08 资料与方法. 一般资料选取 008 年月 009 年 0 月于我院住院治疗的初治 PNS 患儿例, 男 7 例, 女 8 例, 平均年龄 (.±.9) 岁所有患儿均符合 000 年中华医学会儿科学 [] 分会肾脏病学组修订的 PNS 诊断标准, 均为单纯型 PNS, 并已除外各种继发性肾

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1 天津医药 0 年月第 9 卷第期 07 doi:0.99/j.issn 糖皮质激素受体 mrna 在儿童原发性肾病综合征中的表达意义张碧丽李琛林书祥王文红李莉张瑄范树颖杜悦新摘要目的 : 探讨不同类型糖皮质激素 (GC) 对儿童原发性肾病综合征 (PNS) 患者糖皮质激素受体 (GR) 的影响方法 : 正常儿童为对照组 (N 组 )0 例 ; 例初治 PNS 患儿随机分为泼尼松组 (A 组 )7 例, 曲安西龙组 (B 组 )0 例, 甲基泼尼松龙组 (C 组 )8 例, 均给予相应 GC 治疗并在 0 及 8 周时取静脉血, 通过半定量逆转录 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测外周血单个核细胞 (PBCs) 中 GRα 和 GRβ 的 mrna 表达水平结果 : 未经 GC 治疗时 PNS 组 GRα 低于 N 组,GRβ 高于 N 组, 差异有统计学意义 (P < 0.0) 各组患儿经 GC 治疗后,GRα GRβ 指标组间时间效应差异均有统计学意义 (P < 0.0 或 P < 0.0);GRα 指标时间与组间无交互作用 (P > 0.0),GRβ 指标时间与组间存在交互作用 (P < 0.0) 例 PNS 患儿中 GC 耐药组例, 敏感组 9 例, 组患儿经 GC 治疗后,GRα GRβ 指标组间时间效应差异均有统计学意义 (P < 0.0 或 P < 0.0); 各组 GRα 指标时间与组间效应无交互作用 (P > 0.0), 但 GRβ 指标时间与组间存在交互作用 (P < 0.0) 结论: 在调节 GR 的表达水平上甲基泼尼松龙治疗 PNS 效果较好关键词肾病综合征 RNA, 信使原发性受体, 糖皮质激素糖皮质激素类泼尼松曲安西龙泼尼松龙 Clinical Significance of mrna Expression of Glucocorticoid Receptor in Childhood Nephrotic Syndrome ZHANG Bili,LI Chen,LIN Shuxiang,WANG Wenhong,LI Li,ZHANG Xuan,FAN Shuying,DU Yuexin Department of Nephrology,Tianjin Children s Hospital, Tianjin 0007, China Abstract Objective:To observe the effects of glucocorticoid (GC) on the mrna expression of glucocorticoid receptor (GR) in children with primary nephritic syndrome (PNS). ethods:twenty healthy children were selected randomly as con trol group(n group), PNS kid patients were randomly divided into prednisone group(a group, n=7), triamcinolone group(b group,n=0) and methylprednisolone group(c group,n=8). After corresponding GC application, blood samples were collect ed at 0, and 8 weeks after the treatment with GC. The mrna expression levels of the GR subtypes (GRα and GRβ) in pe ripheral blood mononuclear cells (PBCs) were detected by semi-quantitative RT-PCR. Results:At the 0th week of treat ment with GC, the level of GRα was lower in PNS group than that of N group (P < 0.0). But the level of GRβ was higher in PNS group than that of N group (P < 0.0). After treatment with GC, there were significant differences in time effects of GRα and GRβ between groups (P < 0.0 or P < 0.0).Differences in interaction between groups and time effect were only signifi cant in the level of GRβ (P < 0.0).There were cases of steroid-resistance in PNS children. After treatment with GC, there were significant differences in time effects and GRα and GRβ between the two groups (P < 0.0 or P < 0.0). Differences in interaction between groups and time effect were only significant in the level of GRβ (P < 0.0). Conclusion: There is a better treatment effect of methylpredrisolone on PNS GR regulation. Key words nephrotic syndrome RNA, messenger primary receptors, glucocorticoid glucocorticoids Predni sone Triamcinolone Prednisolone 肾病综合征 (nephrotic syndrome,ns) 是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白通透性增高, 大量血浆蛋白自尿中丢失, 导致一系列病理生理改变的一种临床综合征, 在儿童期以原发性肾病综合征 (primary nephrotic syndrome,pns) 最为常见糖皮质激素 (GC) 是治疗 PNS 的主要药物, 其预后在很大程度上取决于患儿对 GC 的治疗反应本研究应用逆转录 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测外周血单个核细胞 (PBCs) 中糖皮质激素受体 (GR) 的 mrna 水平, 评价其在 PNS 中的表达对反应 GC 疗效的指导意义作者单位 :0007 天津市儿童医院肾内科 ( 张碧丽, 王文红, 李莉, 张瑄, 范树颖, 杜悦新 ), 儿科研究所 ( 林书祥 ); 河北省沧州市中心医院儿科 ( 李琛 )

2 08 资料与方法. 一般资料选取 008 年月 009 年 0 月于我院住院治疗的初治 PNS 患儿例, 男 7 例, 女 8 例, 平均年龄 (.±.9) 岁所有患儿均符合 000 年中华医学会儿科学 [] 分会肾脏病学组修订的 PNS 诊断标准, 均为单纯型 PNS, 并已除外各种继发性肾脏疾病所致的肾病综合征例 PNS 患儿随机分为组, 泼尼松 (A) 组 7 例, 男例, 女例, 年龄.8(.7,9.9) 岁 ; 曲安西龙 (B) 组 0 例, 男例, 女 7 例, 年龄.(.8,8.) 岁 ; 甲基泼尼松龙 (C) 组 8 例, 男例, 女例, 年龄.(.79,.) 岁 PNS 组给药方案及判断激素治疗反应均参照文献 [] 同期选取于我院门诊行扁桃腺切除术及包皮环切术且验尿常规完全正常的儿童 0 例为对照组 (N 组 ), 男例, 女 8 例, 年龄.0(.0,7.) 岁组性别构成 (χ = 0.07) 年龄 (Z =.77) 差异无统计学意义 (P > 0.0) 例 PNS 患儿随访时间均大于个月, 其中激素敏感 9 例, 设为敏感组, 激素耐药例, 设为耐药组 (GC 敏感与耐药判断标准参考文献 []). 方法分别于 0 及 8 周上午 8:00~9:00 无菌操作下取 PNS 患儿外周静脉血约 ml,n 组儿童只在 0 周同样时间段取血次, 均放入含肝素真空采血管中肝素抗凝血 ml 用 Hanks 液等量稀释, 缓慢加至淋巴细胞分离液表面, 00 r/min 离心 min, 吸出单个核细胞层并用 Hanks 液洗涤次, 最后所得沉淀即 PBCs 取已分离出来的淋巴细胞, 放入. ml 的无 RNA 酶的离心管中离心弃上清液后提取 RNA( 采用加拿大 BBI 公司生产的总 RNA 提取试剂盒 ) 将提取的 RNA 加入 RT-PCR 试剂盒 ( 杭州博日公司生产 ) 进行 PCR 引物分别为,GRα 上游 -ACCAATCAGATACCAAAATA-, 下游 -ATACACCAACAGAAAGTCTA- ;GRβ 上游 -AAAGCA CATCTCACACATTA-, 下游 -AAAACACATTCACCTACAG C- ;β-actin 上游 -CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-, 下游 -GCTGTCACCTTCACCGTTCC-,GRα 和 GRβ 的上下游引物参照文献 [] 设计,β-actin 上下游引物参照上海闪晶分子生物技术研究所提供的 β-actin 序列设计, 由南京金思特科技有限公司合成 PCR 反应条件为 9 预变性 min,9 变性 0 s, 退火 0 s,7 延伸 s, 以上步循环次,7 延伸 min 后得到 PCR 产物取 μl PCR 产物, 以 % 琼脂糖水平凝胶于 DYY-Ⅲ 型电泳仪电泳 ( 北京六一仪器厂生产 )0 min, 电压 7 V, 电流 0~0 ma, 凝胶成像系统 (Tanon-00, 天能科技上海有限公司 ) 下观察 PCR 结果, 扩增片段长度分别为 (GRα ;GRβ 797 ; 内参 8 ), 进行电泳条带的灰度比对和半定量分析. 统计学处理采用 SPSS.0 统计软件进行统计学分析计量资料以 x ±s 表示, 组独立样本比较采用 t 检验 ; 多组间多时点比较采用重复测量资料方差分析计数资料比较采用 χ 检验,P < 0.0 为差异有统计学意义 Tianjin ed J, Nov 0, Vol 9 No 结果. 0 周时 PBCs 中 GR mrna 的表达未经 GC 治疗时 PNS 组及 N 组 PBCs 中均有 GRα 表达,PNS 组和 N 组 GRβ 表达分别为 0 例和例, 见图 PNS 患儿 GRα 表达水平低于 N 组 [(0. ± 0.)vs (0.7 ± 0.0)],GRβ 表达水平高于 N 组 [(0.09 ± 0.09)vs(0.0±0.00)], 差异有统计学意义 (t 分别为. 和., 均 P < 0.0). GC 各治疗组 0 及 8 周 GRα 和 GRβ mrna 表达结果比较各组患儿经 GC 治疗后,GRα GRβ mrna 指标组间效应时间效应差异均有统计学意义 ( 均 P < 0.0); 各组 GRα 指标时间与组间效应无交互作用 (P > 0.0),GRβ 指标时间与组间存在交互作用 (P < 0.0), 见表, 图指标组别 GRα A 组 B 组 C 组 GRβ A 组 B 组 C 组表各治疗组 0 及 8 周时 GRα 和 GRβ mrna 比较 (x ±s) n 周 0.90±0.8 0.±0.8 0.± ± ± ±0.7 周 0.9± ± ± ±0. 0.9±0. 0.±0. 8 周 0.98± ±0. 0.7±0. 0.± ± ±0. GRα:F 组间 =.97,F 时间 =.909,P < 0.0,F 交互 =.70,P > 0.0;GRβ: F 组间 =.,F 时间 =0.88,F 交互 =.099, 均 P < 0.0. 激素敏感组与耐药组 GRα 和 GRβ mrna 的表达组患儿经 GC 治疗后,GRα GRβ 指标组间效应和时间效应差异均有统计学意义 ( 均 P < 0.0); 组 GRα 指标时间与组间效应无交互作用 (P > 0.0),GRβ 指标时间与组间存在交互作用 (P < 0.0), 见表表激素敏感组与耐药组患儿的 GRα GRβ mrna 的比较 (x ±s) 指标组别 GRα 敏感组耐药组 GRβ 敏感组耐药组 n 周 0.7±0. 0.0± ± ±0.0 周 0.±0. 0.9±0. 0.9± ± 周 0.8± ± ± ±0.09 GRα:F 组间 =.97,F 时间 =7.9, 均 P < 0.0,F 交互 =.,P > 0.0; GRβ:F 组间 =.099,F 时间 =0.88,F 交互 =.,P < 0.0 讨论 GR 包括 GRα 和 GRβ 亚型, 其中 GRα 可与 GC 结合并使其发挥抗炎和免疫抑制的药理作用位于

3 天津医药 0 年月第 9 卷第期细胞质中的 GRα 与热休克蛋白 90(HSP90) 结合后呈非活化状态, 一旦 GC 进入细胞,GC 与 GRα 结合, 使 GR 构象发生改变, 则 HSP 90 与之解离且发生磷酸化,GRα 即转变为活性状态活化后的 GRα 与 GC 结合发挥其作用的机制主要有个方面 :()GRα 快速地转位进入细胞核, 直接作用于基因表达, 导致相应基因的转录活性增强并合成相应的蛋白质, 产生生理及药理作用 () 通过 GRα 与其他转录因子相互作用间接作用于基因, 从而抑制相应蛋白的合成 () 超大剂量的 GC 有 GR 介导的对第二信使的级联效应研究证实有上调 GRα 作用的药物, 可改 [] 善患儿的治疗和预后 GRβ 位于细胞核, 不与 GC 相结合, 也没有转录活性, 是一种潜在的内源性 GC [] 效应的拮抗因子由于 GRβ 含有完整的转录激活区和 DNA 结合区, 且可以与 GRα 形成异二聚体或与 GRα 竞争结合糖皮质激素反应元件 (GRE) 的结合序列, 在转录水平上与 GRα 相互拮抗, 从而影响 GRα [] 的功能本研究显示 PNS 患儿 PBCs 的 GRα 的表达水平低于正常儿童组,GRβ 的表达水平高于正常儿童,GRα 的低表达可能与 GRβ 的拮抗作用有关, 因此 PNS 的 PBCs 的 GR 表达存在异常, 可能为 PNS 的辅助诊断提供了新的思路 [] GR 与 GC 的疗效密切相关现有研究表明 GRα 是 GC 产生其药理作用的主要因素,GRα 利于 [] GC 治疗效应 ;GRβ 可抑制细胞中 GRα 的转染量, 抑 [7] 制 GRα 的生理作用 GRβ 对 GC 的疗效起负性调节作用有研究报道, 在体外实验中用表达 GRα 和 GRβ 的质粒以 0 转染的情况下 GRβ 能抑制由各种 GC 激活的 GRα 转录活性的 90% 以上, 而在的比例下 GRβ 能够抑制泼尼松曲安西龙激活的 GRα [8] 活性, 但甲基泼尼松龙则几乎不受影响, 可见甲基泼尼松龙比其他 GC 受转显性负作用的影响更小本研究显示 GC 治疗周及 8 周时甲基泼尼松龙组 GRα 表达水平高于同期其他治疗组, 周及 8 周泼尼松组 GRβ 高于同期其他治疗组甲基泼尼松龙是一种中效 GC, 等效剂量下抗炎作用和半衰期分别是氢化可的松的. 倍和倍在各类 GC 中, 甲基泼尼松龙与 GR 亲合力最强, 且发生水钠潴留的不良反应较轻本研究显示周时各 GC 治疗组 GRα 表达均较 0 周下降,8 周回升, 可能由于本实验检测的 GRα 是 mrna 水平,GRα 的 mrna 表达与蛋白表达并非同步所致, 但是随着 GC 对 PNS 治疗时间的延长, 这种总体的改变趋势在 GRα 的 mrna 水平和蛋 09 白水平是一致的, 提示甲基泼尼松龙在调节 GR 的表达水平上对于治疗 PNS 更有利, 且 8 周时可作为观察 GC 疗效的个时间截点有研究认为细胞中 GRα 和 GRβ 的相对水平影响细胞对 GC 的敏感性,GRβ 水平较高时引起 GC 抵 [9] 抗, 在某些疾病状态下 GRβ 表达增加, 细胞内 GRα 和 GRβ 比例失衡可能与 GC 抵抗的关系更为密切, [0] 其中 GRβ 表达起关键作用亦有临床研究表明, GC 耐药患者 GRα 密度及与 GC 的亲和力显著低于 [] GC 治疗敏感患者及正常对照本研究结果显示, GC 敏感组 GRα 表达水平高于激素耐药组, 而 GRβ 表达低于激素耐药组, 提示 PNS 的耐药与 GRα 和 GRβ mrna 表达的紊乱有关,GRα 的 mrna 表达降低,GRβ 的 mrna 表达升高, 可能是造成激素耐药的因素之一, 提示 GRα 及 GRβ 表达水平的高低, 可作为 PNS 患者对 GC 敏感性的一个实验室指标 ( 图见插页 ) 参考文献 [] 中华医学会儿科学分会肾脏病学组. 小儿肾小球疾病的临床分类诊断及治疗 [J]. 中华儿科杂志, 00, 9():7-79. [] 胡学强, 楼之茵, 周国钰. 多发性硬化患者糖皮质激素受体蛋白和 mrna 表达与激素疗效的相关性 [J]. 中华神经科杂志,007,0 (9):0-09. [] Szilagyi K, Podracka L, Franke NE, et al. A new link between steroid resistance, glucocorticoid receptor and nuclear factor kappa Bp in idiopathic nephrotic syndrome[j]. Neuro Endocrinol Lett,009, 0():9-. [] Taniguchi Y, Iwasaki Y, Tsugita, et al. Glucocorticoid recep tor-beta and receptor-gamma exert dominant negative effect on gene repression but not on gene induction[j]. Endocrinology, 00, (7):0-. [] Rhen T,Cidlowski JA.Anti inflammatory action of glucocorti coids-new mechanisms for old drugs[j].n End J ed,00, ():7-7. [] Guess A, Agrawal S, Wei CC, et al. Dose- and time-dependent glu cocorticoid receptor signaling in podocytes[j].am J Physiol Renal Physiol, 00,99():F8-8. [7] Oakley RH,Jewell C,Yudt R,et al. The dominant negative ac tivity of the human glucocorticoid receptor beta isoform.specificity and mechanisms of actio[j].j Binl Chem,999,7(9): [8] Fruchter O, Kino T, Zoumakis E, et al. The human glucocorticoid re ceptor(gr) isoform β differentially suppresses GRα-Induced Trans activation Stimulated by Synthetic Glucocorticoids[J].J Clin Endocr etab, 00, 90():0-09. [9] 何小解, 易著文, 党西强, 等. GRβ 在原发性肾病综合征患儿糖皮质激素耐药中的作用 [J]. 中华儿科杂志,00,():09-. [0] Lewis-Tuffin LJ,Cidlowski JA. The physiology of human glucocorti coid receptorβ(hgrβ) and glucocorticoid resistance[j].ann N Y Aead

4 00 Tianjin ed J, Nov 0, Vol 9 No Sci,00,09():-9. terstitial lung disease[j]. Thorax,00, 9(8):87-9. [] Pujols L,Xaubet A,Ramirez J,et al. Expression of glucocorticoid re (0-0- 收稿修回 ) ceptors alpha and beta in steroid sensitive and steroid insensitive in 短篇与病例报告 doi:0.99/j.issn 经外环集束结扎术治疗精索静脉曲张 ( 本文编辑陆荣展 ) 于春虎刘忠泽苏运强薛健杨春生关键词精索静脉曲张结扎法外环外科手术精索静脉曲张 (varicocecl,vc) 是泌尿外科临床的一种常见疾病, 治疗方法较多, 手术治疗是最佳方法我院 997 年 0 月 009 年 0 月采用经外环法治疗 87 例 VC, 效果较好, 报告如下资料与方法. 一般资料本组患者年龄 ~7 岁, 平均 (.±.) 岁, 病程个月 ~0 年其中初发 77 例 (9.%), 复发 0 例 (.8%); 双侧例 (7.7%), 单侧例 (9.%), 其中单纯左侧例 ;Ⅱ 度曲张例,Ⅲ 度曲张例 ; 以会阴部及下腹部不适就诊者 0 例, 以不育就诊者 8 例所有患者均经腹部及阴囊彩超确诊为非继发性, 精索静脉最大直径均大于 mm,valsalva s 试验阳性. 手术方法麻醉采用腰麻或硬膜外麻醉, 仰卧位于外环口处切口 ~ cm 逐层切开至精索内筋膜, 将精索提出, 分离输精管及其动静脉观察睾丸动脉搏动, 仔细分离出睾丸动脉后, 将可见淋巴管保留, 余静脉集束结扎若发现提睾肌及输精管静脉迂曲扩张者, 同时结扎. 结果 87 例手术均获成功手术时间 0~ min, 术中出血量. ml, 术后平均住院 ~ d 术中睾丸动脉损伤例术后并发睾丸鞘膜积液例 ( 患者 7 岁 ), 睾丸萎缩例, 阴囊轻度水肿例 (.%),~ d 自行吸收, 未发生淋巴性水肿无其他并发症术后 ~ 个月复查精液, 精子活力较术前提高者例 (80.8%) 术后随访 ~ 个月, 未见复发者讨论 VC 发病率为 0%~%, 在男性不育患者中占 0%~ 7.% [] 目前 VC 仍以手术治疗为最佳方法我院采用经外环切口集束结扎法治疗 VC 因该处位置表浅, 解剖层次简单清楚, 易于手术操作手术切口小, 出血少, 术中易分辨分离提睾肌动脉静脉和输精管动静脉, 方便结扎精索外曲张静脉将 % 利多卡因液滴于血管表面, 可减少血管痉挛必要时可借助显微镜观察, 以减少睾丸动脉损伤 [] 有报道 VC 手术中误扎睾丸动脉不会造成睾丸萎缩本组例睾丸动脉损伤, 其中例年龄较大者发生睾丸萎 [] 缩有研究认为保留睾丸动脉, 能保证最佳的睾丸血供笔者认为应尽可能保留睾丸动脉, 减少睾丸萎缩发生本组例 7 岁患者发生鞘膜积液, 手术治愈, 考虑与高龄微循环 [] 差有关 Chen 等认为, 生育能力低下的 VC 患者当精索静脉结扎术后会明显减轻精浆 DNA 的氧化损害, 提高精液的抗氧化能力本组精液标本参数异常者, 术后精液参数均得到了明显改善, 也证实了这一点参考文献 [] Sakamoto H,Saito K,Shichizyo T,et al. Color Doppler utralsonogra phy as a routine clinical examination in male infertility [J]. Int J Urol,00,(8): [] Cayan S,Shavakhabov S,Kadioglu A. Trement of palpable varico cele in infertile men:a eta-analysis to define the best technique [J].J Androl,009,0():-. [] Raman JD,Goldstein. Intraoperative characterization of arterial vasculature in spermatic cord[j].urology, 00, ():-. [] Chen SS,Huang WJ, Chang LS, et al. Attenuation of oxidative stress after varicocelectomy in subfertile patients with varicocele[j].j Urol, 008,79():9-. (0-0- 收稿修回 ) ( 本文编辑闫娟 ) 作者单位 :000 北京市仁和医院泌尿外科

5 重组真核质粒 pegfp-c-hgbp-domain ~ 的构建及表达正文见 990 页 arker Domain Do main 7 Domain 8 Do arker ~ pegfp-c-domain ~ arker 双酶切前双酶切后 main 79 Domain 图目的片段 Domain ~ 的获取图线性 pegfp-c 质粒载体的获取 EcoR Ⅰ/BamHⅠ双酶切图 pegfp-c-hgbp-domain ~ 的双酶切鉴定图 ~ GFP-GBP-Domain~ GFP-GBP 图荧光显微镜下观察重组质粒的表达 0 为 GFP ~ 依次为 GFP-D ~ 图 Western 印迹结果糖皮质激素受体 mrna 在儿童原发性肾病综合征中的表达意义正文见 07 页 PNS 患儿正常对照儿童 arker 图 GC 治疗 0 周时各组 GRmRNA 表达电泳图 ~ 同一患儿治疗 0 8 周时 GRα和 GRβ的表达对照组儿童 arker 图同一患儿 GC 治疗 0 及 8 周 GRα和 GRβ mrna 表达

600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa

600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 599 喘可治注射液联合细辛脑注射液治疗小儿毛细支气管炎的临床研究唐辉英, 佘定平, 马颐娇深圳市儿童医院呼吸科, 广东深圳 518026 摘要 : 目的探讨喘可治注射液联合