654 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (6): time, and its antioxidant capacity decreased significantly with prolonged stress. Ou

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1 植物生态学报 2011, 35 (6): Chinese Journal of Plant Ecology doi: /SP.J 黄土高原冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应 1,2 单长卷 1 韩蕊莲 1* 梁宗锁 1 西北农林科技大学生命学院, 陕西杨凌 ; 2 河南科技学院生命科技学院, 河南新乡摘要通过盆栽实验, 对干旱胁迫下黄土高原地区冰草 (Agropyron cristatum) 叶片的抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢相关酶及物质含量进行了研究结果表明 : 冰草可以通过增强叶片的抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢酶 : 抗坏血酸过氧化物酶谷胱甘肽还原酶脱氢抗坏血酸还原酶单脱氢抗坏血酸还原酶 L- 半乳糖酸 -1, 4- 内酯脱氢酶和 γ- 谷氨酰半胱氨酸合成酶活性, 维持植物体内抗坏血酸和谷胱甘肽水平及氧化还原状态, 从而抵御干旱造成的氧化胁迫但叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对不同水平干旱胁迫的响应, 随胁迫时间的延长而不同在胁迫 24 天以前, 严重干旱下叶片的抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢增强较显著 ; 在胁迫 24 天后, 由于该胁迫下植物所遭受的氧化胁迫较为严重, 叶片中上述 6 种酶的活性均呈降低趋势而在中度干旱下叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢相关的 6 种酶在整个胁迫过程中均保持较高的活性这说明, 冰草能够长时间有效地抵御中度干旱所造成的氧化胁迫, 但只能在一定时间范围内有效地抵御严重干旱所造成的氧化胁迫, 胁迫时间延长则会降低其抵御严重干旱的能力关键词冰草, 抗坏血酸, 干旱胁迫, 谷胱甘肽, 黄土高原 Responses to drought stress of the biosynthetic and recycling metabolism of glutathione and ascorbate in Agropyron cristatum leaves on the Loess Plateau of China SHAN Chang-Juan 1,2, HAN Rui-Lian 1, and LIANG Zong-Suo 1* 1 College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi , China; and 2 School of Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, Henan , China Abstract Aims Our objective was to clarify the mechanism of drought tolerance for Agropyron cristatum on the Loess Plateau of China through investigation of drought stress on the biosynthetic and recycling metabolism of glutathione and ascorbate in leaves. Methods We investigated the levels and redox status of glutathione and ascorbate and the activities of galactonolactone dehydrogenase (GalLDH), gamma glutamyl cysteine synthetase (γ-ecs), ascorbate peroxidase glutathione reductase (APX), glutathione reductase (GR), dehydroascorbate reductase (DHAR) and monodehydroascorbate reductase (MDHAR) in the leaves of A. cristatum under different levels of artificial drought stress using pot experiments. Important findings Levels of glutathione and ascorbate and their redox status were maintained under drought stress by increasing activities of GalLDH, γ-ecs, APX, GR, DHAR and MDHAR involved in the metabolism of glutathione and ascorbate. This protected A. cristatum from oxidative damage induced by drought stress. However, there were differences in the responses of the metabolism of glutathione and ascorbate related to different drought stress levels with prolonged stress. With 24 or fewer days of stress treatment, the metabolism of glutathione and ascorbate was enhanced under severe drought stress. After 24 days of stress treatment, the activities of GalLDH, γ-ecs, APX, GR, DHAR and MDHAR decreased significantly under severe drought stress, because A. cristatum suffered more severe oxidative damage. However, the activities of these enzymes were maintained throughout the whole period of stress under moderate drought stress. This suggested that A. cristatum could effectively protect itself from oxidative damage induced by moderate drought stress for long time periods. However, A. cristatum could only effectively protect itself from oxidative damage induced by severe drought stress for limited 收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 通讯作者 Author for correspondence ( liangzs@ms.iswc.ac.cn)

2 654 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (6): time, and its antioxidant capacity decreased significantly with prolonged stress. Our results also suggested that ascorbate and glutathione had important roles in protecting against oxidative damage under drought stress. Key words Agropyron cristatum, ascorbate, drought stress, glutathione, Loess Plateau 冰草 (Agropyron cristatum) 是草原区旱生植物, 又名野麦子扁穗冰草羽状小麦草, 为禾本科冰草属的一种多年生旱生牧草, 具有很强的抗旱性和抗寒性, 是一种良好的水土保持植物和固沙植物同时, 冰草草质柔软, 具有较高的营养价值, 是我国北方干旱半干旱地区建立人工草地天然草地补播和退化草地建植的优良草种 ( 高海娟等, 2007) 乡土冰草种群是黄土高原干旱半干旱区重要的生态屏障, 对于该区的生态保护和植被恢复具有重要的意义, 在维持该区生态系统的稳定性和可持续性上发挥着重要作用在黄土高原地区, 水分不足及供需时间不一致的矛盾表现得十分突出因此, 水分是制约黄土高原地区植被恢复与重建的主要限制因子由于乡土冰草种群在黄土高原地区的生态建设中具有重要作用, 许多科研工作者开展了对乡土冰草抗旱性及其抗旱机制的研究到目前为止, 关于乡土冰草抗旱性及抗旱机制的研究主要集中在形态和水分生理生态特性上在形态上, 具有十分发达的根系是冰草抵御干旱的重要策略 ( 唐龙, 2005) 在水分生理生态特性上, 冰草属于低蒸腾低耗水的草种, 在水分亏缺下可以减少耗水和提高水分利用率 ( 唐龙, 2005); 还可通过积累渗透调节物质 ( 如脯氨酸和可溶性糖等 ) 和提高抗氧化酶 ( 如超氧化物歧化酶 (SOD) 过氧化物酶(POD) 和过氧化氢酶 (CAT) 等 ) 活性, 抵御和适应干旱逆境 ( 李景欣等, 2004; 罗新义等, 2005) 干旱胁迫对植物的伤害主要在于其对植物造成的氧化胁迫, 而增强抗氧化系统是植物适应干旱逆境的重要机制抗坏血酸和谷胱甘肽是植物体内高丰度的小分子抗氧化物质, 是抗氧化系统的重要组成部分, 在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用 (Shao et al., 2008) 植物体内抗坏血酸和谷胱甘肽含量受其合成及循环代谢的调控, 而且其循环代谢相关的主要酶 : 抗坏血酸过氧化物酶 (APX, EC ) 谷胱甘肽还原酶(GR, EC ) 脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR, EC ) 单脱氢抗坏血酸还原酶 (MDHAR, EC ) 也是植物抗氧化代谢的主要酶类, 故抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢是植物抗氧化代谢的重要组成部分因此, 研究冰草抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应, 对揭示其抗氧化机制和抗旱机制具有重要意义本研究采用盆栽试验, 对不同水平干旱胁迫下冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢关键酶 APX GR DHAR MDHAR L- 半乳糖酸 -1, 4- 内酯脱氢酶 (GalLDH, EC ) 和 γ- 谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ-ecs, EC ) 及还原型抗坏血酸 (AsA) 还原型谷胱甘肽(GSH) 总抗坏血酸总谷胱甘肽过氧化氢 (H 2 O 2 ) 和丙二醛 (MDA) 含量以及株高单株总生物量进行了研究, 以期阐明抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢在冰草抵御和适应干旱逆境中的作用, 从而为乡土冰草在黄土高原生态环境重建中的应用提供新的理论依据 1 材料和方法 1.1 植物材料生长条件和处理以种子繁殖的一年生冰草植株为材料, 采用盆栽实验, 在中国科学院水利部水土保持研究所进行露天培养塑料盆重 0.87 kg, 装土后重 5.37 kg, 所用土壤为垆土, 采自陕西杨凌附近的农田, 田间持水量为 28.3%, 土壤全氮为 0.96 g kg 1, 有效氮为 42.3 mg kg 1, 有效磷为 23.2 mg kg 1, 可交换性钾为 216 mg kg 1, 利用称重法将土壤水分控制在田间持水量的 80% 阴雨天时, 利用可移动遮雨棚防止雨水渗入, 盆表面用草覆盖以避免盆土表面的水分蒸发当植株长到 1 个月大时, 进行水分处理共设 3 个处理水平, 分别为田间持水量的 75% 80% ( 正常水平, 对照 ) 55% 60% ( 中度胁迫 ) 和 40% 45% ( 严重胁迫 ), 利用称重法控制土壤水分含量, 每天进行称重并补充各处理消耗的水分, 以确保将土壤水分控制在各个处理水平实验重复 5 次, 每次处理 5 盆植株分别在处理的和 40 天时选择植株顶部生长状况基本一致的充分展开叶片, 用液氮速冻并保存于 80 冰箱中, 用于相关指标的测定为了研究抗坏血酸合成抑制剂吖啶黄素对

3 单长卷等 : 黄土高原冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应 655 H 2 O 2 和 MDA 含量的影响, 在胁迫处理第 32 天开始, 分别选择中度干旱和严重干旱处理总盆数的 1/3, 用 1 mmol L 1 吖啶黄素通过叶面喷施进行处理为了研究谷胱甘肽合成抑制剂丁基硫堇亚胺 (BSO) 对 H 2 O 2 和 MDA 含量的影响, 在胁迫处理第 32 天开始, 分别选择中度干旱和严重干旱处理总盆数的 1/3, 用 0.5 mmol L 1 BSO 通过叶面喷施进行处理每 2 天喷施一次, 直到胁迫第 40 天为止在第 40 天时, 选择植株顶部生长状况基本一致的充分展开叶片, 用液氮速冻并保存于 80 冰箱中, 用于测定抑制剂处理的 H 2 O 2 和 MDA 含量 1.2 测定指标和方法 H 2 O 2 和 MDA 含量测定 H 2 O 2 含量按照 Jiang 和 Zhang (2002) 的方法测定, MDA 含量按照 Hodges 等 (1999) 的方法测定 APX GR DHAR 和 MDHAR 活性测定酶液提取参照 Grace 和 Logan (1996) 的方法, 略有修改每个样品取 0.5 g, 用液氮将其在研钵中研成细粉末, 并在 6 ml 50 mmol L 1 KH 2 PO 4 (ph 7.5) ( 内含 0.1 mmol L 1 EDTA, 0.3% (v/v) Triton X-100 和 1% (w/v) PVP) 缓冲液中匀浆在提取 APX 时, 缓冲液中包含 1 mmol L 1 AsA 将上述提取物立即在 r min 1, 2 离心 15 min, 上清液用于 4 种酶活性的测定 APX 活性按照 Nakano 和 Asada (1981) 的方法测定, GR 活性按照 Grace 和 Logan (1996) 的方法测定, MDHAR 活性按照 Miyake 和 Asada (1992) 的方法测定, DHAR 活性按照 Dalton 等 (1986) 的方法测定 GalLDH 和 γ-ecs 活性测定 GalLDH 的提取和活性测定按照 Tabata 等 (2001) 的方法, 略有修改每个样品取 0.1 g, 用研钵将其在液氮中研成细粉末, 然后将粉末在 0.1 mol L 1 KH 2 PO 4 (ph 7.4) ( 含 0.4 mol L 1 蔗糖 ) 缓冲液中匀浆匀浆液用两层滤布过滤, 并立即在 r min 1, 2 离心 10 min, 收集上清液, 然后于 r min 1, 2 离心 20 min 沉淀用 0.5 ml 0.1 mol L 1 KH 2 PO 4 (ph 7.4) ( 含 0.4 mol L 1 蔗糖 ) 缓冲液悬浮, 即为酶液, 用于酶活性测定 2.4 ml 反应体系包含 200 μl 酶液 2 ml 1.05 mg ml 1 Cytc 和 200 μl 56 mmol L 1 L-Gal 测定前, 上述反应液先在 25 孵育 1 min, 加入 L-Gal 后立即测定 550 nm 处吸光值的上升将 1 min 内氧化 1 mmol L 1 L-Gal 所需的酶量为一个酶活性单位, 计算酶活性时所使用的摩尔系数为 17.3 mmol L 1 cm 1, 酶活性表示为 units g 1 FW γ-ecs 的提取和活性测定按照 Rüegsegger 和 Brunold (1992) 的方法, 将 1 min 内生成 1 nmol γ-ec 所需的酶量为一个酶活性单位, 酶活性表示为 units mg 1 蛋白 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽含量测定 AsA 和脱氢抗坏血酸 (DHA) 含量参照 Hodges 等 (1996) 的方法测定, DHA 含量为总抗坏血酸与 AsA 的差值总谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 和 GSH 含量参照 Griffith (1980) 的方法测定, GSH 含量为总谷胱甘肽与 GSSG 的差值蛋白含量测定蛋白含量参照 Bradford (1976) 的方法测定株高和单株总生物量测定在处理和 40 天时, 用直尺测量各处理植株的株高, 用烘干称重法测定各处理的单株总生物量 1.3 统计分析所有数据均为 5 次重复实验所得数据的平均值, 在 p = 0.05 水平上进行方差分析和 Duncan s 多重比较 2 结果 2.1 不同水平干旱胁迫对冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽循环酶 APX GR DHAR 和 MDHAR 活性的影响在正常水分条件下, 冰草叶片 APX GR DHAR 和 MDHAR 活性随着时间的延长变化均不大 ( 图 1) 在中度干旱下, 叶片 4 种酶活性随时间的延长其变化趋势基本一致 4 种酶的活性均在胁迫的第 8 天到第 32 天呈逐渐上升趋势, 在胁迫的第 40 天比第 32 天时略有降低, 且在各个时间点其活性均显著高于正常水平在严重干旱下, 叶片 4 种酶活性的变化趋势亦基本一致, 均在胁迫的第 8 天到第 24 天呈逐渐上升趋势, 在胁迫 24 天以后开始降低, 且胁迫的第和 32 天均显著高于对照, 但在胁迫的第 40 天时与对照无显著差异严重干旱与中度干旱相比, 冰草叶片 APX 和 DHAR 活性在胁迫第 8 和 32 天时差异不显著 ; 在胁迫第 16 和 24 天时, 严重干旱的 APX 和 DHAR 活性均显著高于中度干旱 ; 但在胁迫第 40 天时, 中度干旱的显著高于严重干旱的对 GR 活性而言, 严重干旱与中度干旱相比, 叶片 GR 活性 doi: /SP.J

4 656 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (6): 图 1 干旱胁迫对冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽循环代谢酶抗坏血酸过氧化物酶 (APX) (A) 谷胱甘肽还原酶 (GR) (B) 脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR) (C) 和单脱氢抗坏血酸还原酶 (MDHAR) (D) 活性的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) N M S 分别表示正常水分处理中度干旱处理和严重干旱处理小写字母表示各处理间差异显著 (p = 0.05) Fig. 1 Effects of drought stress on the activities of ascorbate peroxidase (APX) (A), glutathione reductase (GR) (B), dehydroascorbate reductase (DHAR) (C) and monodehydroascorbate reductase (MDHAR) (D) in the leaves of Agropyron cristatum (mean ± SE). N, M, S stand for normal water treatment, moderate drought treatment and serious drought treatment, respectively. Small letters stand for the significant difference at p = 0.05 level. 在胁迫第 8 16 和 32 天时差异均不显著 ; 在胁迫第 24 天时, 严重干旱的 GR 活性显著高于中度干旱 ; 在胁迫第 40 天时, 中度干旱显著高于严重干旱对 MDH- AR 活性而言, 严重干旱与中度干旱相比, 冰草叶片 MDHAR 活性在胁迫第和 32 天时差异均不显著, 而在胁迫第 40 天时, 中度干旱的 MDHAR 活性显著高于严重干旱的 2.2 不同水平干旱胁迫对冰草叶片抗坏血酸和 GSH 合成酶 GalLDH 和 γ-ecs 活性的影响在正常水分条件下, 冰草叶片的 GalLDH 和 γ-ecs 活性随着时间的延长变化均不大 ( 图 2) 在中度干旱下, 叶片的 GalLDH 和 γ-ecs 活性在胁迫的第 8 天到 32 天呈逐渐上升趋势, 在胁迫的第 40 天比第 32 天时略有降低, 且 2 种酶的活性在各个时间点均显著高于正常水平在严重干旱下, 2 种酶活性在胁迫的第 8 天到第 24 天呈逐渐上升趋势, 在胁迫 24 天以后开始降低, 且在胁迫的各个时间点均显著高于对照严重干旱与中度干旱相比, 叶片的 GalLDH 活性在胁迫第 8 天时差异不显著 ; 在胁迫第 16 和 24 天时, 严重干旱的 GalLDH 活性显著高于中度干旱 ; 在胁迫第 32 和 40 天时, 中度干旱的显著高于严重干旱的对 γ-ecs 活性而言, 严重干旱与中度干旱相比, 叶片的 γ-ecs 活性在胁迫第 8 和 24 天时差异不显著 ; 在胁迫第 16 天时, 严重干旱的 γ-ecs 活性显著

5 单长卷等 : 黄土高原冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应 657 图 2 干旱胁迫对冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成酶 L- 半乳糖酸 -1, 4- 内酯脱氢酶 (GalLDH)(A) 和 γ- 谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ-ecs)(b) 活性的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) N M S 分别表示正常水分处理中度干旱处理和严重干旱处理小写字母表示各处理间差异显著 (p = 0.05) Fig. 2 Effects of drought stress on the activities of galactonolactone dehydrogenase (GalLDH) (A) and gamma glutamyl cysteine synthetase (γ-ecs) (B) in the leaves of Agropyron cristatum (mean ± SE). N, M, S stand for normal water treatment, moderate drought treatment and serious drought treatment, respectively. Small letters stand for the significant difference at p = 0.05 level. 高于中度干旱 ; 在胁迫第 32 和 40 天时, 中度干旱的则显著高于严重干旱的 2.3 不同水平干旱胁迫对冰草叶片 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽含量的影响在正常水分条件下, 冰草叶片 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽的含量随着时间的延长变化均不大 ( 图 3) 在中度干旱下, 叶片 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽含量均在胁迫第 8 天到第 32 天呈逐渐上升趋势, 在胁迫第 32 天以后降低, 且在各个时间点均显著高于正常水平在严重干旱下, 叶片 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽的含量在胁迫第 8 天到第 24 天呈逐渐上升趋势, 在 24 天以后开始降低, 且 AsA 总抗坏血酸和总谷胱甘肽在胁迫的各个时间点均显著高于对照, GSH 含量在胁迫的第和 32 天均显著高于正常水平, 但在 40 天时与对照无显著差异严重干旱与中度干旱相比, 叶片 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽的含量在胁迫第 8 天时差异不显著 ; 在胁迫第 16 和 24 天时, 严重干旱的 AsA GSH 总抗坏血酸和总谷胱甘肽含量显著高于中度干旱 ; 在胁迫第 32 和 40 天时, 中度干旱的显著高于严重干旱的 2.4 不同水平干旱胁迫对 AsA/DHA GSH /GSSG 比值 H 2 O 2 MDA 含量和植株生长的影响在正常水分条件下, 冰草叶片的 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 随着时间的延长变化均不大 ( 图 4) 在中度和严重干旱下, 叶片的 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 均在胁迫的第 8 天到第 40 天呈逐渐下降趋势, 且各个时间点的 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 均显著低于正常水平严重干旱与中度干旱相比, 严重干旱下叶片 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 在胁迫的各个时间点均显著低于中度干旱的在正常水分条件下, 冰草叶片的 H 2 O 2 和 MDA 含量随着时间的延长变化均不大 ( 图 5) 在中度和严重干旱下, 叶片的 H 2 O 2 和 MDA 含量均在胁迫的第 8 到 40 天呈逐渐上升趋势, 且各个时间点的 H 2 O 2 和 MDA 含量均显著高于正常水平严重干旱与中度干旱相比, 叶片的 H 2 O 2 含量在胁迫的各个时间点均差异显著 ; MDA 含量在胁迫第 8 天时差异不显著, 在胁迫第和 40 天时, 严重干旱的 MDA 含量均显著高于中度干旱同时, 抗坏血酸和谷胱甘肽合成抑制剂对干旱胁迫下的 H 2 O 2 和 MDA 含量影响的研究表明 ( 表 1), 二者均可以使中度干旱和严重干旱下叶片的 H 2 O 2 和 MDA 含量进一步显著增加, 这说明抑制抗坏血酸和谷胱甘肽的合成会导致干旱对植株所造成的氧化胁迫加剧由图 6 可看出, 在整个处理期间各处理的冰草株高和单株总生物量均呈增加趋势, 但其增加的程度不同正常水分条件下的冰草植株增加最快, 其 doi: /SP.J

6 658 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (6): 图 3 干旱胁迫对冰草叶片还原型抗坏血酸 (AsA) (A) 总抗坏血酸 (B) 还原型谷胱甘肽 (GSH) (C) 和总谷胱甘肽 (D) 含量的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) N M S 分别表示正常水分处理中度干旱处理和严重干旱处理小写字母表示各处理间差异显著 (p = 0.05) Fig. 3 Effects of drought stress on the contents of reduced ascorbate (AsA) (A), total ascorbate (B), reduced glutathione (GSH) (C) and total glutathione (D) in the leaves of Agropyron cristatum (mean ± SE). N, M, S stand for normal water treatment, moderate drought treatment and serious drought treatment, respectively. Small letters stand for the significant difference at p = 0.05 level. 图 4 干旱胁迫对冰草叶片还原型抗坏血酸 / 脱氢抗坏血酸 (AsA/DHA) (A) 和还原型谷胱甘肽 / 氧化型谷胱苷肽 (GSH/GSSG) (B) 的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) N M S 分别表示正常水分处理中度干旱处理和严重干旱处理小写字母表示各处理间差异显著 (p = 0.05) Fig. 4 Effects of drought stress on reduced ascorbate/dehydroascorbate acid (AsA/DHA) (A) and reduced glutathione/oxidized glutathione (GSH/GSSG) (B) in the leaves of Agropyron cristatum (mean ± SE). N, M, S stand for normal water treatment, moderate drought treatment and serious drought treatment, respectively. Small letters stand for the significant difference at p = 0.05 level.

7 单长卷等 : 黄土高原冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应 659 图 5 干旱胁迫对冰草叶片 H 2 O 2 (A) 和丙二醛 (MDA) (B) 含量的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) N M S 分别表示正常水分处理中度干旱处理和严重干旱处理小写字母表示各处理间差异显著 (p = 0.05) Fig. 5 Effects of drought stress on the contents of H 2 O 2 (A) and malondialdehyde (MDA) (B) in the leaves of Agropyron cristatum (mean ± SE). N, M, S stand for normal water treatment, moderate drought treatment and serious drought treatment, respectively. Small letters stand for the significant difference at p = 0.05 level. 表 1 干旱胁迫下抗坏血酸和谷胱甘肽合成抑制剂对冰草叶片 H 2 O 2 和 MDA 含量的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) Table 1 Effects of biosynthetic inhibitors for ascorbate and glutathione on the contents of H 2 O 2 and MDA in leaves of Agropyron cristatum of under drought stress (mean ± SE) 测定指标 Parameters N M M + A M + BSO S S + A S + BSO H 2 O 2 (μmol g 1 DW) 9.5 ± 0.88 e 20.5 ± 1.59 d 27.0 ± 1.99 c 29.3 ± 2.17 c 39.2 ± 3.06 b 47.7 ± 4.29 a 52.0 ± 4.75 a MDA (nmol g 1 DW) 35.0 ± 2.65 e 64.5 ± 5.41 d 73.0 ± 6.13 c 77.1 ± 6.43 c ± 8.55 b ± 9.36 a ± 9.02 a N M M + A M + BSO S S + A S + BSO 分别表示正常水分处理中度干旱处理中度干旱 + 吖啶黄素处理中度干旱 + 丁基硫堇亚胺处理严重干旱处理严重干旱 + 吖啶黄素处理和严重干旱 + 丁基硫堇亚胺处理处理 MDA, 丙二醛 N, M, M + A, M + BSO, S, S + A and S + BSO stand for normal water treatment, moderate drought treatment, moderate drought treatment + acriflavine, moderate drought treatment + buthionine sulfoximine, serious drought treatment, serious drought treatment + acriflavine, serious drought treatment + buthionine sulfoximine, respectively. MDA, malordialdehyde. 图 6 干旱胁迫对冰草株高 (A) 和单株总生物量 (B) 的影响 ( 平均值 ± 标准误差 ) N M S 分别表示正常水分处理中度干旱处理和严重干旱处理小写字母表示各处理间差异显著 (p = 0.05) Fig. 6 Effects of drought stress on the plant height (A) and total biomass (B) per plant of Agropyron cristatum (mean ± SE). N, M, S stand for normal water treatment, moderate drought treatment and serious drought treatment, respectively. Small letters stand for the significant difference at p = 0.05 level. doi: /SP.J

8 660 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (6): 次为中度干旱处理, 严重干旱处理的增加最慢方差分析表明, 在胁迫第 8 天时, 中度干旱与正常水分处理的株高和单株总生物量差异不显著, 而二者均显著高于严重干旱处理在胁迫的第 16 到 40 天, 中度和严重干旱处理的株高和单株总生物量均显著低于正常水分, 且中度干旱的株高和单株总生物量显著高于严重干旱的 3 讨论逆境条件下, 植物体内活性氧的产生和清除平衡遭到破坏, 最终导致细胞膜脂过氧化 H 2 O 2 和 MDA 含量是衡量氧化胁迫程度的两个重要指标 (Sharma & Dietz, 2006; Selote & Khanna-Chopra, 2006) 我们的研究表明, 干旱时冰草叶片的 H 2 O 2 和 MDA 含量均显著高于对照, 且随胁迫强度和时间的延长而增加, 这说明不同程度的干旱胁迫均对叶片造成氧化胁迫, 且胁迫强度越大其氧化胁迫程度越高植物遭受氧化胁迫后, 其氧化还原状态就会发生改变, 通常用 AsA 和 GSH 与其氧化型的比值来表示植物细胞的氧化还原状态, 比值越低说明细胞遭受的氧化胁迫越重本研究表明, 干旱胁迫下冰草叶片的 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 均显著低于对照, 中度干旱的 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 均显著高于严重干旱的, 这再一次说明干旱对冰草造成了氧化胁迫, 且严重干旱造成的氧化胁迫程度显著高于中度干旱抗坏血酸是植物体内一种重要的非酶抗氧化剂和氧化还原物质, 其合成和循环代谢在维持抗坏血酸水平中发挥着积极的作用我们的研究结果表明, 中度和严重干旱下冰草叶片的抗坏血酸循环代谢酶 APX DHAR 和 MDHAR 活性的变化趋势与 AsA 和总抗坏血酸含量的变化趋势一致这说明干旱胁迫激发了冰草叶片中抗坏血酸防御系统, 使清除 H 2 O 2 的 APX 和加快 ASA 循环再生的 MDHAR 和 DHAR 酶活性上升, 从而维持叶片抗坏血酸水平和缓解干旱对植物的伤害这与 Pinheiro 等 (2004) 报道的咖啡 (Coffea canephora) 在干旱胁迫下 APX 和 DHAR 活性升高, MDHAR 活性变化不大的结果不同, 而与马玉华等 (2008) 的研究结果基本一致, 表明这些酶对胁迫的反应因物种而异本研究结果还表明, 中度和严重干旱下叶片抗坏血酸合成关键酶 GalLDH 与 AsA 和总抗坏血酸含量的变化趋势亦一致这说明, 干旱胁迫下抗坏血酸合成酶 GalLDH 活性的增加也是维持冰草叶片抗坏血酸水平的一种重要机制这与 Bartoli 等 (2005) 报道的干旱胁迫下小麦 (Triticum aestivum) 叶片的 GalLDH 活性不决定抗坏血酸含量的结果不一致, 这可能与 GalLDH 对胁迫的反应因物种而异有关本研究的结果表明, 中度和严重干旱下 AsA 水平均高于正常水分条件, 这与 Šircelj 等 (2005) 报道的中度干旱下 AsA 水平高于正常水分, 严重干旱则低于正常水分的结果不一致本研究还表明, 抗坏血酸合成抑制剂处理可以使不同水平干旱胁迫下的 H 2 O 2 和 MDA 含量显著高于没有抑制剂处理的干旱胁迫这进一步说明, 抗坏血酸在冰草抵御干旱胁迫所造成的氧化胁迫中具有重要作用谷胱甘肽是植物体内另一种重要的非酶抗氧化剂和氧化还原物质, 植物体内的谷胱甘肽水平受其合成和循环代谢的调控本研究表明, 中度和严重干旱下冰草叶片谷胱甘肽合成关键酶 γ-ecs 及其循环酶 GR 活性的变化趋势与 GSH 和总谷胱甘肽含量的变化趋势一致这说明, 干旱胁迫下冰草叶片除了通过 GR 再生 GSH 外, 还可通过提高自身的 GSH 的合成能力来保持 GSH 的含量因此, 干旱胁迫下 γ-ecs 及 GR 活性的增加是维持谷胱甘肽水平的一种重要机制, 这与陈坤明 (2003) 的研究结果一致本研究的结果表明, 中度和严重干旱下冰草叶片的 GSH 水平均高于正常水分, 这与马玉华等 (2008) 报道的中度干旱下 GSH 水平高于正常水分, 严重干旱则低于正常水分条件的结果不一致本研究结果还表明, 谷胱甘肽合成抑制剂处理可以使不同水平干旱胁迫下的 H 2 O 2 和 MDA 含量显著高于没有抑制剂处理的干旱胁迫这进一步说明, 谷胱甘肽在冰草抵御干旱胁迫所造成的氧化胁迫中也具有重要作用在不同的干旱胁迫程度下, 冰草叶片的抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢酶活性 AsA 总抗坏血酸 GSH 和总谷胱甘肽含量的变化趋势有所不同随着胁迫时间的延长, 叶片的抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢酶活性及其物质含量在中度胁迫下基本呈上升趋势但在严重干旱下, 合成及循环代谢相关酶活性及物质含量在胁迫前期呈上升趋势, 而在胁迫后期呈下降趋势结合上面的研究结果, 说明冰草能够通过增强抗坏血酸和谷胱甘

9 单长卷等 : 黄土高原冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应 661 肽合成和循环代谢酶活性而增加其物质含量, 进而长时间有效地抵御中度干旱所造成的氧化胁迫而在严重干旱下, 冰草只能在一定时间范围内有效地抵御氧化胁迫, 其原因与胁迫后期抗坏血酸和谷胱甘肽合成和循环代谢酶活性显著降低而导致其物质含量降低有关此外, 本研究还发现, 在胁迫 24 天以前, 尽管严重干旱下冰草叶片的 GalLDH γ-ecs GR 和 DHAR 活性均显著高于中度胁迫的, 但其 AsA/DHA 和 GSH/GSSG 均显著低于中度胁迫的究其原因, 可能是由于严重干旱下冰草具有较高的 APX 活性和其所受到的氧化胁迫 (H 2 O 2 和 MDA 含量较高 ) 较为严重所致综上所述, 我们的研究结果表明, 干旱胁迫条件下冰草可以通过同时上调抗坏血酸和谷胱甘肽合成和循环代谢, 而增加 AsA 总抗坏血酸 GSH 和总谷胱甘肽的含量, 从而降低干旱胁迫对植株所造成的氧化胁迫程度, 使植株得以生存和生长致谢国家十一五科技攻关计划项目 (2008- BAD98B08) 和中国科学院知识创新项目 (KZCX2- YW-443) 资助参考文献 Bartoli CG, Guiamet JJ, Kiddle G, Pastori GM, Di Cagno R, Theodoulou FL, Foyer CH (2005). Ascorbate content of wheat leaves is not determined by maximal L-galactono-1, 4-lactone dehydrogenase (GalLDH) activity under drought stress. Plant, Cell & Environment, 28, Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, Chen KM ( 陈坤明 ) (2003). Antioxidant Defense Systems and Redox Balance of Plants Responding to Environmental Stresses ( 植物逆境抗氧化系统和逆境氧化还原平衡 ). PhD dissertation, Lanzhou University, Lanzhou. (in Chinese with English abstract) Dalton DA, Russell SA, Hanus FJ, Pascoe GA, Evans HJ (1986). Enzymatic reactions of ascorbate and glutathione that prevent peroxide damage in soybean root nodules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 83, Gao HJ ( 高海娟 ), Yun JF ( 云锦凤 ), Liu DF ( 刘德福 ) (2007). Study on seed germination of three wheatgrass species in desert steppe. Pratacultural Science ( 草业科学 ), 24(5), (in Chinese with English abstract) Grace SC, Logan BA (1996). Acclimation of foliar antioxidant systems to growth irradiance in three broad-leaved evergreen species. Plant Physiology, 112, Griffith OW (1980). Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Analytical Biochemistry, 106, Hodges DM, Andrews CJ, Johnson DA, Hamilton RI (1996). Antioxidant compound responses to chilling stress in differentially sensitive inbred maize lines. Physiologia Plantarum, 98, Hodges DM, DeLong JM, Forney CF, Prange RK (1999). Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta, 207, Jiang MY, Zhang JH (2002). Water stress-induced abscisic acid accumulation triggers the increased generation of reactive oxygen species and up-regulates the activities of antioxidant enzymes in maize leaves. Journal of Experimental Botany, 53, Li JX ( 李景欣 ), Yun JF ( 云锦凤 ), Su BD ( 苏布道 ), Wuren TY ( 乌仁图雅 ), Yiru GLT ( 义如格乐图 ) (2004). Study on the drought resistance comparision of 6 populations of Agropyron cristatum in the germination period and seedling stage. Journal of Arid Land Resources and Environment ( 干旱区资源与环境 ), 18(5), (in Chinese with English abstract) Luo XY ( 罗新义 ), Tan DH ( 谭大海 ), Sha W ( 沙伟 ) (2005). Effect of osmotic stress on activities of protective enzymes system in Agropyron cristatum. Journal of Qiqihar University (Natural Science Edition) ( 齐齐哈尔大学学报 ( 自然科学版 )), 21(4), (in Chinese with English abstract) Ma YH ( 马玉华 ), Ma FW ( 马锋旺 ), Ma XW ( 马小卫 ), Li MJ ( 李明军 ), Wang YH ( 王永红 ), Han MY ( 韩明玉 ), Shu HR ( 束怀瑞 ) (2008). Effects of drought stress on ascorbic acid contents and activities of related metabolic enzymes in apple leaves. Journal of Northwest A & F University (Natural Science Edition) ( 西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 )), 36(3), (in Chinese with English abstract) Miyake C, Asada K (1992). Thylakoid-bound ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts and photoreduction of its primary oxidation product monodehydroascorbate radicals in thylakoids. Plant & Cell Physiology, 33, Nakano Y, Asada K (1981). Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant & Cell Physiology, 22, doi: /SP.J

10 662 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (6): Pinheiro HA, DaMatta FM, Chaves ARM, Fontes EPB, Loureiro ME (2004). Drought tolerance in relation to protection against oxidative stress in clones of Coffea canephora subjected to long-term drought. Plant Science, 167, Rüegsegger A, Brunold C (1992). Effect of cadmium on γ-glutamylcysteine synthesis in maize seedlings. Plant Physiology, 99, Selote DS, Khanna-Chopra R (2006). Drought acclimation confers oxidative stress tolerance by inducing co-ordinated antioxidant defense at cellular and subcellular level in leaves of wheat seedlings. Physiologia Plantarum, 127, Shao HB, Chu LY, Shao MA, Jaleel CA, Mi HM (2008). Higher plant antioxidants and redox signaling under environmental stresses. Comptes Rendus Biologies, 331, Sharma SS, Dietz KJ (2006). The significance of amino acids and amino acid-derived molecules in plant responses and adaptation to heavy metal stress. Journal of Experimental Botany, 57, Šircelj H, Tausz M, Grill D, Batič F (2005). Biochemical responses in leaves of two apple tree cultivars subjected to progressing drought. Journal of Plant Physiology, 162, Tabata K, Ôba K, Suzuki K, Esaka M (2001). Generation and properties of ascorbic acid-deficient transgenic tobacco cells expressing antisense RNA of L-galactono-1, 4-lactone dehydrogenase. The Plant Journal, 27, Tang L ( 唐龙 ) (2005). Studies on Water Physiological Ecology Characteristics of 4 Native Herbs Communities in Loess Hill Region ( 陕北黄土丘陵区四种乡土草种水分生理生态特征研究 ). Master dissertation, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi. (in Chinese with English abstract) 责任编委 : 李凤民责任编辑 : 李敏

Microsoft Word - A200812-1992.doc

Microsoft Word - A200812-1992.doc 1 长期遮荫对小麦籽粒淀粉理化特性的影响张传辉, 姜东, 戴廷波, 荆奇, 曹卫星南京农业大学, 农业部作物生长调控重点开放实验室, 南京 (2195) E-mail: jiangd@njau.edu.cn 摘要 : 揭示了长期遮荫对小麦籽粒淀粉理化特性的影响选