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1 ISSN CODEN ZXSKFJ JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY AGRICULTURE AND LIFE SCIENCES 食品营养与安全专辑 Special Issue on Food Nutrition and Safety 2 /2013 Vol.39 No.2 Mar HANGZHOU, CHINA Zhejiang Daxue Xuebao (Nongye yu Shengming Kexue Ban)

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81 王军淋 等 超高效液相色谱 大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素 M 1 第2期 195 左 1 为国标法 经典提取法 提取 其余为乙腈法提取 从左到右依次为 m 牛奶 V 乙腈 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 T he lef t one w as ex t racted by national standard method classical ex traction met hod t he ot hers w ere ex t racted by different ratios of milk to acetonit rile Fro m lef t to rig ht the ratios of milk to acetonitrile w ere 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 respectively 图 3 乙腈提取法与国标法离心后的效果比较 Fig 3 表2 T able 2 Efficiency comparison of acetonit rile ex traction and national standard method af ter centrif ugation 乙腈提取法与国标法检测灵敏度及阳性样品检测结果比较 Comparison of the sensitivity and determination result of positive samples ex tracted by acetonit rile and national standard methods 提取法 Ex t raction methods 1 4 6 w 阳性样品 Positive sample content μ g kg 乙腈提取法 Acetonitrile ex traction met hod 1 04 ± 0 02 1 2 5 1 1 1 01 ± 0 01 0 81 ± 0 02 国标法 National standard met hod 1 0 0 54 ± 0 02 m 牛奶 V 乙腈 1 4 6 1 2 5 1 1 1 0 2畅 4 Ratios of milk to acetonit rile in mass to volume are 1 4 6 1 2 5 1 1 1 0 respectively 线性关系 以 0 1 0 2 0 5 0 8 1 0 1 5 和 2 0 ng ml 黄曲 霉毒素 M1 为标准 在给定条件下进行 UPLC 分析 以 峰面积为 Y 轴 浓度为 X 轴作校准曲线 黄曲霉毒素 M1 检测方法的线性回归方程为 Y 6 20 10 X 2 03 5 10 线性范围为 0 1 2 0 ng ml R 0 999 6 2畅 5 加标回收率及精密度 向空白牛奶样品中添加不同质量分数的黄曲霉 毒素 M 1 每个添加量做 3 个平行 黄曲霉毒素 M 1 4 2 表3 T able 3 的平均回收率在 81 95 94 20 之间 精密度 即相对标准偏差 为 4 61 7 98 表 3 取阳 性样品做日内精密度 n 5 及日间精密度 n 5 实验表 明 日 内 精 密 度 为 3 44 日 间 精 密度 为 4 50 2畅 6 实际样品测定 用本文所建立的方法对我国某地区 某个时间 段的 9 份牛奶样品进行检测表明 黄曲霉毒素 M 1 的检出率为 100 表 4 超标率为 55 56 牛奶样品黄曲霉毒素 M1 的加标回收率和精密度 Recovery rate and precision of aflatoxin M 1 in milk samples 添加量 测定值 相对标准偏差 平均回收率 Spiked level μ g kg Detected value μ g kg Relative standard deviation M ean recovery rate 0 5 0 41 ± 0 03 6 64 82 64 0 2 n 3 1 0 表4 T able 4 0 19 ± 0 02 7 98 0 82 ± 0 04 4 61 94 20 81 95 实际样品中黄曲霉毒素 M1 的检测结果 Determination results of aflatoxin M 1 in real samples 样品号 Sample number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 w 黄曲霉毒素 M 1 Aflatoxin M 1 content μ g kg 1 26 0 12 0 79 0 12 0 67 0 58 0 48 0 03 0 62 3 结论 本研究用乙腈对样品中的黄曲霉毒素 M 1 进行 提取 可以有效地沉淀样品中的蛋白质 从而得到澄 清的提取液 在过免疫亲和柱净化时 只需利用溶液 自身重力作用即能过柱 解决了国标法中直接过柱 易堵塞的问题 提高了提取效率 缩短了前处理时 间 对超高效液相色谱系统分离条件的优化 大大缩 短了分析时间 减少了有毒溶剂使用量 同时 采用

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86 浙 江 大 学 学 报 农业与生命科学版 20 0 模型组小鼠肝脏增大 表面充血发红 间有黄色细小 颗粒 边缘变钝 被膜紧张 粗糙并有脂肪附着 切面 略带油腻感 各绿花椰菜水提物作用组小鼠肝脏颜 色 光滑度等较酒精模型组有不同程度地改善 肝脏 体积略有增大 有少量脂肪附着 其中 绿花椰菜水 提物高剂量组小鼠肝脏呈红褐色 质地均匀 除光滑 T able 2 第39卷 度稍差外 与阴性对照组差异不明显 畅 2畅 2畅 2 绿花椰菜水提物对肝脏 体质量比值的影响 由表 2 可见 与阴性对照组相比 酒精模型组肝质 量 肝体比明显增加 P 0 05 与酒精模型组相 比 各绿花椰菜水提物处理组肝质量 肝体比明显降 低 P 0 01 畅 与肝脏大体观察结果一致 畅 表 2 绿花椰菜水提物对小鼠体质量 肝质量及肝体比的影响 Effect of broccoli ex t raction solution on the body mass liver mass ratio of liver to body mass in mice 组别 肝质量 体质量 肝体比 G roups Liver mass g Body mass g Ratio of liver to body mass 阴性对照组 Negative control g roup 1 224 ± 0 264 18 800 ± 1 764 0 065 ± 0 010 酒精模型组 Positive et hanol g roup 1 445 ± 0 156 19 322 ± 1 604 0 075 ± 0 007 19 180 ± 0 869 0 060 ± 0 008 倡 18 380 ± 1 724 0 061 ± 0 009 倡 20 757 ± 1 674 0 053 ± 0 003 倡 低剂量组 Low dose broccoli ex t ract g roup 1 152 ± 0 149 倡 中剂量组 M oderate dose broccoli ex t ract g roup 1 120 ± 0 205 倡 高剂量组 Hig h dose broccoli ex t ract g roup 1 104 ± 0 108 倡 与阴性对照组相比 P 0 05 与酒精模型组相比 倡 Co mpared with negative cont rol g roup 倡 倡 倡 倡 P 0 01 P 0 05 co mpared with positive et hanol g roup 2畅 2畅 3 肝组织病理学 HE 染色 检查 肝脏病 理学检查结果见图 2畅 阴性对照组小鼠肝脏组织结 构完整 细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状 整齐排列 肝小叶轮廓清晰 肝细胞分界清 核圆而 清晰 位于细胞中央 细胞质丰富 无脂肪变性和炎 症反应 畅 酒精模型组小鼠肝小叶界限不清 肝细胞 浆出现不同程度的空泡变性 以肝包膜下的肝细胞 为明显 胞浆透明 小叶各带可见散在的点 灶状坏 死 坏死灶及肝窦内可见较多量嗜中性粒细胞 淋巴 细胞及单核细胞浸润 畅 SFN 低剂量组和中剂量组肝 细胞中浊肿明显减轻 有散在炎细胞浸润 肝细胞内 偶有小脂滴 SFN 高剂量组细胞索排列较整齐 肝 细胞呈现多边形 细胞分界清 核圆而清晰 位于细 胞中央 细胞质未见脂肪滴 畅 2畅 3 绿花椰菜水提物对小鼠血清中 ALT AST 和 ALP 水平的影响 由表 3 可知 与阴性对照组相比 酒精模型组小 鼠血清中 ALT 水平明显升高 P 0 01 为阴性对照 组 ALT 水平的 3 9 倍 AST 和 ALP 水平也有升高 P 0 05 分别为阴性对照组的 1 27 倍和 1 51 倍 提示酒精引起了肝脏损伤 给予绿花椰菜水提物后 与酒精模型组相比 低剂量组小鼠 ALT AST 和 ALP 水平未出现差异性变化 中剂量组 ALT AST 和 ALP 图2 Fig 2 倡 倡 倡 倡 倡 P 0 01 绿花椰菜水提物对小鼠肝脏组织的病理改变 HE 染色 400 Effect of broccoli ex traction solution on t he liver pathology in mice H E staining 400 水平明显降低 P 0 0 1 或 P 0 05 高剂量组 ALT

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110 浙 江 大 学 学 报 农业与生命科学版 22 4 用 HA T 培养基按 1 10 个细胞 孔铺板培养 连 续进行 3 4 轮后克隆筛选 挑选效价高的阳性克隆 扩大培养 畅 采用小鼠体内诱生腹水的方法生产单克 6 隆抗体 每只小鼠大约注射 1 10 个细胞 8 10 d 后即开始采集腹水 畅 腹水经硫酸铵沉淀并透析 蛋 白 G 亲和层析纯化 用 SDS PAGE 分析抗体纯度 畅 用 ELISA 方法检测未纯 化腹水 及纯 化 后 抗体 的 效价 1畅 2畅 3 多克隆抗体的制备与纯化 用完全弗氏 佐剂与小麦球蛋白 1 1 混合 对新西兰白兔进行首 次免疫 采取皮下及肌肉多点注射 后续免疫采用不 完全弗氏佐剂与抗原 1 1 混合 间隔 4 周后进行第 2 次免疫 间隔 3 周后进行第 3 次免疫 间隔 3 周后 进行第 4 次免疫 畅 采取一次性颈动脉放血 取上清 硫酸铵沉淀 透析去盐 畅 用蛋白 A 亲和层析柱对抗 小麦球蛋白血清进行纯化 得到高效价 高纯度的 抗小麦球蛋白多克隆抗体 畅 用 ELISA 法检测抗体 效价 畅 1畅 2畅 4 双抗夹心 ELISA 方法的建立及其灵敏度 和特异性 检 测 以 鼠 源 单 克隆 抗 体 包 被 酶 标 板 以兔源多克隆抗体为夹心二抗 用 HRP 标记 的羊抗兔抗体进行检测 建立 ELISA 方法 畅 将抗 原稀释至 1 μg ml 并连续 2 倍稀释 用优化后的 ELISA 方法检测 根据 P N 值大于 2 检验该方法 的灵敏度 畅 特异性检验分别用抗原和其他来源的 蛋白测试抗体的交叉反应状况 畅 5 2 第39卷 1 1 10 β casein 单 抗 的 效 价 略 高 于 β conglycinin 单抗 畅 7 M 蛋白 标 准 分 子 质 量 1 β casein 单 克 隆 抗 体 2 β conglycinin 单克隆抗体 畅 M Protein molecular mass marker 1 β casein M ca b 2 β conglycinin M cab 图1 纯化后 β casein 和 β conglycinin 的单克隆抗体 电泳图 Fig 1 Electropherogram of purified β casein and β conglycinin monoclonal antibodies McAb 结果 2畅 1 单克隆抗体 通过免疫原的制备 BALB c 小鼠免疫 细胞 融合 间接 ELISA 筛选及 3 次阳性细胞亚克隆 获 得分泌 β casein 和 β conglycinin 单克隆抗体的杂交 瘤细胞株各 1 株 分别经扩大培养 注射小鼠 获 得腹水 含单抗的腹水经盐析 透析后过蛋白 G 亲 和 层 析 柱 纯 化 后 分 别 获 得 β casein 和 β conglycinin 的高纯单克隆抗体 畅 2 种纯化后的单抗 SDS PAGE 电泳结果见图 1畅 将纯化后的单克隆抗体从 1 100 开始作 10 倍梯度稀释测定效价 以 405 nm 处的吸光值为纵 坐标 抗体稀释倍数为横坐标绘图 以阴性血清为 对照 2 种单抗效价测定结果见图 2畅 从中可以看 出 以抗体吸光值 2 倍于阴性血清吸光值时的最 大稀释倍数作为抗体效价 2 种抗体的效价均达到 图2 Fig 2 2畅 2 β casein 和 β conglycinin 单克隆抗体效价 T iters of β casein and β conglycinin M ca b 多克隆抗体 用 β casein 和 β conglycinin 为抗原分别免疫新 西兰白兔 3 次免疫兔后耳静脉采血 分离血清 经 盐析 透析和蛋白 A 亲和层析获得高纯的多克隆抗 体 按 3 倍梯度稀释抗体 以阴性血清作为对照 采 用常规 ELISA 方法测定其效价 结果见表 1畅 从中 5 可以 看 出 2 种 多 克 隆 抗 体 的 效 价 在 1 2 10 左右

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124 Zhejiang Daxue Xuebao (Nongye yu Shengming Kexue Ban) FAO (CA) (AJ) (ZR) (FSTA) (Agrindex) (BIOSIS) (IC) (CABI) RCCSE Journal of Zhejiang University (Agriculture & Life Sciences) ( 1956 ) 39 2 ( 177 ) (Bimonthly, Started in 1956) Vol.39 No.2 (General Serial No. 177) Mar. 20, zdxbnsb zju.edu.cn Responsible Unit: Ministry of Education of the People's Republic of China Sponsor Unit: Zhejiang University Editor in Chief: ZHU Jun Editing Unit: Editorial Board of Journal of Zhejiang University (Agric. & Life Sci.) Commun. Add: 148 Tianmushan Road, Hangzhou , China Website: zdxbnsb@zju.edu.cn Tel: Publishing Unit: Zhejiang University Press Co., Ltd. Printing Unit: Hangzhou Fengyuan Printing Co., Ltd. Domestic Distribution: Zhejiang Post Office Domestic Subscription: Local Post Office Overseas Distribution: China International Book Trading Corporation (P. O. Box 399, Beijing , China) Dewey #:630 CODEN ZXSKFJ ISSN CN /S BM

王军淋 等 超高效液相色谱 大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素 M 1 第2期 195 左 1 为国标法 经典提取法 提取 其余为乙腈法提取 从左到右依次为 m 牛奶 V 乙腈 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 T he lef t one w as ex t racted by national standard method classical ex traction

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