Maccoyii) 黄鳍棘鲷鱼(Sparus latus Houttuyn) 虎头鱼 (Sebastiscus marmoratus) 鲐鱼(Pneumatophorus japonicus) 旗鱼(Histiophorus orientalis) 鲥鱼 (Tenualosa reevesii) 鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix) 鲫鱼(Carassius auratus) 接吻鱼(Helostoma temminckii) 鳕鱼(Gadus) 罗非鱼(Tilapia) 和马鲛鱼 (Scomberomorus niphonius), 常见动植物材料包括鸡 鸭 鹅 猪 黄牛 绵羊 玉米 小麦等用于对建立的鲑亚科鱼类检测方法进行特异性鉴定 实际样品均购自上海市各大超市, 包括味噌渍秋鲑 三文鱼块 鱼子酱 烟熏三文鱼 狗鲑鱼扒 香草三文鱼 腌渍大麻哈鱼 香肠 三文鱼营养米粉 三文鱼蔬菜泥 三文鱼营养面条 三文鱼蔬菜米粉 红三文鱼色拉 鱼肉酥 三文鱼颗粒面 蜜汁三文鱼 三文鱼籽 三文鱼奶酪及火腿肠, 所有样品均标记含有鲑亚科鱼成分或标注为鲑亚科鱼制品 这些样品用于检测方法的实际验证 1.2 方法 样品处理和制备对于整鱼样本, 用无菌手术刀切去表层鱼肉, 从贴近鱼骨处切取鱼肉一块 ( 防止表层鱼肉有污染 ), 完全冷冻后采用冷冻研磨机 ( 美国 Spex SamplePrep 公司,6850 型 ) 研磨成均匀的粉末 解冻后用于 DNA 提取 为了测定建立的检测方法的相对灵敏度, 选取三种食品基质如玉米 鸡肉和鲫鱼以及代表性的鲑亚科鱼如大西洋鲑鱼和北极红点鲑制备混合样品 首先将鸡肉 鲫鱼及鲑科鱼样分别烘干, 使用冷冻研磨机分别将其研磨成均匀的干粉 然后配制重量梯度的混合样品 采用千分之一天平 ( 德国 Sartorius, BP310S) 称取 g 玉米粉和 1.50 g 大西洋鲑鱼干粉, 混合后使用冷冻研磨机将其充分混匀制成 10 % (w/w) 混合样品 ( 编号为 Aa1) 然后称取 g 玉米粉和 1.50 g Aa1 混合样品, 用冷冻研磨机将其充分混匀制成 1 %(w/w) 混合样品 (Aa2) 采用同样的方法制备 0.1 % 0.01 % % 的混合样品 (Aa3 Aa4 Aa5) 鸡肉 鲫鱼与大西洋鲑鱼的混合样品( 编号分别为 Ab1-Ab5 Ac1-Ac5) 以及玉米 鸡肉和鲫鱼与北极红点鲑鱼的重量梯度混合样品 ( 编号分别为 Ba1-Ba5 Bb1-Bb5 Bc1-Bc5) 采用同样方法配制 DNA 提取称取研磨后的 100 mg 鱼肉 混合样品或实际样品, 使用 DNeasy Blood & tissue Kit (Cat. # 69504, QIAGEN, 德国 ) 并按其操作步骤提取 DNA, 每次 DNA 提取均设置提取空白对照 用微量分光光度计 (GE 公司 NanoPlus, 美国 ) 测定 DNA 浓度和质量后, 置 -20 保存备用 引物和探针在 NCBI 网站上 ( 搜集鲑科鱼 GH 基因序列 (GenBank 序列号 L EU J AY AY ), 根据鲑亚科鱼与白鲑亚科和茴鱼亚科鱼的差异性序列, 采用 Clustal W 软件对鲑科鱼 GH 基因进行比对, 然后使用 Primer Express 软件设计引物 (FPN 5 -CCA TCA CTC TCT AAT CGG CG-3,RPN 5 -GGA GCA GCT TCA GGA CCT G-3 ) 和探针 (PN 5 -FAM-TCA TGT AAA TGA TAT GGC ATC TCA AGC TG-BHQ1-3 ) 用于鲑亚科鱼成分鉴定, 扩增产物为 GH 基因上一段 151 bp 片段 在 NCBI 网站上使用 Blastn 数据库比对引物和探针的理论特异性 18S rrna 引物序列 (18S rrna1 5 -TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3,18S rrna2 5 -AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3 ) [17] 和 12S rrna 引物序列 (12S-FISH-1F 5 -TAA GAG GGC CGG TAA AAC TC-3,12S-Fish-2R 5 -GTG GGG TAT CTA ATC CCA G-3 ) [18] 分别用于扩增所提取的 DNA 18S rrna 引物可在所有植物和动物来源的 DNA 中扩增出目的条带,12S rrna 可在所有鱼来源 DNA 样品中扩增出目的条带 引物和探针均由宝生物 ( 大连 ) 有限公司合成 PCR 反应条件 普通 PCR 普通 PCR 反应体系为 25 µl, 包含 2 Premix Ex Taq HS( 宝生物 ( 大连 ) 有限公司 )12.5 µl, 上 3

4 下游引物各 400 nm, 模板 DNA 5µL, 不足体积用 ddh 2 O 补齐 采用 Mastercycler ProS PCR 仪 (Eppendorf, 德国 ) 进行扩增 18S rrna PCR 反应条件 :94 预变性 5 min;94 变性 20 s,56 退火 30 s,72 延伸 30 s, 36 个循环 ;72 延伸 5 min 12S rrna PCR 反应条件 :94 预变性 5 min;94 变性 20 s,55 退火 30 s,72 延伸 30 s, 36 个循环 ;72 延伸 5 min PCR 产物检测方法 : 取 8 µl PCR 产物, 在 2.0 % 琼脂糖凝胶和 0.2 % TAE 缓冲液中电泳 20 min (120 V), 然后采用凝胶成像系统 ( 美国 Alpha 公司,2S-2200 型 ) 拍照存档 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 反应体系为 25 µl, 包含 2 Taqman Master Mix (Applied Biosystems, 美国 )12.5 µl, 上下游引物各 400 nm, 探针 200 nm,5 µl 模板 DNA, 用 ddh2o 补足至 25 µl 采用 AB PRISM(R) 7300 定量 PCR 仪 (Applied Biosystems, 美国 ) 实时荧光 PCR 系统进行扩增 实时荧光 PCR 反应参数 :95, 10 min;45 个循环 (95,10 s;60,30 s) 荧光信号在 60 时收集 检测方法的特异性和灵敏度测试对检测方法的特异性测试采用鲑亚科 9 种, 白鲑亚科 5 个种和茴鱼亚科 5 个种不同产地样品, 近缘科目 22 种鱼类样品, 以及常见动植物 8 种样品 DNA 为模板, 采用建立的实时荧光 PCR 检测方法进行扩增 对检测方法的灵敏度测试包括绝对灵敏度和相对灵敏度测试 绝对灵敏度测试选取代表性的鲑亚科鱼样品, 如虹鳟 北极红点鲑 太门哲罗鲑 尖吻细鳞鲑和大西洋鲑鱼, 分别将提取的 DNA 溶液稀释至 ng/µl, 进行实时荧光 PCR 扩增, 每个浓度设置 5 个平行, 实验重复 4 次, 即每个浓度得到 20 个对应的 Ct 值, 以满足 95% 置信区间的要求, 计算阳性扩增的次数 相对灵敏度测试采用配制的 Aa1-Aa5 Ab1-Ab5 Ac1-Ac5 Ba1-Ba5 Bb1-Bb5 Bc1-Bc5 混合样品 DNA 为模板, 采用建立的实时荧光 PCR 方法进行测试, 每个百分比含量样品设置 5 个平行, 重复 4 次, 即每个梯度得到对应的 20 个 Ct 值, 计算阳性扩增次数 检测方法的可重复性测试为了测定检测方法的可重复性, 采用虹鳟和大西洋鲑鱼样品 DNA 的 5 个浓度梯度稀释液分别进行扩增, 每个浓度重复 3 次, 计算 Ct 值的标准偏差 (SD 值 ) 和相对标准偏差 (RSD 值 ) 实际样品检测为了验证建立的实时荧光 PCR 检测方法在实际检测中的可应用性, 本研究对收集购买的标注含有 三文鱼 成分的 25 份实际样品进行测试 每个样品取样 2 份, 提取 DNA 后分别采用 18S rrna 12S rrna 引物以及建立的鲑亚科鱼类检测引物和探针进行扩增, 每个样品重复扩增 2 次 用 18S rrna 和 12S rrna 引物进行扩增是为了确保 DNA 的有效提取, 避免假阴性出现 2 结果与分析 2.1 检测方法的特异性测试为了鉴定建立的实时荧光 PCR 检测体系特异性, 以鲑亚科 白鲑亚科和茴鱼亚科鱼 近缘科目鱼类样品和常见动植物样品 DNA 为模板, 采用建立的实时荧光 PCR 检测方法进行扩增 实验结果如图 1 所示, 所有鲑亚科鱼类样品均产生显著的荧光增幅,Ct 值介于 之间 ( 图 1A); 而以白鲑亚科 茴鱼亚科和近缘科目的其他鱼类以及常见动植物样品 DNA 为模板均无荧光扩增信号 ( 图 1B), 采用 18S rrna 和 12S rrna 引物对所有样品进行扩增, 均可见目的条带 ( 数据未在此呈现 ) 因此, 建立的实时荧光 PCR 检测方法特异于鲑亚科鱼类检测 4

5 图 1 实时荧光 PCR 方法的特异性测试 Fig.1 Specificity tests of real-time PCR method (A) 以鲑亚科 20 个鱼样为模板的扩增均产生扩增曲线, 空白对照无扩增曲线 ;(B) 阳性扩增曲线为以大西洋鲑鱼为模板的扩增, 以非鲑亚科 41 个鱼样为模板的扩增均无扩增曲线, 空白对照无扩增曲线 2.2 检测方法的灵敏度测试对建立的实时荧光 PCR 检测体系灵敏度的测试包括绝对灵敏度和相对灵敏度测定 绝对灵敏度测试是根据鱼样 DNA 的实际浓度 ( 拷贝数 ) 确定检测方法的检测下限 (LOD) 选取代表性的五个品种鲑亚科样品, 分别扩增 ng/µl 浓度的 DNA 稀释液, 结果如表 2 所示 虹鳟和大西洋鲑鱼样品可稳定检出的最低浓度为 0.01 ng/µl, 即检测下限为 50 pg ( 模板为 5 µl) 北极红点鲑 太门哲罗鲑和尖吻细鳞鲑可稳定检出的最低浓度为 0.02 ng/µl, 即检测下限为 100 pg 综合五个鱼种的检测结果, 本研究建立的实时荧光 PCR 体系的绝对灵敏度可达到 100 pg DNA 表 2 实时荧光 PCR 检测的绝对灵敏度测试 Table 2 Absolute LOD Tests by Real-time PCR 样品 浓度 (ng/µl) 虹鳟 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 11/20* 北极红点鲑 20/20 20/20 20/20 20/20 19/20 16/20 5/20 太门哲罗鲑 20/20 20/20 20/20 20/20 19/20 8/20 0/20 尖吻细鳞鲑 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 13/20 8/20 大西洋鲑鱼 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 19/20 9/20 注 :*11/20 指 20 次检测检出 11 次 相对灵敏度测试是将鲑亚科鱼样本按照不同的重量百分比掺入植物基质 ( 玉米粉 ) 禽肉基质( 鸡 肉泥 ) 或其它鱼肉基质 ( 鲫鱼泥 ) 中, 测定可以稳定扩增的最低百分比浓度 采用制备的梯度混合样品, 即 10% 1% 0.1% 0.01% 和 0.001% DNA 为模板进行扩增, 结果如表 3 所示 仅有当大西洋鲑鱼肉 混入玉米粉中时可以稳定检出的最低百分比浓度为 % 而大西洋鲑鱼肉混入鸡肉粉和鲫鱼粉, 或 红点鲑鱼肉混入三种基质中的样品可稳定检出的最低百分比浓度均为 0.01 % 综合上述结果, 本研究建 立的实时荧光 PCR 体系的相对灵敏度可达到 0.01 % 表 3 实时荧光 PCR 检测的相对灵敏度测试 Table 3 Relative LOD Tests by Real-time PCR 5

6 样品基质样品编号 百分比 (W/W)( 编号 ) 10 %(1) 1 %(2) 0.1 %(3) 0.01 %(4) %(5) 玉米粉 Aa 20/20 20/20 20/20 20/20 19/20* 大西洋鲑鱼 鸡肉粉 Ab 20/20 20/20 20/20 20/20 8/20 鲫鱼粉 Ac 20/20 20/20 20/20 20/20 9/20 玉米粉 Ba 20/20 20/20 20/20 20/20 5/20 北极红点鲑 鸡肉粉 Bb 20/20 20/20 20/20 20/20 5/20 鲫鱼粉 Bc 20/20 20/20 20/20 20/20 7/20 注 :*19/20 指 20 次检测检出 19 次 2.3 检测方法的可重复性测试 为了测定检测方法的可重复性, 采用虹鳟和大西洋鲑鱼样品 DNA 的 5 个浓度梯度稀释液分别进行 扩增, 结果如表 4 所示, 虹鳟鱼样五个浓度样品的 Ct 值 SD 值介于 0.01 至 0.19,RSD 值介于 0.03 至 0.72; 大西洋鲑鱼样各浓度 DNA 扩增 Ct 值的 SD 介于 0.11 至 0.18,RSD 介于 0.36 至 0.51, 均在可接受范围 内 因此, 建立的实时荧光 PCR 检测体系具有较好的可重复性 表 4 实时荧光 PCR 重复性测试 Table 4 Repeatability Tests by Real-time PCR 样品 浓度 (ng/µl) Ct 值 REP1 REP2 REP3 平均 Ct 值 SD RSD (%) 虹鳟 大西洋鲑鱼 实际样品测定 对 25 份购买的市售实际样品测定结果表明, 所有样品在采用 18S rrna 引物时均可扩增出目的条带 ( 图 2A), 表明所有样品均成功提取出适于扩增的 DNA; 采用 12S rrna 引物 ( 用于鱼类成分鉴定 ) 可 在除 12 号和 14 号样品为模板的扩增中出现目的条带 ( 图 2B), 表明除 12 和 14 号样品外其余 23 个样 品均含有鱼类成分 6

7 图 2 实际测试样品 DNA 的 PCR 扩增结果 Fig.2 PCR results of 25 commercial samples 18S rrna 引物 (A) 和 12S rrna 引物 (B) 扩增图 泳道 1-25 分别为表 5 中 1-25 号测试样品的扩增结果,M 为 DL2000 分 子量标准,B 为空白对照,P 为阳性对照 采用建立的鲑亚科鱼类实时荧光 PCR 方法进行扩增时, 在 号样品中没有显著的荧 光增幅, 即无阳性扩增曲线, 表明上述 4 个样品未检出鲑亚科鱼类成分 而根据 12S rrna 的扩增结果, 号样品有目标条带产生, 表明可能存在用其他鱼代替鲑亚科鱼的假冒现象 表 5 实际样品实时荧光 PCR 检测结果 Table 5 Detection Results of Commercial Products by Real-Time PCR 编号 商品名称 检测结果 编号 商品名称 检测结果 编号 商品名称 检测结果 1 味噌渍秋鲑 + 10 香肠 + 19 三文鱼颗粒面 + 2 三文鱼块一 + 11 三文鱼营养米粉 + 20 蜜汁三文鱼 + 3 鱼子酱 + 12 三文鱼蔬菜泥一 - 21 三文鱼蔬菜泥二 + 4 烟熏三文鱼 + 13 三文鱼营养面条一 + 22 三文鱼籽 + 5 狗鲑鱼扒 + 14 三文鱼蔬菜米粉 - 23 三文鱼奶酪 + 6 三文鱼块二 + 15 三文鱼营养面条二 + 24 火腿肠 + 7 香草三文鱼一 + 16 三文鱼营养面条三 - 25 香草三文鱼二 + 8 腌渍大麻哈鱼一 + 17 红三文鱼色拉 + 9 腌渍大麻哈鱼二 + 18 鱼肉酥 - 注 : + 表明有荧光扩增信号, - 表明无荧光扩增信号 3 讨论鲑亚科鱼类作为重要的经济鱼类在全世界需求量逐年增加 由于鲑亚科鱼类大多价格较高, 受利益驱使, 市场上鱼龙混珠 以次充好现象时有发生 新鲜鱼肉从外观上本来就很难鉴别真伪, 经过加工后就更难分辨 对于鲑科鱼类的鉴定, 仅在十年前有学者采用 RFLP 标记方法鉴定大西洋鲑鱼和虹鳟的报 7

8 道 [19.20], 近来有研究者基于 ITS1 基因建立了实时荧光 PCR 方法鉴定大西洋鲑鱼 [15] 而目前, 国内外还没有针对鲑亚科鱼类鉴定方法的报道 基于此, 本研究利用鲑亚科鱼类的保守基因 生长激素基因建立了实时荧光 PCR 方法用于检测食品中鲑亚科鱼类成分 经实验室的全面测试, 建立的检测方法特异于鲑亚科鱼类的检测, 且具有很好的可重复性 ; 检测方法可稳定检测到的 DNA 量可达 100 pg, 相对 LOD 为 0.01 % 鲑亚科鱼类成分, 与对大西洋鲑鱼建立的实时荧光 PCR 检测方法的检测灵敏度相当 [6], 可以满足日常检测的要求 对市售实际样品的检测结果表明,25 份样品有 4 份未检出鲑亚科鱼类成分, 而其中 2 份检出了鱼源性成分, 表明存在以其它鱼种假冒鲑亚科鱼类的可能性 综上, 本研究建立的适于食品中鲑亚科鱼类鉴定的实时荧光 PCR 方法具有很好的特异性 可重复性和灵敏度, 可以满足口岸和相关实验室日常检测需要, 为我国食品市场的规范化和有序化提供必要的技术支撑 参考文献 : [1] 孙大江, 王炳谦. 鲑科鱼类及其养殖状况 [J]. 水产学杂志, 2010, 2(23): [2] 周井娟, 陈林兴. 世界三文鱼的贸易格局及发展预测 [J]. 农业经济与管理, 2012, 2: [3] 国家质检总局. 进口食品 化妆品警示通报, 2010 年第 57 号, 关于美国进口水产品的警示通报. [4] ROSALEE S. R, MICHAEL T M. Application of DNA-based methods to identify fish and seafood substitution on the commercial market[j]. Compr Rev Food Sci F, 2009, 8(2): [5] FABRICE T. Molecular identification methods of fish species: reassessment and possible applications[j]. Rev Fish Biol Fisher, 2009, 19(3): [6] BARDAKCI F, SKIBINSKI DO. Application of the RAPD technique in tilapia fish: species and subspecies identification[j]. Heredity, 1994, 73 (Pt2): [7] PALOMA M, Eva G V. Identification of highly prized commercial fish using a PCR-based methodology[j]. Biochem Mol Biol Edu, 2006, 34(2): [8] 张丽, 张良, 刘书成等. DNA 技术在海洋食品物种鉴定中的应用 [J]. 遗传, 2010, 32(6): [9] 刘帅帅, 李宏, 罗世芝, 刘云国. PCR 技术在肉类掺假检验中的应用进展 [J]. 食品安全质量检测学报, 2011, 6(22): [10] 史艳宇, 刘金华, 逄晓阳等. 实时荧光 PCR 方法检测食品中痕量荞麦成分 [J]. 食品科学, 2009, 30(20): [11] 岳巧云, 陈定虎, 伍朝晖等. 实时荧光 PCR 在鉴别奶粉中掺入大豆成分的应用研究 [J]. 食品科学, 2009, 30(12): [12] HIRD H J, HOLD G L, CHISHOLM J, et al. Development of a method for the quantification of haddock (Melanogrammus aeglefinus) in commercial products using real-time PCR[J]. Eur Food Res Technol, 2005, 220(5-6): [13] MARÍA R, ISABEL G, MIGUEL Á P, et al. Application of a real-time PCR assay for the detection of ostrich (Struthio camelus) mislabelling in meat products from the retail market[j]. Food Control, 2011, 22(3-4): [14] JOHN J D, KELLY E P, STEPHEN D G, et al. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays[j]. Meat Science, 2004, 68(3): [15] HERRERO B, VIEITES J M, ESPIÑEIRA M. Authentication of Atlantic salmon (Salmo salar) using real-time PCR[J]. Food Chem, 2011, 127(3): [16] JASON S, CLARE W, DELLA S, et al. Real-time PCR for quantitative meat species testing[j]. Food Control, 2003, 14(8): [17] MEYER R, CANDRIAN U, LÜTHY J. Detection of pork in heated meat products by the polymerase chain reaction[j]. J AOAC Int, 1994, 77(3): [18] DALMASSO A, FONTANELLA E, PIATTI P, et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs[j]. Mol Cell Probe, 2004, 18(2): [19] CARRERA E, GARCIA T, CÉSPEDES A, et al. Salmon and Trout Analysis by PCR-RFLP for identity authentication[j]. Journal of Food Sci, 1999, 64(3): [20] Carrera Esther, García Teresa, Céspedes A, et al. Identification of smoked Atlantic Salmon (Salmo salar) and Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) using PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism of the p53 Gene[J]. J AOAC Int, 2000, 83(2):

2013, Vol.34, No Salmonidae Oncorhynchus Salvelinus O. mykiss O. keta O. masou S. alpinus S. leucomaenis Hucho H. taimen Brachymystax B. lenok

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