中華民國第 51 屆中小學科學展覽會

Transcription

1 中 華 民 國 第 51 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會 作 品 說 明 書 科 別 : 生 物 ( 生 命 科 學 ) 科 組 別 : 高 中 組 作 品 名 稱 : 是 敵 人 還 是 朋 友? - 蘭 科 菌 根 解 剖 學 特 性 及 其 菌 根 真 菌 之 應 用 關 鍵 詞 : 蘭 根 真 菌 內 生 菌 根 台 灣 金 線 連 編 號 :

2 摘 要 我 們 在 2010 年 7 月 23 日 的 野 外 採 集, 從 烏 來 山 區 找 到 數 種 野 生 的 蘭 科 植 物, 採 其 根 及 果 莢 首 先 進 行 初 步 的 菌 根 解 剖 觀 察, 同 時 準 備 進 一 步 的 石 蠟 包 埋 切 片 和 真 菌 的 分 離 純 化, 根 據 文 獻 資 料 和 初 步 的 觀 察 後, 確 定 採 集 回 來 的 樣 本 為 菌 根 菌 類 中 的 絲 核 菌 類 進 一 步 我 們 著 手 真 菌 鑑 定, 藉 由 菌 落 特 性 菌 絲 型 態 核 染 觀 察, 將 其 分 類 為 雙 核 絲 核 菌 類 多 核 絲 核 菌 類, 再 以 電 子 顯 微 鏡 進 行 隔 膜 孔 觀 察, 以 分 子 生 物 學 為 輔, 確 認 它 所 對 應 的 有 性 世 代 屬 名 Thanatepjorus Ceratobasidium Tulasnella 然 後 依 菌 落 培 養 特 性 融 合 群 種 類, 挑 選 四 隻 真 菌, 進 行 生 理 生 化 測 試, 找 到 真 菌 生 長 的 最 佳 溫 度 (25 ~30 ) 及 ph(5.5~6.5) 值 最 後 我 們 將 此 真 菌 與 珍 貴 藥 材 臺 灣 金 線 連 進 行 共 生 測 試, 從 接 種 到 生 長, 經 過 五 個 月 後, 測 量 植 株 長 度 與 重 量, 測 量 發 現 編 號 Cno10-3 的 菌 株, 單 一 植 株 最 重, 而 Cno3-2 的 菌 株 總 重 最 重, 因 此 編 號 Cno10-3 Cno3-2 的 真 菌 對 台 灣 金 線 連 的 生 長 有 較 好 的 效 果 1

3 壹 研 究 動 機 台 灣 位 處 亞 熱 帶 和 熱 帶 的 交 界 處 地 區, 造 就 了 多 樣 的 地 理 及 氣 候 環 境, 因 此 孕 育 了 許 多 植 物 種 類, 其 中 維 管 束 顯 花 植 物 又 以 蘭 科 植 物 為 最 大 的 植 物 族 群, 根 據 中 央 研 究 院 生 物 多 樣 性 研 究 中 心 的 台 灣 物 種 名 錄 資 料 庫 (Catalogue of Life in Taiwan) 台 灣 目 前 共 有 109 屬 300 多 種 的 野 生 蘭 科 植 物, 究 竟 是 什 麼 原 因 使 得 蘭 科 植 物 如 此 多 樣 化 呢? 由 於 蘭 科 植 物 的 種 子 無 胚 乳 可 提 供 發 芽 所 需 的 養 份, 因 此 野 生 的 蘭 科 植 物 種 子 無 法 自 行 生 長 成 熟, 故 需 真 菌 與 之 交 互 作 用 才 能 順 利 發 芽 成 長, 於 是 我 們 深 入 台 灣 烏 來 山 區, 一 窺 台 灣 野 生 蘭 的 世 界, 並 採 集 數 種 野 生 蘭 科 植 物 回 來 進 行 研 究 與 探 討, 根 據 前 人 的 文 獻, 其 中 存 在 的 關 係 可 能 有 助 於 生 長 也 可 能 造 成 危 害, 為 了 更 進 一 步 探 討 這 些 現 象, 我 們 選 擇 蘭 科 植 物 台 灣 金 線 連 和 不 同 真 菌 進 行 共 生 培 養 來 觀 察 彼 此 之 間 的 關 係 台 灣 金 線 連 (Anoectochilus formosanus Hayata) 在 民 間 是 一 種 極 珍 貴 的 藥 材 在 2004 國 際 藥 用 植 物 產 業 發 展 研 討 會 專 刊 中 提 到, 金 線 連 有 抗 病 毒 抗 腫 瘤 抗 氧 化 的 功 效, 其 中, 中 研 院 生 農 所 徐 麗 芬 等 人 的 研 究 則 指 出 金 線 連 含 有 很 強 的 抗 氧 化 作 用 的 金 線 連 酮 但 台 灣 金 線 連 栽 種 不 易, 一 般 民 間 種 植 時, 不 僅 成 長 緩 慢 而 且 容 易 受 病 蟲 侵 入, 造 成 農 民 的 損 失 因 此 想 藉 由 經 過 鑑 定 的 真 菌 與 之 共 生, 藉 此 找 到 對 於 金 線 連 生 長 較 有 幫 助 的 真 菌, 以 提 高 金 線 連 培 育 時 的 存 活 率, 而 且 減 少 使 用 農 藥, 以 最 貼 近 自 然 的 方 法, 以 達 到 永 續 農 業 貳 研 究 目 的 一 證 明 從 野 外 採 集 的 蘭 科 植 物 根 中 有 真 菌 存 在, 並 進 一 步 確 認 真 菌 侵 入 植 物 體 的 部 位 二 以 型 態 鑑 定, 鑑 定 存 在 於 蘭 科 植 物 中 編 號 Cno10-3 Cno3-2 Bno7-3 Sno5-12 的 真 菌, 其 對 應 的 有 性 世 代 屬 名 三 以 分 子 鑑 定, 找 到 和 編 號 Cno10-3 Cno3-2 Bno7-3 Sno5-12 四 株 真 菌 親 緣 關 係 相 近 的 真 菌, 進 而 輔 助 型 態 鑑 定 的 不 足 四 在 不 同 酸 鹼 值, 其 他 培 養 條 件 相 同 下,Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 三 株 真 菌, 生 長 曲 線 的 比 較 五 在 不 同 溫 度, 其 他 培 養 條 件 相 同 下,Cno10-3 Cno3-2 Bno7-3 Sno5-12 四 株 真 菌, 生 長 曲 線 的 比 較 六 在 不 同 基 質, 其 他 培 養 條 件 相 同 下, 比 較 Cno10-3 Cno3-2 二 株 真 菌, 得 生 長 情 形, 並 綜 合 上 述 三 點, 找 到 最 適 合 的 酸 鹼 值 基 質 溫 度 七 在 相 同 的 培 養 條 件 下, 比 較 分 別 與 四 株 真 菌 進 行 共 生 培 養 之 金 線 連 的 生 長 情 形 2

4 參 研 究 設 備 及 器 材 一 野 外 採 集 蘭 科 植 物 ( 一 ) 凡 尼 蘭 ( 二 ) 烏 來 石 山 桃 ( 三 ) 竹 柏 蘭 ( 四 ) 長 距 根 節 蘭 ( 五 ) 烏 來 石 山 桃 二 實 驗 菌 種 ( 一 ) 編 號 為 Cno10-3,Cno3-2,Bno7-3,Sno5-12 的 四 株 真 菌 三 實 驗 藥 品 及 配 方 ( 一 ) 培 養 基 (V8 PSA PDA WA OMA) V8 OMA PDA PSA WA 10%V8 80ml 水 400ml 水 500ml 水 400ml 水 400ml CaCO3 0.8% Agar 2% Agar 1.6% Agar 2% Agar 2% 燕 麥 0.25% PDB 2.4% 馬 鈴 薯 煎 汁 (240g 馬 鈴 薯 ) ( 二 )NaOCl( 次 氯 酸 鈉 ) ( 三 )FAA( 福 馬 林 37% 冰 醋 酸 99.8% 酒 95%) ( 四 )TBA( 第 三 級 丁 醇 & 乙 醇 ) ( 五 )Cotton blue ( 六 )Xylene( 二 甲 苯 ) ( 七 )EtOH (100% 95% 70% 50%) ( 八 )KOH ( 九 )HCl 四 實 驗 設 備 ( 一 ) 無 菌 操 作 台 (Laminar Flow Horizontal) ( 二 ) 轉 動 式 石 蠟 切 片 機 (Rotary Microtome-RM2235) ( 三 ) 高 壓 滅 菌 釜 (Auto clave- YTM-D) ( 四 ) 桌 上 型 酸 鹼 度 計 (PH-Meter-S20) ( 五 ) 分 析 天 平 (Analytical Balances -AB204-L) ( 六 ) 烘 箱 (Oven-150 general purpose) ( 七 ) 離 心 機 (Centrifuge) ( 八 ) 器 材 微 量 吸 管 (Micropipette) 微 吸 管 頭 (Micro Pipettor tip) 血 清 瓶 秤 量 紙 藥 匙 震 盪 器 試 管 分 注 器 磁 石 離 心 管 (Tube) 3

5 一 研 究 程 序 實 驗 一 樣 本 切 片 以 石 蠟 切 片 徒 手 切 片 觀 察 野 生 蘭 科 植 物 物 根 部 的 真 菌 肆 研 究 過 程 或 方 法 一 蘭 根 採 集 到 烏 來 採 集 野 生 蘭 科 植 物, 帶 回 並 加 以 清 洗 消 毒 實 驗 二 真 菌 鑑 定 型 態 鑑 定, 將 野 生 蘭 科 植 物 根 部 觀 察 到 的 真 菌, 依 菌 落 生 長 特 性 核 染 電 子 顯 微 鏡 等 型 態 鑑 定, 鑑 定 菌 的 種 類 二 菌 種 選 擇 根 據 前 人 研 究 與 觀 察, 在 蘭 科 植 物 中 分 離 出 來 的 以 絲 核 菌 類 為 最 大 宗 而 其 中 又 分 為 單 核 雙 核 及 多 核 絲 核 菌 類 而 我 們 所 試 驗 的 真 菌, 則 是 絲 核 菌 類 中 選 取 培 養 特 性 差 異 較 大 的 四 株 真 菌 實 驗 三 真 菌 鑑 定 以 分 子 鑑 定 來 確 認 野 生 蘭 科 植 物 根 部 真 菌 所 屬 種 類 三 生 理 生 化 測 試 在 不 同 酸 鹼 值 溫 度 基 質 中, 找 出 最 適 合 真 菌 生 活 的 條 件 實 驗 四 酸 鹼 值 測 試 在 不 同 酸 鹼 值, 其 他 培 養 條 件 相 同 下, 找 出 最 適 合 真 菌 生 活 的 ph 值 實 驗 五 溫 度 測 試 在 不 同 溫 度, 其 他 培 養 條 件 相 同 下, 找 出 最 適 合 真 菌 生 活 的 溫 度 實 驗 六 基 質 測 試 在 不 同 基 質, 其 他 培 養 條 件 相 同 下, 找 出 最 適 合 真 菌 生 活 的 基 質 四 共 生 測 試 實 驗 七 將 編 號 Cno10-3 Cno3-2 Bno7-3 Sno5-12 的 真 菌, 在 最 相 同 條 件 下 與 台 灣 金 線 連 進 行 共 生 4

6 二 實 驗 方 法 在 2010 年 7 月 23 日, 前 往 烏 來 山 區 進 行 野 生 蘭 科 植 物 的 採 集, 採 後 的 標 本, 經 簡 易 處 理 帶 回 實 驗 室, 用 清 潔 劑 洗 淨 表 面 後, 在 接 續 下 面 一 連 串 的 表 面 消 毒 圖 一 : 長 距 根 節 蘭 圖 二 : 根 節 蘭 屬 圖 三 : 一 葉 罈 花 蘭 圖 四 : 蕙 蘭 屬 圖 五 : 凡 尼 蘭 屬 將 取 回 來 的 野 生 蘭 科 植 物 的 根 用 清 潔 劑 清 洗 表 面 加 入 無 菌 水,Vortex 3 分 鐘 ( 重 複 2 次 ) 加 入 70% 的 酒 精 Vortex 1 分 鐘 加 入 1% 次 氯 酸 鈉 ( 漂 白 水 ) Vortex 5 分 鐘 加 入 無 菌 水,Vortex 3 分 鐘 ( 重 複 2 次 ) 5

7 ( 一 ) 實 驗 一 : 徒 手 切 片 石 蠟 切 片 1. 徒 手 切 片 將 採 集 回 來 的 野 生 蘭 科 植 物 的 根 徒 手 切 片, 觀 察 根 部 是 否 有 真 菌 存 在 2. 在 顯 微 鏡 下 確 定 蘭 科 植 物 的 根 部 有 真 菌 後, 放 入 tube 加 入 FAA 圖 六 : 將 植 物 置 入 FAA 溶 液 中 3. 以 FAA 浸 泡 靜 置 12hr~24hr, 倒 掉 FAA, 用 50% 酒 精 搖 晃 清 洗 5 次, 放 置 在 50% 的 酒 精 4hr 4. 以 濃 度 低 (50%)~ 濃 度 高 (pure) 的 TBA 取 代 組 織 間 的 液 體, 進 行 脫 水 5. 將 蠟 粒 在 58 下 加 熱, 使 其 溶 進 組 織 間 圖 七 : 蠟 粒 在 定 溫 58 下 加 熱 溶 解 6. 將 液 態 蠟 倒 入 模 具 中, 並 把 植 物 組 織 整 齊 放 上, 放 進 冰 箱 中 冷 卻 7. 將 植 物 組 織 放 到 轉 動 式 切 片 機 上, 以 每 片 10μm 的 厚 度 切 片 6

8 圖 八 : 切 下 厚 10μm 的 組 織 8. 用 Xylene( 二 甲 苯 ) 100%~50% 的 EtOH 脫 蠟 9. 用 Cotton blue 染 色 ( 二 ) 實 驗 二 : 真 菌 鑑 定 一 型 態 鑑 定 根 據 前 人 研 究 與 觀 察, 在 蘭 科 植 物 中 分 離 出 來 的 以 絲 核 菌 類 為 最 大 宗 而 其 中 又 分 為 單 核 雙 核 及 多 核 絲 核 菌 類 而 我 們 所 試 驗 的 真 菌, 則 是 絲 核 菌 類 中 選 取 培 養 特 性 差 異 較 大 的 四 株 真 菌 Rhizoctonia solani (Kühn,1858) Waitea circinata (Oniki,1985) Multinucleate Rhizoctonia (MNR)(Parmeter and Whitney,1970) Rhizoctonia-like fungi BNR (Warcup and Talbot) (Currah et al, 1987) UNR (Hietala et al,1994) (Oterol et al, 2002) Binucleate Rhizoctonia(BNR) (Parmeter and Whitney,1970) (Ogoshi, 1975,1979) 圖 九 : 根 據 前 人 的 研 究 報 告, 繪 製 絲 核 菌 分 類 簡 圖, 並 依 這 照 此 圖, 選 出 並 判 斷 出 我 們 所 要 研 究 的 真 菌 在 分 類 學 上 所 屬 位 置 7

9 1. 菌 落 生 長 特 性 觀 察 Cno10-3 Bno7-3 Cno3-2 Sno5-12 四 株 真 菌, 在 PDA 培 養 基 中, 生 長 14 天 後 之 菌 落 型 態, 並 且 進 行 比 較 2. 絲 核 菌 特 徵 (1) 將 菌 塊 放 在 載 玻 片 上, (2) 用 Cotton blue 染 色 (3) 進 行 鏡 檢, 觀 察 菌 絲 是 否 有 出 現 下 列 特 徵 縊 縮 處 附 近 有 隔 膜, 菌 絲 分 支 成 特 定 角 度, 可 能 形 成 菌 絲 圈 和 念 珠 狀 細 胞 3. 核 染 (1) 在 菌 落 切 下 菌 塊 後, 將 菌 絲 養 在 載 玻 片 上 (2) 經 數 日 無 菌 培 養 後 用 safranin O 染 劑 滴 在 菌 絲 上 染 色, 再 用 3%(KOH) 退 染 (3) 鏡 檢 並 拍 照 4. 用 TEM 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 進 行 隔 膜 孔 的 觀 察 ( 三 ) 實 驗 三 : 真 菌 鑑 定 一 分 子 鑑 定 1. 從 盛 裝 10%V8 培 養 液 的 三 角 瓶 中 取 出 菌 絲 2. 抽 取 DNA 3. PCR (1) 以 限 制 梅 切 取 ITS1~ITS4 (2) 加 入 DNA 引 子 (3) 放 入 PCR system (4) 等 待 2 小 時 30 分 鐘 圖 十 : PCR 示 意 圖 8

10 (5) 膠 體 電 泳 (A) (B) 圖 十 一 :(A) 電 泳 示 意 圖 (B) 使 用 EtBr 染 膠 ( 四 ) 實 驗 四 : 生 理 生 化 測 試 一 ph 值 測 試 1. 配 置 10%V8 培 養 液 1600ml (1)250c.c V8 果 菜 汁 +10g 碳 酸 鈣 (2) 分 裝 並 離 心 取 上 清 液 (3) 取 160ml 加 水 定 量 至 1600ml 2. 裝 220c.c 至 燒 杯 3. 分 別 調 整 ph(ph2~7) 4. 每 個 燒 杯 分 裝 至 4 個 小 三 角 瓶 (50c.c) 5. 滅 菌 (1.5 磅 121 ) 6. 將 各 ph 值 所 需 之 酸 鹼 量 加 入 搖 勻 後 殖 入 兩 塊 接 種 源 7. 每 兩 天 測 量 一 次, 測 量 一 週 8. 最 後 取 出 菌 絲 秤 量 其 乾 重 9. 觀 察 真 菌 在 不 同 PH 值 內 的 生 長 狀 況 ( 五 ) 實 驗 五 : 生 理 生 化 測 試 一 溫 度 測 試 1. 定 量 20ml PDA V8 培 養 基 2. 將 Cno10-3 Bno7-3 Cno3-2 Sno5-12 四 隻 真 菌 置 於 正 中 央 3. 在 每 個 培 養 皿 底 部 畫 上 十 字 以 方 便 測 量 4. 每 4 個 培 養 皿 放 置 1 個 溫 度 下 生 長 (5 ~35 ), 測 量 至 長 滿 為 止 或 到 第 五 天 ( 每 八 小 時 測 量 一 次 ), 以 找 出 最 適 合 此 四 隻 真 菌 最 適 合 生 長 的 溫 度 ( 六 ) 實 驗 六 : 生 理 生 化 測 試 一 基 質 測 試 1. 配 製 5%V8 培 養 基 2. 放 置 白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉 3. 中 心 放 置 接 種 源 4. 觀 察 真 菌 對 於 不 同 基 質 的 生 長 情 形 9

11 ( 七 ) 實 驗 七 : 共 生 培 養 1. 用 試 管 分 注 器 定 量 OMA 培 養 基 2. 滅 菌 後, 傾 斜 等 待 冷 卻 3. 再 倒 入 WA 培 養 基 ( 瓊 脂 ) 4. 將 金 線 連 的 幼 苗 接 種 在 瓊 脂, 再 將 真 菌 接 在 OMA 培 養 基 上 圖 十 二 : 斜 面 培 養 基 示 意 圖 5. 觀 察 五 個 月 金 線 連 的 生 長 狀 況 6. 五 個 月 後 取 出 照 相 並 秤 重 7. 切 片 後 使 用 強 鹼 軟 化 組 織, 並 染 色 觀 察 其 根 部 及 莖 部 有 無 菌 根 真 菌 存 在 伍 研 究 結 果 一. 實 驗 一 : 徒 手 切 片 石 蠟 切 片 ( 一 ) 結 果 一 : 徒 手 切 片 結 果 peloton Hyph 圖 十 三 : 杜 鵑 蘭 根 部 切 片, 在 根 毛 中 發 現 菌 絲 的 入 侵 圖 十 四 : 竹 柏 蘭 根 部 切 片, 菌 絲 從 四 方 纏 住 細 胞 核 的 情 形 圖 十 五 : 斑 葉 蘭 根 部 切 片, 此 為 較 後 期 的 菌 絲 團 10

12 ( 二 ) 結 果 二 : 石 蠟 切 片 結 果 圖 十 六 : 凡 尼 蘭 根 部 切 片, 有 菌 絲 團 和 一 些 疑 似 澱 粉 粒 的 構 造 圖 十 七 : 長 距 根 節 蘭 根 部 切 片, 變 為 後 期 菌 絲 團, 看 不 出 一 條 一 條 的 感 覺 圖 十 八 : 凡 尼 蘭 根 部 切 片, 低 倍 顯 微 鏡, 看 到 大 範 圍 的 植 物 組 織, 且 含 有 菌 絲 團 二. 實 驗 二 : 真 菌 鑑 定 一 型 態 鑑 定 ( 一 ) 結 果 一 : 菌 落 生 長 14 天 後 的 結 果 Cno10-3 Bno7-3 圖 十 九 : 菌 絲 生 長 較 鬆 散, 外 圈 處 菌 絲 較 內 圈 厚 Cno3-2 圖 二 十 : 菌 絲 生 長 緩 慢 但 綿 密, 呈 現 乳 白 色 Sno5-12 圖 二 十 一 : 菌 絲 十 分 均 勻 有 菌 核 的 構 造 產 生 圖 二 十 二 : 菌 絲 在 中 心 處 有 菌 核 的 構 造 產 生 11

13 ( 二 ) 結 果 二 : 顯 微 鏡 下 菌 絲 觀 察 照 圖 二 十 三 : 絲 核 菌 的 菌 絲 分 支 處 有 縊 縮 且 成 特 定 角 度 圖 二 十 四 : 縊 縮 附 近 有 隔 膜 圖 二 十 五 : 念 珠 狀 細 胞 圖 二 十 六 絲 核 菌 的 菌 絲 可 能 形 成 菌 絲 圈 12

14 ( 三 ) 結 果 三 : 核 染 觀 察 照 Cno10-3 Bno7-3 圖 二 十 七 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 圖 二 十 八 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 圖 二 十 九 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 圖 三 十 : 在 編 號 Bno7-3 中, 發 現 菌 絲 圈 的 構 造 Cno3-2 Sno5-12 圖 三 十 一 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 圖 三 十 二 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 圖 三 十 三 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 圖 三 十 四 : 箭 頭 處 指 著 雙 核 13

15 ( 四 ) 結 果 四 : 電 子 顯 微 鏡 觀 察 結 果 Sno5-12 Cno10-3 圖 三 十 五 : Sno5-12 雙 核 絲 核 菌, 隔 膜 孔 構 造 之 parenthesome 為 有 孔 洞 型, 有 性 世 代 屬 名 應 為 Ceratobasidium 圖 三 十 六 : Cno10-3 雙 核 絲 核 菌, 隔 膜 孔 構 造 之 parenthesome 為 有 孔 洞 型, 有 性 世 代 屬 名 應 為 Ceratobasidium ( 五 ) 總 結 : 經 過 一 連 串 的 觀 察 鑑 定, 看 到 了 縊 縮 處 附 近 有 隔 膜, 菌 絲 分 支 成 特 定 角 度, 可 能 形 成 菌 絲 圈 和 念 珠 狀 細 胞, 這 些 都 是 符 合 絲 核 菌 的 特 徵 ; 再 更 進 一 步 的 觀 察 電 子 顯 微 鏡, 發 現 編 Sno5-12 Cno10-3 的 隔 膜 孔 構 造 之 parenthesome 為 有 孔 洞 型, 有 性 世 代 屬 名 應 為 Ceratobasidium 三. 實 驗 三 : 真 菌 鑑 定 一 分 子 鑑 定 ( 一 ) 結 果 一 : 電 泳 圖 Marker Sno5 12 Bno7 3 Cno3 2 Cno10 3 Fno1 2a Fno1 2b 5 μl 3kb 1kb 600bp 圖 三 十 七 : 電 泳 結 果 呈 現 如 上 14

16 ( 二 ) 結 果 二 : 解 序 及 比 對 結 果 1. Bno7-3 圖 三 十 八 : Bno7-3 的 序 列 比 對 結 果 2. Cno10-3 圖 三 十 九 : 與 Bno7-3 親 源 關 係 最 近 的 真 菌 序 列 比 較 圖 四 十 : Cno10-3 的 序 列 比 對 結 果 圖 四 十 一 : 與 Cno10-3 親 源 關 係 最 近 的 真 菌 序 列 比 較 15

17 3. Cno3-2 圖 四 十 二 Cno3-2 的序列比對結果 圖 四 十 三 與Cno3-2 親源關係最近的真菌序列比較 4. Sno5-12 圖四十四 Sno5-12 的序列比對結果 圖 四 十 五 與Sno5-12 親源關係最近的真菌序列比較 16

18 ( 三 ) 總 結 : 1. 由 圖 三 十 八 圖 三 十 九 中 可 得 知 Bno7-3 屬 於 絲 核 菌 類 中 的 Tulasnella, 且 與 Bno7-3 親 源 關 係 最 近 的 真 菌 與 Bno7-3 序 列 相 似 度 達 到 93% 2. 由 圖 四 十 圖 四 十 一 中 可 得 知 Cno10-3 屬 於 絲 核 菌 類 的 Ceratobasidium, 且 與 Cno10-3 親 源 關 係 最 近 的 真 菌 與 Cno10-3 序 列 相 似 度 達 93% 3. 由 圖 四 十 二 圖 四 十 三 可 得 知 Cno3-2 屬 於 絲 核 菌 類 的 Ceratobasidium 且 與 Cno3-2 親 源 關 係 最 近 的 真 菌 與 Cno3-2 序 列 相 似 度 達 94% 4. 由 圖 四 十 四 圖 四 十 五 可 得 知 Sno5-12 屬 於 絲 核 菌 類 的 Ceratobasidium, 且 與 Sno5-12 親 源 關 係 最 近 的 真 菌 與 Cno3-2 序 列 相 似 度 達 65% 四. 實 驗 四 : 生 理 生 化 測 試 一 ph 值 測 試 ( 一 ) 結 果 一 :Cno10-3 在 25, 50mlV8 培 養 液 中 ph 值 的 變 化 ph 值 天 數 圖 四 十 六 : Cno10-3pH 值 改 變 折 線 圖 ph7 ph6 ph5 ph4 ph3 ph2 編 號 Cno10-3 的 菌 株 在 25,50mlV8 培 養 液 中, 每 兩 天 測 量 一 次, 依 照 實 驗 結 果 顯 示 ph 值 4-6 的 酸 鹼 度 變 化 趨 向 中 性,pH 值 2-3 則 無 明 顯 變 化, 由 此 可 見, 真 菌 具 有 改 變 環 境 的 能 力 17

19 ( 二 ) 結 果 二 : Cno3-2 在 25, 50mlV8 培 養 液 中 ph 值 的 變 化 ph 值 天 數 圖 四 十 七 : Cno3-2pH 值 改 變 折 線 圖 ph7 ph6 ph5 ph4 ph3 ph2 編 號 Cno3-2 菌 株 在 25,50mlV8 培 養 液 中, 每 兩 天 測 量 一 次, 依 照 實 驗 結 果 顯 示 ph 值 4-6 的 酸 鹼 度 變 化 趨 向 中 性,pH 值 2-3 則 無 明 顯 變 化, 由 此 可 見, 真 菌 具 有 改 變 環 境 的 能 力 ( 三 ) 結 果 三 :Sno5-12 在 25, 50mlV8 培 養 液 中 ph 值 的 變 化 生 理 生 化 測 試 -ph 值 ph 值 天 數 圖 四 十 八 : Sno5-12pH 值 改 變 折 線 圖 ph7 ph6 ph5 ph4 ph3 ph2 編 號 Sno5-12 菌 株 在 25,50mlV8 培 養 液 中, 每 兩 天 測 量 一 次, 依 照 實 驗 結 果 顯 示 ph 值 4-7 的 變 化 趨 向 弱 酸,pH 值 2-3 則 無 明 顯 變 化, 由 此 可 見, 真 菌 具 有 改 變 環 境 的 能 力 18

20 ( 四 ) 結 果 四 : 藉 由 菌 絲 乾 重 的 比 較, 可 得 知 最 適 合 真 菌 生 長 的 ph 範 圍 為 5~ C Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 圖 四 十 九 : 為 Cno10-3 Cno3-2 八 天 後 菌 絲 乾 重 長 條 圖 ( 五 ) 總 結 : 根 據 編 號 Cno3-2 Cno10-3 在 25,50mlV8 培 養 液 中 經 過 八 天 的 生 長, 從 實 驗 結 果 圖 表 中 我 們 很 清 楚 的 發 現 ph 值 4-6 的 菌 絲 比 ph 值 2-3 的 更 重, 由 此 我 們 驗 證 了, 真 菌 喜 好 弱 酸 的 環 境 藉 此 我 們 便 可 以 利 用 這 個 結 果 為 真 菌 營 造 更 適 合 其 生 長 的 環 境, 並 後 續 應 用 到 蘭 科 植 物 上 五. 實 驗 五 : 生 理 生 化 測 試 一 溫 度 值 測 試 ( 一 ) 結 果 一 :Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3 在 7 個 溫 度 下 PDA 培 養 基 的 生 長 速 率 平 均 速 率 (mm/8hr) 溫 度 ( ) Cno3-2 Cno10-3 Sno5-12 Bno7-3 圖 五 十 : 為 Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3 在 7 個 溫 度 下 PDA 培 養 基 的 生 長 速 率 比 較 折 線 圖 在 PDA 培 養 基 上, 經 由 實 驗 數 據 得 知 這 四 種 真 菌 在 25 ~30 時 生 長 速 率 最 快 而 在 5 及 35 時 則 最 慢 19

21 ( 二 ) 結 果 二 :Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3 在 7 個 溫 度 下 V8 培 養 基 的 生 長 速 率 生 長 速 率 (mm/8hr) 溫 度 ( ) Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3 圖 五 十 一 : 為 Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3 在 7 個 溫 度 下 10%V8 培 養 基 的 生 長 速 率 比 較 折 線 圖 在 10%V8 培 養 基 上, 經 由 實 驗 數 據 得 知 這 四 種 真 菌 在 25 ~30 時 生 長 速 率 最 快 而 在 5 及 35 時 則 最 慢 ( 三 ) 總 結 : 比 對 PDA 實 驗 組 的 實 驗 數 據 後, 發 現 最 佳 的 生 長 溫 度 也 是 25 ~30 而 V8 培 養 基 上 的 生 長 速 率 略 快 於 PDA 培 養 基, 藉 此 可 推 測 V8 培 養 基 比 PDA 培 養 基 含 有 更 豐 富 的 養 分 六. 實 驗 六 : 生 理 生 化 測 試 一 基 質 測 試 ( 一 ) 結 果 一 : Cno3-2 Cno3-2 Cno3-2 白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉 圖 五 十 二 : 為 Cno3-2 基 質 試 驗 之 培 養 皿 照 左 到 右 依 序 為 白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉 基 質 測 定 發 現, 在 放 有 芋 頭 的 培 養 基 上, 菌 絲 長 的 最 好, 因 此 推 測 芋 頭 的 養 分 對 真 菌 較 有 幫 助 20

22 ( 二 ) 結 果 二 : Cno10-3 Cno10-3 Cno10-3 白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉 圖 五 十 三 : 為 Cno3-2 基 質 試 驗 之 培 養 皿 照 左 到 右 依 序 為 白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉 基 質 測 定 發 現, 在 放 有 芋 頭 的 培 養 基 上, 菌 絲 長 的 最 好, 因 此 推 測 芋 頭 的 養 分 對 真 菌 較 有 幫 助 七. 實 驗 七 : 共 生 培 養 ( 一 ) 結 果 一 : 植 株 五 個 月 後 的 重 量 表 一 : 五 個 月 後 秤 重 結 果 Sno5-12 Bno7-3 Cno10-3 Cno g g g g 克 重 Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno 五 四 個 月 重 後 量 重 量 圖 五 十 四 : 植 株 五 個 月 後 的 重 量 圖 五 十 五 圖 五 十 六 圖 五 十 七 圖 五 十 八 Sno5-12 Bno7-3 Cno10-3 Cno3-2 21

23 ( 二 ) 結 果 二 Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3 圖 五 十 九 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 一 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 二 : 為 根 毛 照 圖 六 十 三 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 四 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 五 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 六 : 為 菌 絲 纏 繞 照 圖 六 十 七 : 為 根 莖 部 切 片 照 圖 六 十 八 : 為 菌 絲 穿 過 細 胞 壁 照 根 部 有 菌 絲 團, 莖 部 沒 有, 根 尖 無 褐 化 菌 絲 有 進 入 根 毛 內, 莖 部 沒 有, 根 尖 無 褐 化 根 部 有 菌 絲 團, 莖 部 沒 有, 根 尖 有 褐 化 根 部 沒 有 菌 絲 團, 莖 部 亦 沒 有, 但 有 侵 入 根 毛, 根 尖 無 褐 化 ( 三 ) 總 結 : 由 圖 六 十 五 可 知,Sno5-12 可 幫 助 植 株 生 長, 卻 也 同 時 使 根 尖 有 核 化 的 現 象 真 菌 到 底 對 植 株 有 益 還 是 有 害, 還 需 後 續 研 究 探 討 Bno7-3 的 植 株 生 長 較 慢, 推 測 是 因 為 菌 絲 團 尚 未 形 成, 或 不 會 形 成 22

24 陸 討 論 一. 野 生 蘭 花 不 易 辨 識, 尤 其 在 未 開 花 時 期, 加 上 因 環 境 不 同 而 造 成 構 造 上 些 許 不 同, 對 照 圖 鑑 也 不 能 比 照 現 實, 造 成 辨 識 上 更 加 的 不 易, 因 此 我 們 認 為 有 專 人 帶 領 採 集 樣 品 是 必 須 的 實 驗 過 程 中 石 蠟 切 片 標 本 容 易 破 裂, 推 測 原 因 有 二, 其 一 為 放 入 植 物 組 織 時, 液 態 蠟 溫 度 過 高, 造 成 組 織 的 破 壞 ; 其 二 為 冷 卻 時 溫 差 太 大, 造 成 劇 烈 的 熱 脹 冷 縮, 使 組 織 破 裂, 若 能 克 服 這 些 原 因, 便 可 得 到 完 整 的 切 片 標 本 二. 經 過 生 理 生 化 測 試 後, 我 們 觀 察 到 烏 來 採 集 的 蘭 科 真 菌 在 25-30, 及 弱 酸 (ph5.5~6.5) 環 境 下 生 長 的 最 好, 推 測 與 台 北 烏 來 的 環 境 有 相 關 聯, 在 中 央 氣 象 局 的 統 計 資 料 中, 得 知 烏 來 平 均 降 雨 的 酸 鹼 值 為 ph5.5, 而 平 均 氣 溫 是 23, 和 我 們 的 實 驗 結 果 十 分 相 近, 因 此 認 為 我 們 可 以 複 製 真 菌 生 長 環 境, 或 更 進 一 步 和 蘭 科 植 物 共 生, 對 未 來 提 高 蘭 科 植 物 的 附 加 價 值 或 野 生 蘭 類 的 復 育 有 很 大 的 幫 助 三. 經 過 共 生 培 養 及 切 片 觀 察 後, 發 現 生 長 最 好 的 兩 株 (Cno10-3 Cno3-2 在 其 根 莖 部 都 有 發 現 真 菌 的 存 在 Sno5-12 表 面 看 似 也 幫 助 了 植 株 生 長, 但 我 們 卻 在 根 部 末 端 發 現 有 褐 化 之 病 徵, 切 片 結 果 發 現 真 菌 已 侵 入 維 管 束, 影 響 植 物 的 運 輸 ; 這 讓 我 們 感 到 訝 異, 原 來 菌 根 真 菌 不 全 然 對 蘭 科 植 物 有 益, 而 這 類 真 菌 後 續 會 對 植 株 造 成 什 麼 影 響 還 是 未 知 數, 也 值 得 我 們 更 多 的 探 討 柒 結 論 一. 經 切 片 證 實 野 生 蘭 科 植 物 根 內, 確 實 有 真 菌 的 存 在, 並 發 現 菌 絲 從 根 毛 和 根 莖 處 的 吸 收 毛 侵 入 植 物 體 內, 進 一 步 發 現 編 號 Cno10-3 Cno3-2 真 菌 和 植 物 存 在 著 某 種 平 衡, 且 不 會 傷 害 植 物 體 二. 經 過 一 連 串 的 觀 察 鑑 定, 看 到 了 縊 縮 處 附 近 有 隔 膜, 菌 絲 分 支 成 特 定 角 度, 可 能 形 成 菌 絲 圈 和 念 珠 狀 細 胞, 這 些 都 是 符 合 絲 核 菌 的 特 徵 ; 再 更 進 一 步 已 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 觀 察, 發 現 編 Sno5-12 Cno10-3 的 隔 膜 孔 構 造 之 parenthesome 為 有 孔 洞 型, 有 性 世 代 屬 名 應 為 Ceratobasidium 三. 在 生 理 生 化 測 試 方 面 由 酸 鹼 值 前 後 的 差 異, 發 現 真 菌 會 調 整 身 處 的 不 適 環 境, 使 其 更 適 合 生 長, 而 我 們 所 挑 選 的 菌 株 喜 好 弱 酸 環 境, 會 將 ph4-6 提 高,pH2-3 則 無 明 顯 改 變 所 挑 選 的 四 株 真 菌 ( 編 號 Cno10-3 Cno3-2 Bno7-3 Sno5-12) 在 的 環 境 下 生 長 情 形 最 好 基 質 測 定 發 現, 有 鋪 芋 頭 的 真 菌 生 長 狀 況 較 好, 推 測 芋 頭 的 養 分 較 利 於 真 菌 生 長, 青 剛 櫟 葉 則 對 生 長 無 明 顯 影 響 四. 台 灣 金 線 連 在 適 當 環 境 條 件 下 依 然 可 以 發 芽 生 長, 但 經 共 生 培 養 試 驗 證 實 接 種 不 同 真 菌 ( 編 號 Cno10-3 Cno3-2 Bno7-3 Sno5-12) 後 有 不 同 的 生 長 狀 況 Cno10-3 Cno3-2 根 莖 部 有 菌 絲 團, 莖 部 沒 有, 根 尖 無 褐 化 ;Sno5-12 根 莖 部 有 菌 絲 團, 莖 部 沒 有, 根 尖 褐 化 Bno7-3 菌 絲 有 進 入 根 毛 內, 但 根 莖 部 沒 有 菌 絲 團 形 成, 因 此 金 線 連 和 Cno10-3 Cno3-2 共 生 最 好 23

25 捌 參 考 資 料 及 未 來 展 望 一. 未 來 展 望 ( 一 ) 許 多 真 菌 都 有 與 植 物 共 生 的 現 象, 而 我 們 發 現 了 蘭 花 與 真 菌 的 關 係 是 密 不 可 分 的 號 稱 蘭 花 王 國 的 臺 灣 擁 有 生 物 多 樣 性 豐 富 數 以 百 計 種 的 蘭 科 植 物 ; 經 過 某 些 自 然 因 素 或 人 為 因 素, 造 成 棲 地 破 壞, 許 多 蘭 科 植 物 瀕 臨 滅 絕, 已 知 蘭 科 植 物 生 長 方 面 真 菌 便 扮 演 了 極 奇 重 要 的 角 色, 未 來 可 朝 此 方 面 發 展, 在 溫 室 內 復 育 蘭 科 植 物 ( 二 ) 台 灣 金 線 連 栽 種 不 易, 因 此 我 們 若 能 藉 由 真 菌 與 其 共 生, 提 高 存 活 率, 並 且 縮 短 生 長 週 期, 以 降 低 農 夫 在 栽 培 中 的 成 本, 提 高 其 獲 利 ( 三 ) 目 前 化 學 的 肥 料 和 農 藥 所 造 成 的 環 境 負 擔 是 許 多 農 民 頭 痛 的 問 題, 因 為 真 菌 為 大 自 然 的 一 部 分, 若 能 以 此 取 代 化 學 肥 料 農 藥, 便 能 達 到 不 破 壞 自 然 環 境, 達 到 永 續 農 業 的 願 景 二. 參 考 資 料 ( 一 ) 林 文 川 (2004) 國 際 藥 用 植 物 產 業 發 展 研 討 會 專 刊 ( 二 ) 林 維 明 (2006) 台 灣 野 生 蘭 賞 蘭 大 圖 鑑 天 下 遠 見 出 版 股 份 有 限 公 司 P.64~65 P.110 P.184 ( 三 ) 林 讚 標 (1976) 臺 灣 蘭 科 植 物 發 行 人 王 積 祺 P.82~83 236~ ~249 ( 四 ) 陳 家 全 李 家 為 楊 瑞 森 (1991) 生 物 電 子 顯 鏡 學 中 央 圖 書 館 P.23~37 ( 五 ) 蔡 淑 華 (1975) 植 物 切 片 組 織 綱 要 茂 昌 圖 書 股 份 有 限 公 司 P.1~33 ( 六 ) 劉 新 裕 林 俊 義 張 成 國 (2002) 藥 用 植 物 專 輯 行 政 院 農 業 委 員 會 農 業 試 驗 所 P.124~128 ( 七 ) 劉 潤 進 陳 應 龍 (2006) 菌 根 學 科 學 出 版 社 P.1~6 P.14~15 P.35~36 ( 八 ) Jane B. Reece 編 譯 : 鍾 楊 聰 張 立 雪 徐 歷 鵬 黃 璧 祈 (2005) Neil A. Campbell 偉 明 圖 書 有 限 公 司 P.763~761 ( 九 ) Smith, S.E., Read, D.J.(2008). Mycorrhizal symbiosis. 3nd ed., Academic Press, San Diego, California, USA. ( 十 ) Sneh, B., Burbee, L., and Ogoshi, A.(1991). Identification of Rhizoctonia species.the American Phytopathological Society,St Paul,Minnesota,USA 24