Vitrolife Sweden AB 版 权 所 有 本 操 作 指 南 的 复 印 件 仅 供 内 部 使 用, 不 得 出 版 Vitrolife 标 识 是 Vitrolife Sweden AB 的 商 标 已 在 欧 洲 美 国 和 其 他 国 家 注 册 Vitro

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1 G-SERIES 操 作 指 南 David K. Gardner 教 授 权 威 推 荐 的 G-Series 产 品 使 用 方 法 2013 年 1 月 第 7 版

2 Vitrolife Sweden AB 版 权 所 有 本 操 作 指 南 的 复 印 件 仅 供 内 部 使 用, 不 得 出 版 Vitrolife 标 识 是 Vitrolife Sweden AB 的 商 标 已 在 欧 洲 美 国 和 其 他 国 家 注 册 Vitrolife Sweden AB Box 9080 SE Göteborg 瑞 典 电 话 : Vitrolife Inc South Inca Street Englewood Colorado 美 国 电 话 : VITRO US ( ) G5 G-Series the G5 logo GIII GIII Series the GIII logo G-MM HSA-solution G-IVF G-IVF PLUS G-1 G-1 PLUS G-2 G-2 PLUS G-GAMETE G-MOPS G-MOPS PLUS G-RINSE G-FreezeKit Blast G-ThawKit Blast G-PGD SpermGrad HYASE ICSI FreezeKit Cleave ThawKit Cleave 和 V-Tip 皆 为 Vitrolife Sweden AB 的 商 标 EmbryoGlue 是 Vitrolife Sweden AB 的 注 册 商 标 2 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

3 目 录 简 介 4 综 述 5 打 开 您 的 Vitrolife 产 品 5 CO 2 平 衡 6 添 加 G-MM 或 HSA solution 6 G-MOPS /G-MOPS PLUS 的 推 荐 用 法 8 如 何 测 量 ph 值 10 IVF 与 培 养 系 统 12 精 子 制 备 13 上 游 法 ( 迁 移 ) 14 密 度 梯 度 离 心 法 16 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 19 取 卵 19 卵 母 细 胞 辨 别 20 卵 母 细 胞 培 养 与 授 精 21 授 精 22 授 精 评 估 22 人 原 核 胚 胎 的 评 分 方 法 23 选 择 培 养 系 统 24 培 养 系 统 的 准 备 25 胚 胎 培 养 26 胚 胎 评 估 28 人 类 囊 胚 的 评 分 标 准 29 评 分 系 统 30 囊 胚 评 估 表 31 囊 胚 培 养 流 程 表 ( 示 例 ) 32 胚 胎 移 植 33 移 植 操 作 33 装 载 移 植 管 35 显 微 操 作 37 ICSI 操 作 前 剥 卵 38 ICSI 操 作 流 程 40 难 度 较 高 的 ICSI 疑 难 病 例 42 睾 丸 穿 刺 活 检 43 胚 胎 活 检 43 胚 胎 冷 冻 保 存 45 设 备 清 单 45 卵 裂 期 胚 胎 冷 冻 保 存 - 全 新 慢 速 冷 冻 复 苏 液 Freezekit Cleave 和 Thawkit Cleave 47 卵 裂 期 冷 冻 保 存 - Freezekit 1 和 Thawkit 1 49 囊 胚 期 胚 胎 的 冷 冻 保 存 52 质 量 控 制 程 序 56 Vitrolife G-Series 及 相 关 产 品 59 G-Series : 培 养 液 成 分 61 Vitrolife 器 材 62 注 意 事 项 64 联 系 信 息 65 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 目 录 3

4 简 介 提 高 成 功 率 Vitrolife 致 力 于 提 高 人 类 辅 助 生 殖 的 成 功 率 在 生 殖 生 理 学 中 的 长 期 研 究 以 及 对 胚 胎 发 育 开 展 的 研 究 成 就 了 最 先 进 的 体 外 授 精 培 养 液 产 品 本 操 作 指 南 介 绍 了 David K. Gardner 教 授 使 用 Vitrolife G Series 培 养 液 产 品 的 方 法 ART 操 作 方 法 繁 多 按 照 下 文 方 法 使 用 Vitrolife 产 品, 您 将 获 得 更 高 的 成 功 率 Vitrolife 体 外 授 精 产 品 IVF 培 养 液 Vitrolife 提 供 高 质 量 的 和 高 安 全 性 的 IVF 培 养 液 产 品 在 发 送 给 客 户 之 前, 每 一 批 次 产 品 都 是 经 过 了 严 格 的 质 量 控 制 检 验 的, 其 中 包 括 鼠 胚 试 验 (MEA) 对 于 发 送 的 每 一 批 次 的 产 品 均 有 相 应 的 质 检 合 格 证 明 书 质 量 控 制 与 质 量 保 证 体 系 (ISO 13485: 2003 和 21 CFR Part 820: QSR) 确 保 各 批 次 间 品 质 的 一 致 性 Vitrolife 辅 助 生 殖 产 品 的 选 材 均 来 自 全 球 市 场 最 佳 的 原 料 在 用 于 生 产 培 养 液 之 前, 所 有 原 材 料 都 经 过 严 格 的 质 控 和 MEA 测 试 对 它 们 进 行 了 逐 一 的 检 测 和 评 估 Vitrolife 生 产 的 IVF 器 材 同 时,Vitrolife 也 为 IVF 治 疗 提 供 了 众 多 的 器 材, 比 如 取 卵 针 剥 卵 针 ICSI 注 射 针 和 胚 胎 活 检 针 以 及 胚 胎 移 植 导 管 等 与 培 养 液 产 品 相 同, 这 些 IVF 器 材 的 生 产 过 程 都 是 采 用 严 格 的 质 量 标 准 加 以 控 制 的, 而 且 也 是 依 照 同 样 的 质 量 标 准 来 进 行 生 产 的 我 们 确 信 您 一 定 会 认 同, 创 造 人 类 新 的 生 命 当 然 需 要 最 佳 的 培 养 环 境 我 们 致 力 于 为 您 提 供 品 质 最 佳 的 产 品 4 简 介 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

5 综 述 打 开 您 的 Vitrolife 产 品 当 Vitrolife 产 品 递 送 到 您 手 上 时, 您 便 会 注 意 到 它 们 所 采 用 的 独 特 包 装 方 式 具 体 原 因 如 下 : Vitrolife 产 品 均 采 用 防 揭 换 密 封 包 装 包 装 是 否 揭 换 一 目 了 然 包 装 材 料 也 是 采 用 无 毒 原 料 制 造 的, 因 而 不 会 对 最 终 产 品 有 任 何 不 良 影 响 PETG 瓶 旋 盖 特 制 标 签 以 及 医 药 级 密 封 都 是 为 了 满 足 上 述 防 揭 措 施 而 设 计 的 除 了 G-IVF PLUS 之 外,G-Series PLUS 培 养 液 需 要 添 加 5 mg HSA/mL G-IVF PLUS 需 要 添 加 10 mg HSA/mL 所 有 其 他 的 G5 培 养 液 都 不 存 在 蛋 白 质 ( 除 非 在 标 签 上 另 有 说 明 ), 请 根 据 产 品 包 装 瓶 上 的 标 签 提 示 来 添 加 所 需 G-MM ( 重 组 人 血 清 白 蛋 白 ) 或 HSA-solution ( 人 血 清 白 蛋 白 ) 参 见 第 7 页 的 表 格 要 点 产 品 操 作 前 需 清 洁 双 手 并 消 毒 处 理 如 血 液 卵 泡 液 及 精 液 等 生 物 体 液 时 须 采 取 必 要 防 护 措 施 实 际 操 作 1 所 有 产 品 须 在 超 净 工 作 台 (LAF) 内 打 开 2 将 产 品 放 入 超 净 工 作 台 之 前, 须 保 证 瓶 外 表 面 的 清 洁 建 议 使 用 无 绒 布 蘸 取 酒 精 进 行 擦 拭 3 核 实 产 品 并 检 查 效 期 打 开 防 揭 换 封 条 并 丢 弃 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 综 述 5

6 4 取 下 瓶 盖 并 将 其 扣 于 无 菌 培 养 皿 中 5 用 灭 菌 的 无 毒 性 移 液 管 吸 取 处 所 需 体 积 的 培 养 液 改 好 瓶 盖 并 旋 紧 不 可 触 摸 瓶 盖 内 壁 6 尽 可 能 把 培 养 液 处 于 低 温 状 态 一 旦 将 培 养 液 从 冰 箱 内 取 出 须 立 即 制 备 所 需 培 养 皿 切 勿 将 培 养 液 瓶 长 时 间 置 于 室 温 环 境 中,( 先 准 备 好 所 需 试 管 或 培 养 皿 再 从 冰 箱 中 取 出 培 养 液 瓶 ) 无 菌 操 作 技 术 是 指 在 不 存 在 能 够 导 致 感 染 或 污 染 的 微 生 物 的 条 件 下 进 行 操 作 注 意 绝 对 不 可 以 采 用 倾 倒 的 方 式 取 出 培 养 液, 因 为 培 养 液 瓶 一 旦 开 封, 其 瓶 口 边 缘 处 即 无 法 保 证 无 菌 CO 2 平 衡 培 养 人 类 胚 胎 的 最 佳 ph 值 范 围 为 为 了 取 得 正 确 的 ph 值, 所 有 的 G-Series 培 养 液 ( 除 G-MOPS /G-MOPS PLUS G-PGD G-Freezekit Blast 和 G-Thawkit Blast 外 ) 应 在 6% 的 CO 2 中 平 衡 该 建 议 适 用 于 位 于 或 者 处 于 接 近 海 平 面 的 实 验 室 对 于 位 于 海 拔 较 高 的 实 验 室, 则 须 增 加 CO 2 的 浓 度, 每 升 高 1000 米,CO 2 浓 度 大 约 需 要 提 高 0.6% 必 须 对 ph 值 进 行 测 量 以 证 实 其 准 确 性 参 见 第 10 页 添 加 G-MM 或 HSA solution 在 本 操 作 指 南 中, 添 加 一 词 会 频 繁 出 现 添 加 是 指 根 据 本 节 或 者 G-Series PLUS 产 品 中 描 述 的 添 加 G-MM 或 HSA-solution 方 法 G-Series PLUS 培 养 液 G-RINSE G-GAMETE 和 EmbryoGlue 不 需 要 添 加 白 蛋 白 其 他 所 有 G-Series 培 养 液 ( 未 标 明 PLUS 字 样 ) 则 表 示 不 含 有 蛋 白 质, 需 要 根 据 下 面 表 格 6 综 述 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

7 所 示 以 适 当 比 例 添 加 G-MM 或 HSA-solution 添 加 蛋 白 时 应 当 注 意, 人 血 清 白 蛋 白 (HSA) 属 于 血 液 制 品, 可 能 含 有 未 知 或 未 识 别 的 人 类 病 原 体 因 此, 在 使 用 HSA 时, 是 无 法 完 全 消 除 这 种 潜 在 传 染 源 发 生 传 播 的 风 险 的 G-MM 含 有 替 代 HSA 的 重 组 人 白 蛋 白, 但 有 可 能 因 为 其 生 产 加 工 工 艺 的 原 因 而 含 有 极 微 量 ( 浓 度 低 于 0.15 ppm) 的 酵 母 菌 抗 原 由 于 生 产 重 组 人 白 蛋 白 的 过 程 中 未 使 用 任 何 来 自 动 物 或 人 类 组 织 成 份, 完 全 由 体 外 生 物 合 成 方 法 产 生 的, 因 此, 该 产 品 不 含 任 何 源 自 动 物 或 人 类 的 潜 在 感 染 原 G-Series 培 养 液 (G-IVF 除 外 ) 都 应 当 添 加 5% 的 G-MM 或 HSA-solution (9.5 ml 培 养 液 中 加 入 0.5 ml) G-MM 的 终 浓 度 为 2.5 mg/ml,hsa 的 终 浓 度 为 5 mg/ml G-IVF 应 当 添 加 10 % 的 G-MM 或 HSA-solution (9 ml 培 养 液 中 加 入 1 ml) G-MM 的 终 浓 度 为 5 mg/ml,hsa-solution 的 终 浓 度 为 10 mg/ml 待 添 加 蛋 白 的 培 养 液 应 分 装 至 灭 菌 的 无 毒 性 组 织 培 养 级 试 管 或 培 养 瓶 中 所 有 容 器 须 用 G-RINSE 预 先 清 洗 以 确 保 试 管 或 培 养 瓶 内 没 有 颗 粒 或 有 毒 物 质 的 残 留 G-MOPS G-1 G-2 G-PGD 的 添 加 蛋 白 比 例 培 养 液 [ml] G-MM 或 HSA-solution [ml] 最 终 体 积 [ml] Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 综 述 7

8 G-IVF 添 加 蛋 白 比 例 培 养 液 [ml] G-MM 或 HSA-solution [ml] 最 终 体 积 [ml] G-FreezeKit Blast 和 G-ThawKit Blast 需 要 采 用 以 下 方 式 添 加 蛋 白 ( 请 参 阅 第 50 和 52 页 ): 9.0 ml 冷 冻 / 复 苏 溶 液 ml G-MM 或 1.0 ml HSA-solution 可 用 培 养 皿 直 接 制 备 添 加 蛋 白 的 冷 冻 液 或 复 苏 液 直 接 将 每 种 冷 冻 保 存 的 溶 液 各 取 900 μl, 各 自 加 入 到 单 独 的 孔 中, 然 后 再 分 别 添 加 100 µl 的 G-MM 或 100 µl HSA-solution 添 加 蛋 白 的 冷 冻 或 复 苏 液 最 好 在 制 备 当 日 使 用 G-MOPS /G-MOPS PLUS 的 推 荐 用 法 G-MOPS /G-MOPS PLUS 是 专 门 在 CO 2 培 养 箱 外 处 理 配 子 与 胚 胎 时 使 用 的 要 点 在 为 了 避 免 卵 母 细 胞 与 胚 胎 受 到 不 必 要 的 应 激 影 响, 在 CO 2 培 养 箱 外 进 行 各 种 操 作 时, 动 作 一 定 要 尽 可 能 的 快 在 培 养 皿 之 间 移 动 卵 母 细 胞 和 胚 胎 以 及 进 行 ICSI 操 作 时, 不 得 取 掉 所 有 培 养 皿 的 盖 子,pH 值 以 及 温 度 和 渗 透 压 有 可 能 在 一 段 时 间 后 发 生 变 化 上 述 情 况 对 所 有 培 养 液, 包 括 G-MOPS /G-MOPS PLUS 均 会 发 生 8 综 述 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

9 ph 值 的 重 要 性 G-MOPS /G-MOPS PLUS 皆 采 用 MOPS 缓 冲 体 系, 必 须 在 +37 C 的 大 气 环 境 中 使 用 切 勿 把 该 培 养 液 置 于 CO 2 环 境 中, 因 为 ph 值 将 下 降 到 低 于 技 术 指 标 的 范 围 此 外, 在 覆 盖 G-MOPS /G-MOPS PLUS 时, 不 得 使 用 在 CO 2 环 境 中 平 衡 过 的 石 蜡 油 温 度 的 重 要 性 卵 母 细 胞 和 胚 胎 应 始 终 保 持 在 +37 C 的 温 度 为 了 确 保 试 管 / 培 养 皿 中 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 在 +37 C 的 温 度, 建 议 您 在 试 管 或 培 养 皿 中 加 入 一 定 量 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 培 养 液, 然 后 分 别 放 置 在 恒 温 试 管 架 和 培 养 皿 恒 温 台 上, 将 校 准 合 格 的 温 度 计 放 入 试 管 或 培 养 皿 中, 对 培 养 液 的 温 度 加 以 测 量 确 认 目 的 是 确 保 G-MOPS /G-MOPS PLUS 使 用 时 的 温 度 为 +37 C 为 此, 需 要 对 每 件 加 温 装 置 都 加 以 校 准 渗 透 压 的 重 要 性 为 了 避 免 渗 透 压 发 生 变 化, 试 管 应 尽 可 能 装 满 并 盖 紧 在 不 使 用 时, 培 养 皿 须 用 培 养 油 加 以 封 盖 或 者 用 盖 子 盖 好 取 卵 用 G-MOPS 取 卵 用 G-MOPS 无 须 添 加 蛋 白 在 使 用 之 前, 为 了 确 保 把 G-MOPS 加 温 到 +37 C, 可 在 不 含 CO 2 的 加 温 培 养 箱 内 放 置 密 封 的 G-MOPS 来 预 热 培 养 液 瓶 盖 应 旋 紧 以 避 免 渗 透 压 发 生 变 化 一 瓶 G-MOPS 达 到 +37 C 需 要 用 4 小 时 每 次 从 加 温 培 养 箱 取 出 瓶 子 并 使 用 后, 都 必 须 重 新 拧 紧 盖 子 应 丢 弃 在 推 荐 的 时 间 内 加 温 的 未 使 用 的 G-MOPS, 例 如 : 如 果 置 于 密 封 的 试 管 中, 培 养 液 需 要 在 一 天 之 内 用 完 ; 如 果 置 于 培 养 皿 中, 并 且 不 封 盖 培 养 油, 培 养 液 体 积 也 不 少 于 1 ml, 则 需 要 在 60 min 内 用 完 ; 如 果 能 够 维 持 恒 温 台 的 合 适 温 度, 则 以 油 覆 盖 的 培 养 液 则 可 以 持 续 使 用 2 个 小 时 处 理 配 子 细 胞 和 胚 胎 时 使 用 的 G-MOPS 处 理 配 子 细 胞 和 胚 胎 使 用 的 G-MOPS 是 必 须 添 加 蛋 白 的 在 超 净 工 作 台 中 将 G-MOPS /G- MOPS PLUS 吸 取 至 无 毒 无 菌 的 试 管 中 若 G-MOPS 中 添 加 了 适 当 量 的 G-MM 或 HSAsolution 试 管 应 注 满 并 旋 紧 盖 子, 避 免 渗 透 压 发 生 变 化 将 试 管 放 置 于 不 含 CO 2 的 37 培 养 箱 或 校 准 好 的 恒 温 试 管 架 内 预 热 用 移 液 管 吸 取 预 热 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 并 置 于 预 热 过 的 培 养 皿 中 为 避 免 渗 透 压 变 化, 应 尽 快 使 用 加 温 好 的 培 养 液, 例 如 : 在 培 养 皿 未 使 用 油 覆 盖 的 情 况 下 ( 培 养 液 至 少 1 ml), 须 在 60 分 钟 内 用 完, 在 培 养 皿 使 用 油 覆 盖 的 情 况 下, 应 在 2 小 时 内 用 完 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 综 述 9

10 用 移 液 管 吸 取 预 平 衡 好 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 并 置 于 预 热 过 的 培 养 皿 中, 该 培 养 皿 放 在 不 含 CO 2 的 加 温 培 养 箱 中 或 恒 温 台 上, 且 盖 上 盖 子 为 了 避 免 渗 透 压 发 生 变 化, 应 以 油 覆 盖 或 者 在 制 备 后 60 分 钟 内 使 用 该 说 明 适 用 于 1 ml 或 更 大 的 用 量 为 了 确 保 培 养 皿 中 的 温 度 维 持 在 +37 C, 建 议 把 经 过 校 准 的 温 度 计 置 于 放 在 恒 温 台 且 含 有 G-MOPS /G-MOPS PLUS 样 本 的 培 养 皿 里 面, 对 温 度 进 行 验 证 必 须 调 整 恒 温 台 的 温 度 设 置, 使 培 养 皿 中 的 培 养 液 达 到 要 求 的 温 度 +37 C 重 要 事 项 将 卵 母 细 胞 或 胚 胎 从 G-MOPS 环 境 中 转 移 入 培 养 环 境 之 前, 必 须 进 行 清 洗, 以 确 保 不 会 将 G-MOPS /G-MOPS PLUS 带 入 后 者 清 洗 流 程 应 包 括 至 少 两 步, 每 一 步 均 使 用 1 ml 的 培 养 液 进 行 清 洗 清 洗 用 皿 应 在 操 作 5 个 卵 母 细 胞 或 胚 胎 后 更 换 如 何 测 量 ph 值 简 介 使 用 玻 璃 膜 电 极 和 现 代 仪 器 测 量 ph 是 一 种 简 单 的 方 法 然 而, 为 了 满 足 最 大 程 度 地 获 取 高 精 确 度 测 量 结 果 的 要 求, 有 一 些 关 键 事 项 必 须 要 注 意 在 测 量 含 有 可 溶 性 气 体 或 高 蛋 白 成 分 的 溶 液 的 ph 值 时, 这 些 注 意 事 项 就 更 显 重 要 了 要 点 使 用 内 置 参 比 电 极 和 测 温 功 能 的 微 电 极 或 半 电 极 使 用 自 动 温 度 补 偿 功 能 的 仪 器 使 用 新 鲜 的 标 准 缓 冲 液, 至 少 其 中 一 种 缓 冲 液 的 ph 值 要 与 待 测 溶 液 的 相 近 每 次 测 量 都 应 该 使 用 新 鲜 配 制 的 标 准 缓 冲 液 每 天 通 过 测 试 斜 率 和 偏 差 值, 确 认 电 极 的 工 作 是 否 正 常 当 电 极 开 始 老 化 时, 应 尽 快 更 换 电 极 ph 电 极 的 使 用 时 间 很 少 有 超 过 12 个 月 的, 通 常 每 两 到 三 个 月 就 需 要 更 换 电 极 应 贮 存 在 中 性 缓 冲 液 或 特 制 的 电 极 储 存 溶 液 中 每 次 测 量 前 均 须 校 准 仪 器 10 综 述 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

11 实 际 操 作 - 建 议 的 ph 值 测 量 步 骤 ( 根 据 仪 器 和 样 本 性 质 的 不 同, 具 体 的 步 骤 会 略 有 不 同 ) 1 从 电 极 存 储 溶 液 中 取 出 电 极, 冲 洗 并 置 于 ph 值 7.00 的 缓 冲 液 中 取 掉 电 极 进 气 孔 的 塞 子 或 套 管 2 将 电 极 置 于 ph 7.00 的 缓 冲 液 中 一 到 两 个 小 时 如 果 电 极 已 在 ph 7.00 的 缓 冲 液 中 存 储 过 夜, 此 步 骤 的 时 间 可 以 缩 短 3 使 用 两 种 新 鲜 的 缓 冲 液 校 准 电 极, 一 种 ph 接 近 7.00, 另 一 种 为 其 他 值, 比 如 ph 核 对 电 极 的 斜 率 和 偏 差 值 是 在 电 极 制 造 商 规 定 的 限 值 内 我 们 建 议 斜 率 应 处 于 理 论 值 的 95 到 102% 之 间,pH 7.00 条 件 下 的 偏 差 值 与 之 前 的 校 准 值 相 差 不 应 超 过 ±4 mv 5 通 过 检 测 ph 约 为 8.00 的 缓 冲 液, 则 可 核 对 所 执 行 的 校 准 是 否 正 确 在 实 际 检 测 温 度 下, 比 较 测 量 之 与 实 际 测 量 温 度 下 的 基 准 值, 两 者 差 值 不 得 多 于 0.05 个 ph 单 位 保 证 通 过 测 量 ph 值 约 为 8.00 的 标 准 缓 冲 液 正 确 地 进 行 校 对 在 实 际 测 量 温 度 下 比 较 ph 测 量 值 和 基 准 值 ph 测 量 值 与 基 准 值 之 间 相 差 不 应 超 过 ±0.05 ph 单 位 6 把 电 极 置 于 蒸 馏 水 中, 且 该 蒸 馏 水 的 温 度 与 待 测 样 本 测 量 时 的 温 度 应 该 一 致 7 样 本 在 规 定 的 温 度 和 气 体 成 分 中 进 行 平 衡 CO 2 平 衡 最 多 可 能 需 要 16 小 时! 8 从 蒸 馏 水 中 取 出 电 极 ; 用 柔 软 的 干 净 纸 巾 轻 轻 拭 去 电 极 前 端 的 水 迹 立 即 把 电 极 置 于 平 衡 后 PH 的 培 measure 养 液 中 电 极 的 玻 璃 泡 以 及 参 比 电 极 的 触 点 必 须 浸 没 于 液 面 下, 见 下 方 图 示 a) 与 b) a) b) a) 烧 结 盘 形 窗 式 探 头 b) 套 筒 式 接 头 SWIMUP C a) b) SWIMUP D/E Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 综 述 11

12 9 当 ph 值 稳 定 时 即 刻 读 取 数 据 如 果 采 用 CO 2 平 衡 待 测 培 养 液, 从 培 养 箱 取 出 培 养 液 起 算, 整 个 检 测 流 程 应 在 30 秒 内 完 成 如 果 超 过 这 一 规 定 时 间 范 围,CO 2 将 会 从 样 本 挥 散 到 空 气 当 中, 导 致 培 养 液 的 ph 值 上 升 10 作 为 一 项 额 外 的 预 防 措 施, 应 将 已 知 实 际 测 量 条 件 下 ph 值 的 对 照 培 养 液 与 待 测 培 养 液 进 行 平 行 测 量 这 将 有 助 于 核 实 整 个 测 量 过 程 的 操 作 是 否 准 确 无 误 11 在 登 记 或 记 录 簿 上 记 录 所 有 测 试 数 据, 包 括 校 准 数 据 IVF 与 培 养 系 统 当 考 虑 IVF 培 养 系 统 时, 会 有 很 多 的 选 择 本 操 作 指 南 推 荐 的 产 品 使 用 方 法 已 被 证 实 是 非 常 成 功 的 要 点 根 据 其 有 效 性 简 洁 性 和 可 重 复 性 选 择 您 的 培 养 系 统 事 先 做 好 安 排 以 及 准 备 工 作 仅 使 用 无 毒 无 菌 的 一 次 性 使 用 耗 材, 这 些 耗 材 应 符 合 胚 胎 培 养 的 质 控, 同 时 应 记 录 操 作 的 全 部 项 目 和 程 序 严 格 遵 循 操 作 规 程 以 确 保 一 致 性 请 确 保 您 所 使 用 的 实 验 设 备 能 够 得 到 正 确 的 维 护 定 期 的 检 查 和 校 准 所 有 操 作 均 需 在 洁 净 的 专 用 工 作 环 境 ( 超 净 工 作 台 ) 中 进 行 使 用 无 菌 操 作 技 术 保 证 操 作 人 员 在 使 用 培 养 液 时 操 作 规 范 合 格, 保 证 培 训 操 作 规 程 的 一 致 性 处 理 生 物 体 液 时 必 须 戴 上 无 毒 性 的 手 套 操 作 前, 核 对 患 者 身 份 并 标 记 所 有 材 料 12 综 述 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

13 精 子 制 备 在 用 于 IUI IVF 和 ICSI 之 前, 应 从 精 浆 死 精 子 细 胞 和 其 他 细 胞 中 分 离 出 活 动 精 子 细 胞 采 用 不 同 的 程 序 可 以 达 到 上 述 目 标 具 体 选 用 哪 一 种 方 法 来 进 行 精 子 制 备, 要 根 据 患 者 的 病 史 之 前 的 精 液 分 析 结 果 以 及 对 当 前 样 本 的 检 查 结 果 来 决 定 另 一 个 需 要 考 虑 的 问 题 是 采 用 IVF 还 是 ICSI 进 行 授 精 与 ICSI 相 比, 采 用 IVF 授 精 需 要 更 多 的 精 子 细 胞 用 以 授 精 在 制 备 过 程 中, 根 据 精 子 活 力 进 行 筛 选, 活 精 子 是 最 为 理 想 的, 或 基 于 精 子 密 度 指 标 进 行 选 择, 成 熟 的 精 子 细 胞 则 是 最 优 之 选 如 果 精 子 的 计 数 和 活 力 适 当, 则 适 合 用 迁 移 ( 上 游 法 ) 如 果 精 液 的 质 量 较 差 并 且 含 有 大 量 其 他 细 胞, 则 首 选 密 度 梯 度 离 心 法 从 精 子 回 收 总 量 的 角 度 来 看, 相 对 于 上 游 法, 使 用 密 度 梯 度 离 心 的 方 法 可 以 对 精 子 细 胞 进 行 更 加 有 效 的 回 收 然 而 在 某 些 情 况 下, 通 过 上 游 法 所 获 得 的 精 子 细 胞 中 活 细 胞 的 比 率 会 更 高 一 些 要 点 精 子 的 制 备 应 在 洁 净 无 菌 的 工 作 区 域 进 行 在 操 作 精 液 样 本 时, 应 穿 戴 无 毒 无 粉 的 手 套 和 保 护 眼 镜 使 用 恰 当 的 灭 菌 的 无 毒 性 容 器 收 集 所 需 样 本 建 议 在 精 子 制 备 之 前 一 小 时 内 采 集 精 液 样 本 避 免 将 精 液 样 本 置 于 过 冷 或 过 热 环 境 当 中 应 遵 守 所 有 的 实 验 室 规 程, 确 认 患 者 身 份 信 息 的 周 密 操 作 规 程 在 用 于 制 备 精 子 之 前, 应 使 用 G-RINSE 溶 液 对 所 使 用 的 灭 菌 无 毒 性 试 管 或 离 心 管 针 以 及 移 液 管 进 行 清 洗 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 精 子 制 备 13

14 上 游 法 ( 迁 移 ) 实 际 操 作 该 方 法 适 用 于 精 子 计 数 和 活 力 良 好 的 精 液 样 本 1 精 液 液 化 大 约 需 要 20 分 钟 如 果 样 本 未 液 化, 需 用 规 格 为 23 G 的 注 射 针 或 灭 菌 无 毒 性 的 巴 斯 德 吸 管 吸 打 液 化 20 分 钟 PH measure 2 使 用 显 微 镜 评 估 精 液 样 本, 确 认 处 理 精 液 的 最 佳 方 法 a) b) 3 在 试 管 上 标 明 病 人 编 号 如 果 担 心 精 子 的 质 量 问 题, 可 以 制 备 多 个 试 管 4 吸 取 1.0 ml 精 液 至 清 洗 过 的 试 管 中 根 据 精 液 量 准 备 2-4 个 试 管 在 上 层 小 心 加 入 2.0 ml 平 衡 好 且 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF 或 G-IVF PLUS 将 上 游 管 倾 斜 一 定 角 度, 置 于 +37 SWIMUP C 6% CO 2 的 培 养 箱 分 钟 a) b) a) b) 在 37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 孵 育 分 钟 a) G-IVF / G-IVF PLUS b) 精 液 SWIMUP D/E 14 精 子 制 备 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

15 a) b) 5 在 SWIMUP 不 触 及 底 层 精 D/E 液 的 情 况 下, 吸 取 上 层 培 养 液 并 移 送 至 清 洁 的 试 管 中 添 加 5.0 ml 经 过 预 先 平 衡 并 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF /G-IVF PLUS, 混 匀, g 离 心 10 分 钟 去 除 上 层 培 养 液 使 用 G-IVF / G-IVF PLUS 稀 释 离 心 6 弃 上 清, 在 5.0 ml 平 衡 好 且 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF 或 G-IVF PLUS 中 重 悬, g 重 复 离 心 10 分 钟 DENS A GIII A Remove supernatant. Repeat wash. a) b) c) 弃 上 清 再 次 清 洗 7 弃 上 清, 合 并 收 集 到 的 沉 淀 在 ml 平 衡 好 且 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF 或 G-IVF PLUS DENS 中 重 B,C,D 悬 GIII Resuspend B in C D small volume G-FERT. 用 少 量 的 G-IVF a) / G-IVF PLUS 重 悬 8 测 定 洗 脱 样 本 中 的 精 子 活 力 和 浓 度 9 使 用 经 过 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF 或 G-IVF PLUS 稀 释 洗 涤 过 的 样 本, 使 终 浓 度 达 到 75 PREPCULT A,B 个 活 动 精 子 /ml 10 在 经 过 冲 洗 的 授 精 培 养 皿 中 加 入 ml 的 精 子 悬 浮 液, 在 +37 C 和 6 % CO A a) B a) 2 的 条 件 下 至 少 平 衡 2 小 时 其 他 方 法 : 把 平 衡 过 的 精 子 悬 浮 液 添 加 到 平 衡 过 且 放 有 卵 母 细 胞 的 培 养 皿 中 如 果 使 用 油 覆 盖 的 b) 方 法, 建 议 至 少 使 用 100 µl 的 液 滴 量 b) MICRO A,B Vitrolife G-Series A 操 作 指 南 ( 版 本 a) 7.0) 精 子 制 备 f) b) a) b) 15

16 密 度 梯 度 离 心 法 a) b) 该 方 法 用 于 清 洗 所 有 不 同 质 量 的 精 液 样 本 SpermGrad 是 一 种 含 有 采 用 硅 烷 包 被 硅 胶 颗 粒 的 等 渗 平 衡 盐 溶 液 通 过 使 用 不 同 的 SpermGrad 稀 释 剂 SWIMUP, 就 可 以 获 得 密 C度 不 同 的 溶 液 在 离 心 管 中 小 心 地 加 入 不 同 密 度 的 溶 液 层 以 建 立 密 度 梯 度 有 着 不 同 浮 力 密 度 的 细 胞 及 其 他 颗 粒 将 会 逐 渐 沉 淀, 直 到 进 入 密 度 更 高 的 溶 液 层 而 无 法 继 续 沉 淀 为 止 离 心 可 以 加 速 上 述 沉 淀 过 程 通 常 来 说, 可 以 使 用 90 % 与 45 % SpermGrad 的 两 步 梯 度 由 于 成 熟 精 子 的 DNA 排 列 紧 密, 其 密 度 高 于 90 % SpermGrad, 通 过 该 层 即 可 沉 积 且 可 见 于 试 管 底 部, 而 其 他 细 胞 ( 包 括 未 成 熟 和 死 精 子 ) 则 在 90 % 或 45 % 的 交 界 处 停 止 沉 积 可 以 使 用 已 稀 释 到 90% ( 上 层 ) 和 45% ( 下 层 ) 的 SpermGrad 即 用 型 溶 液 或 者 SpermGrad 100% 原 溶 液 原 溶 液 应 在 G-IVF /G-IVF PLUS 中 稀 释 到 合 a) 适 的 浓 度 G-IVF 应 添 加 G-MM 或 HSA-solution 在 使 用 之 前,G-IVF /G-IVF PLUS 应 在 +37 C 和 6% CO 2 的 条 件 下 平 衡 b) 实 际 操 作 1 如 果 使 用 SpermGrad RTU, 请 直 接 阅 读 步 骤 2 如 果 使 用 SpermGrad 100% 原 溶 液, 操 作 步 骤 如 下 : SWIMUP D/E 在 单 独 的 试 管 中 用 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF 或 G-IVF PLUS 稀 释 SpermGrad, 获 得 90 % 和 45 % 的 储 备 液 对 于 90% 的 储 备 液, 需 混 合 9.0 ml SpermGrad 与 1.0 ml 添 加 过 蛋 白 的 G-IVF 对 于 45 % 的 储 备 液, 需 混 合 4.5 ml SpermGrad 与 5.5 ml 添 加 过 蛋 白 的 G-IVF 充 分 混 合 溶 液, 并 贮 存 在 无 菌 无 毒 的 试 管 或 组 织 培 养 瓶 中 贴 上 标 签 并 冷 冻 直 到 使 用 始 终 使 用 无 菌 无 毒 的 吸 管 分 装 各 种 精 液 制 备 所 需 的 用 量 储 藏 液 应 标 记 日 期, 并 在 推 荐 的 保 存 期 限 内 使 用 ( 见 瓶 上 效 期 ) 在 使 用 之 前, 使 溶 液 恢 复 至 室 温 并 在 6% CO 2 条 件 下 平 衡 以 达 到 正 确 的 ph 值 2 将 分 层 的 密 度 梯 度 分 离 液 置 于 2-4 个 无 菌 且 冲 洗 过 的 锥 底 离 心 管 ( 根 据 精 液 样 本 量 确 定 离 心 管 个 数 ), 离 心 管 应 标 记 患 者 编 号 首 先 吸 取 1.5 ml 90% 溶 液 至 离 心 管 中, 然 后 在 上 层 缓 慢 加 入 1.5 ml 45% 溶 液 最 后, 在 其 上 层 轻 轻 添 加 一 层 1.0 ml 精 液 ( 如 图 A 所 示 ) 制 备 2-4 DENS 个 梯 度 A 离 GIII 心 试 管 梯 度 顶 层 最 多 加 入 2 ml 精 液 如 果 精 液 样 本 质 量 正 常 可 减 少 精 液 量 如 果 添 加 的 精 液 过 多, 则 会 导 致 分 离 效 果 A a) b) c) A. 加 入 梯 度 溶 液 及 精 液 至 锥 形 底 离 心 管 中 离 心 g / 20 分 钟 a) 精 液 b) 45 % c) 90 % DENS B,C,D GIII B C D 16 精 子 制 备 a) Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

17 DENS A GIII 3 以 g 离 心 分 钟 A 4 小 心 除 去 上 面 两 层 液 体, 并 注 意 避 免 将 液 体 残 留 于 试 管 壁 上 ( 如 图 B 所 示 ) 尽 可 能 将 梯 度 分 离 液 移 除 干 净, 然 后 加 入 5 ml 平 衡 好 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-IVF 或 G-IVF PLUS, 重 悬 沉 淀 并 a) 转 移 至 不 要 吸 入 90% 溶 液, 加 入 到 含 5 ml 添 加 蛋 白 的 G-IVF 或 G-IVF PLUS 的 另 b) 一 个 无 菌 且 经 过 清 洗 的 锥 形 试 底 离 心 管 中 c) 5 在 g 的 条 件 下 离 心 10 分 钟 6 抽 取 并 弃 掉 上 清, 然 后 重 复 进 行 清 洗 ( 如 图 C 所 示 ) 经 过 第 二 次 清 洗 后, 混 合 颗 粒 并 回 溶 于 1 ml DENS 平 衡 过 B,C,D 并 添 加 GIII 了 蛋 白 的 G IVF /G IVF PLUS ( 如 图 D 所 示 ) 评 估 清 洗 过 的 样 本 活 力 和 浓 度 B C D a) B. 去 除 顶 层 液 体 并 把 沉 淀 移 到 清 洁 的 试 管 中 a) 沉 淀 PREPCULT A,B C. 使 用 G-IVF /G-IVF PLUS 清 洗 沉 淀 重 复 操 作 D. 以 少 量 G-IVF /G-IVF PLUS 回 溶 沉 淀 7 用 平 衡 好 且 的 ( 已 添 加 添 加 蛋 白 的 ) G-IVF 或 G-IVF PLUS 将 稀 释 清 洗 过 的 精 子 样 本 稀 释 至 A, 使 最 终 的 密 度 a) 为 B a) 个 活 动 精 子 /ml 8 在 经 过 冲 洗 的 授 精 培 养 皿 中 加 入 ml 的 精 子 悬 浮 液, 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 至 少 平 衡 2 小 时 b) b) 此 步 骤 也 可 按 照 如 下 方 法 操 作 : 把 平 衡 过 的 精 子 悬 浮 液 添 加 到 平 衡 过 的 放 有 卵 母 细 胞 的 培 养 皿 中 建 议 在 无 油 覆 盖 的 情 况 下 使 用 MICRO A,B ml 的 体 系 进 行 授 精 如 果 使 用 油 覆 盖 的 方 法, 建 议 授 精 体 系 可 以 缩 小 到 100 µl 的 液 滴 A f) a) b) a) b) c) d) e) c) d) B a) b) c) d) Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 精 子 制 备 17

18 18 精 子 制 备 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

19 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife 为 胚 胎 发 育 的 各 个 阶 段 开 发 了 培 养 液 G-IVF /G IVF PLUS 应 用 于 体 外 授 精 G-1 /G-1 PLUS 用 于 卵 裂 胚 和 早 期 胚 胎 培 养 G-2 /G-2 PLUS 用 于 从 第 3 天 到 囊 胚 期 的 胚 胎 培 养 在 完 成 ICSI 操 作 之 后, 胚 胎 也 应 直 接 放 入 G-1 /G-1 PLUS 进 行 培 养 不 管 胚 胎 处 于 何 种 时 期, 将 胚 胎 移 植 入 子 宫 时 均 需 使 用 EmbryoGlue 或 者 G-2 ( 需 添 加 蛋 白 )/G-2 PLUS 取 卵 卵 母 细 胞 采 集 程 序 的 目 的 是 尽 快 采 集 尽 可 能 多 的 卵 母 细 胞, 并 在 最 大 限 度 上 减 少 卵 母 细 胞 暴 露 于 非 生 理 条 件 下 的 机 会 重 要 的 参 数 包 括 温 度 渗 透 压 和 ph 值 与 生 理 条 件 的 任 何 条 件 上 的 偏 差 都 会 影 响 到 卵 母 细 胞 的 正 常 授 精 以 及 顺 利 完 成 着 床 前 的 发 育 的 产 生 不 良 影 响 要 点 取 卵 的 当 天 即 为 第 0 天 操 作 前 要 核 实 患 者 身 份 是 否 与 培 养 皿 以 及 吸 管 上 标 记 的 编 号 信 息 相 符 确 保 所 有 与 卵 母 细 胞 接 触 的 界 面 都 已 经 加 温 ; 确 保 所 有 可 能 与 卵 母 细 胞 发 生 接 触 的 材 料 符 合 以 下 质 量 要 求 : 无 菌 无 毒 性, 并 能 达 到 组 织 培 养 质 量 标 准, 而 且 最 好 是 经 过 鼠 胚 试 验 检 测 合 格 的 在 执 行 卵 母 细 胞 采 集 术 时, 应 使 用 具 有 双 腔 或 单 腔 的 超 声 引 导 穿 刺 针 有 关 推 荐 的 穿 刺 针, 请 参 见 Vitrolife 第 62 页 的 耗 材 类 产 品, 取 卵 针,V-Tip 通 常 用 取 卵 真 空 泵 对 针 腔 中 施 加 负 压 过 高 或 者 无 法 掌 控 的 负 压 力 可 能 会 对 卵 母 细 胞 造 成 损 伤 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 19

20 在 取 卵 操 作 过 程 中 所 使 用 的 冲 洗 液 为 预 热 的 G-MOPS 培 养 液 G-MOPS 是 经 过 改 进 的 G-1 培 养 液, 使 用 MOPS 和 碳 酸 氢 钠 缓 冲, 以 便 维 持 室 温 下 ph 水 平 由 于 卵 泡 液 中 的 蛋 白 质 含 量 较 高, 在 收 集 抽 取 物 和 冲 洗 卵 泡 时, 可 以 使 用 不 含 蛋 白 质 且 预 热 过 的 G-MOPS 须 先 用 预 热 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-MOPS 或 G-MOPS PLUS 清 洗 卵 泡, 再 放 入 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-IVF 或 G-IVF PLUS 中 进 行 培 养 在 +37 6% CO 2 条 件 下 平 衡 过 的 G-GAMETE, 可 以 作 为 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS 或 G-MOPS PLUS 的 替 代 物 使 用 建 议 每 个 清 洗 用 培 养 皿 最 多 清 洗 5 个 卵 泡 实 际 操 作 1 在 +37 C 的 温 度 下 和 6 % CO 2 的 环 境 中, 预 平 衡 G-RINSE 2 加 热 用 于 清 洗 卵 母 细 胞,G-MOPS PLUS: 吸 取 培 养 液 至 冲 洗 过 的 试 管 中 盖 紧 试 管 并 将 其 置 于 +37 无 CO 2 的 培 养 箱 内 3 加 热 用 于 冲 洗 卵 泡 的 ( 未 添 加 蛋 白 的 )G-MOPS : 吸 取 培 养 液 至 冲 洗 过 的 试 管 中 盖 紧 试 管 并 将 其 置 于 +37 无 CO 2 的 加 热 培 养 箱 内 在 使 用 之 前, 确 保 培 养 液 的 温 度 为 +37 C 4 使 用 G-RINSE 冲 洗 针 腔 并 丢 弃 冲 洗 液 5 卵 泡 抽 取 可 以 逐 个 进 行, 也 可 以 数 个 卵 泡 同 时 抽 取 采 集 的 卵 泡 液 应 收 集 在 经 过 冲 洗 的 无 菌 无 毒 组 织 培 养 管 中 G-MOPS 中 可 以 添 加 质 量 经 过 检 测 的 药 物 级 肝 素 ( 单 位 /ml), 以 便 减 少 含 有 血 液 的 取 卵 液 的 凝 结 现 象 6 取 卵 液 应 收 集 在 一 次 性 使 用 的 无 菌 无 毒 组 织 培 养 管 中, 且 应 由 实 验 室 立 即 进 行 检 查 如 果 无 法 直 接 检 查, 试 管 应 密 封 并 保 存 在 +37 C 的 温 度 中 卵 母 细 胞 辨 别 要 点 穿 戴 无 毒 手 套 操 作 前 可 是 患 者 身 份 为 了 避 免 冷 却, 操 作 应 迅 速 20 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

21 实 际 操 作 1 取 卵 液 应 维 持 在 +37 C 将 恒 温 试 管 架 置 于 显 微 镜 旁 进 行 操 作 会 更 为 便 利 应 在 无 菌 的 组 织 培 养 皿 中 通 过 显 微 镜 检 查 取 卵 液 2 如 果 需 要 冲 洗 卵 泡, 应 使 用 预 先 加 温 到 +37 C 的 G-MOPS 3 把 取 卵 液 移 到 空 培 养 皿 中 辨 别 卵 母 细 胞, 立 即 用 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 吸 管 将 卵 母 细 胞 从 卵 泡 液 和 可 能 存 在 的 血 液 污 染 中 取 出 预 先 冲 洗 无 菌 吸 管 应 使 用 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-MOPS 或 G-MOPS PLUS 4 首 先, 在 预 先 加 温 并 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 对 卵 母 细 胞 进 行 冲 洗, 然 后 再 在 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF /G-IVF PLUS 中 冲 洗 其 中, 在 ( 已 添 加 蛋 白 的 ) G-IVF 或 G-IVF PLUS 中 的 漂 洗 操 作 至 少 要 包 括 两 步 重 复 操 作, 每 一 步 所 使 用 的 溶 液 体 积 为 1.0 ml 把 卵 母 细 胞 移 送 到 装 有 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF /G-IVF PLUS 培 养 皿 中, 然 后 立 即 把 培 养 皿 送 回 培 养 箱 卵 母 细 胞 培 养 与 授 精 要 点 配 子 细 胞 的 处 理 和 授 精 过 程 的 关 键 是 要 严 格 控 制 温 度 ph 值 以 及 渗 透 压 温 度 下 降 非 常 迅 速, 其 下 降 速 度 与 培 养 器 皿 处 于 培 养 箱 之 外 的 时 间 有 关, 也 与 表 面 是 否 加 热 有 关, 比 如 加 热 的 显 微 镜 载 物 台 渗 透 压 的 改 变 与 培 养 液 的 体 积 体 积 培 养 环 境 的 温 度 以 及 是 否 覆 封 盖 培 养 油 等 因 素 密 切 相 关 渗 透 压 的 变 化 发 生 比 较 缓 慢, 通 常 不 易 察 觉 培 养 系 统 应 保 持 一 定 的 湿 度, 而 且 培 养 液 最 好 封 盖 培 养 油 与 温 度 类 似,pH 值 的 变 化 亦 十 分 迅 速, 并 且 与 培 养 器 皿 处 于 培 养 箱 之 外 的 时 间 和 暴 露 在 空 气 中 的 时 间 有 关 确 保 对 所 有 培 养 容 器 表 面 进 行 加 温 ; 确 保 所 有 可 能 接 触 到 卵 母 细 胞 的 材 料 均 为 无 菌 无 毒 性 的 并 且 是 符 合 组 织 培 养 质 量 标 准 的, 最 好 是 经 过 鼠 胚 试 验 检 测 合 格 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 21

22 授 精 实 际 操 作 1 把 卵 母 细 胞 移 送 到 含 有 个 精 子 /ml 的 授 精 皿 中, 且 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 过 夜 授 精 其 他 方 法 : 把 平 衡 过 的 精 子 悬 浮 液 添 加 到 平 衡 过 的 放 有 卵 母 细 胞 的 培 养 皿 中 可 以 在 同 一 个 培 养 容 器 内 为 多 个 卵 母 细 胞 授 精 如 果 使 用 油 覆 盖 的 方 法, 建 议 至 少 使 用 100 µl 的 授 精 体 系 ( 滴 液 ) 授 精 评 估 要 点 加 入 精 子 后 约 小 时 ( 第 一 天 Day 1), 检 查 IVF 授 精 操 作 卵 母 细 胞 的 受 精 情 况 若 采 取 ICSI 方 法, 则 应 在 注 射 后 小 时 进 行 检 查, 因 为 原 核 (PN) 可 能 会 较 早 出 现 授 精 的 卵 母 细 胞 对 温 度 和 ph 值 的 变 化 非 常 敏 感, 在 培 养 箱 之 外 操 作 培 养 液 时, 应 使 用 预 先 加 温 并 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 尽 量 减 少 上 述 变 化, 这 一 点 至 关 重 要 G-MOPS /G-MOPS PLUS 中 的 MOPS 缓 冲 体 系 可 以 使 培 养 液 的 ph 值 在 室 内 气 体 环 境 中 保 持 稳 定 该 溶 液 在 使 用 之 前 无 需 在 CO 2 环 境 中 进 行 平 衡 更 具 体 地 说,G-MOPS / G-MOPS PLUS 是 专 门 用 于 在 CO 2 培 养 箱 外 部 的 环 境 中 将 ph 值 维 持 在 之 间 的 培 养 液 G-GAMETE 可 代 替 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 在 使 用 之 前,G- GAMETE 应 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 经 过 平 衡 建 议 开 启 显 微 镜 恒 温 台 的 加 热 功 能 并 快 速 操 作 为 了 确 保 培 养 皿 内 部 的 温 度 能 够 正 确 达 到 +37, 加 热 平 台 应 设 置 在 稍 微 高 一 点 的 温 度, 通 常 为 而 且, 为 了 保 证 培 养 皿 内 温 度 的 准 确 性, 应 使 用 合 格 的 温 度 计 或 经 过 校 准 的 配 有 热 电 偶 的 数 字 温 度 计 进 行 测 量 确 认,( 热 电 偶 应 可 以 固 定 于 恒 温 台 上 及 培 养 皿 内 ) 实 际 操 作 - 授 精 评 估 1 把 卵 母 细 胞 移 至 添 加 了 预 热 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 培 养 皿 中 2 在 +37 C 的 温 度 下, 使 用 剥 卵 针 从 卵 母 细 胞 上 除 去 卵 丘 细 胞 和 放 射 冠 细 胞, 参 见 第 62 页 有 关 Vitrolife 制 造 的 器 材 通 常 精 子 的 透 明 质 酸 酶 可 以 很 好 地 将 卵 丘 细 胞 和 放 射 冠 细 胞 解 离 开 如 果 卵 丘 细 胞 解 离 效 果 不 好 佳, 应 使 用 剥 卵 针 小 心 从 放 射 冠 细 胞 中 拨 出 卵 母 细 胞, 至 能 够 清 晰 观 擦 到 极 体 和 原 核 即 可 直 到 仅 除 去 可 清 楚 观 察 到 极 体 和 原 核 为 止 22 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

23 3 镜 下 观 察 检 并 记 录 原 核 极 体 以 及 可 能 出 现 的 胚 泡 (GV) 的 数 目 建 议 您 在 装 配 有 Nomarski 或 Hoffman 光 学 组 件 的 倒 置 显 微 镜 上 进 行 高 倍 率 (200 ) 放 大 观 察 建 议 使 用 含 有 Nomarski 或 Hoffman 光 学 元 件 的 倒 置 显 微 镜 在 高 放 大 倍 数 下 (200 ) 进 行 观 察 如 果 采 用 在 较 低 的 放 大 倍 数 下, 很 难 进 行 精 确 的 受 精 评 估 只 有 来 自 正 常 受 精 卵 母 细 胞 的 胚 胎 (2 PN) 才 可 以 考 虑 用 于 胚 胎 培 养 和 移 植 未 受 精 或 退 化 的 卵 母 细 胞 仅 有 单 个 原 核 的 1 PN 胚 胎 (1 PN) 以 及 超 过 2 PN 的 胚 胎 应 从 培 养 物 种 体 系 中 移 除 原 核 评 分 方 法, 参 见 下 页 后 续 说 明 4 在 评 估 之 后, 授 精 的 卵 母 细 胞 应 在 数 滴 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-1 /G-1 PLUS 中 充 分 冲 洗, 然 后 在 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-1 /G-1 PLUS 中 进 行 培 养, 最 好 以 油 封 盖 人 原 核 胚 胎 的 评 分 方 法 文 献 出 处 :Scott L, Alvero R, Leondires M and Miller B The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation.hum Repr 15, 第 11 期, 第 页 要 点 授 精 卵 的 形 态 与 囊 胚 的 发 育 着 床 和 妊 娠 相 关 该 评 分 系 统 基 于 2 PN 的 形 态 来 对 授 精 卵 的 发 育 能 力 进 行 评 估 的 原 核 评 分 可 以 与 第 3 天 的 评 分 和 / 或 囊 胚 的 评 分 结 合 使 用 综 合 评 估 胚 胎 为 了 避 免 多 胎 妊 娠 的 并 发 症, 建 议 胚 胎 的 移 植 数 量 不 超 过 两 个 实 际 操 作 授 精 卵 的 评 分 应 通 过 倒 置 显 微 镜 并 在 生 理 ph 值 以 及 温 度 条 件 下 进 行 应 在 授 精 后 小 时 或 ICSI 后 小 时 进 行 评 分, 因 为, 与 授 精 的 卵 母 细 胞 相 比, 显 微 注 射 ICSI 处 理 的 卵 母 细 胞 中 的 原 核 可 能 出 现 和 消 失 的 时 间 可 能 得 会 更 早, 因 此 应 在 ICSI 操 作 后 小 时 进 行 评 分 建 议 在 此 操 作 过 程 中 使 用 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-MOPS 或 G-MOPS PLUS, 或 者 G-GAMETE Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 23

24 SWIMUP D/E 评 分 系 统 细 胞 核 应 均 等 大 小 核 仁 应 在 原 核 连 接 处 对 齐 排 列 每 个 细 胞 核 应 具 有 3-7 枚 核 仁, 且 细 胞 核 间 核 仁 的 数 目 相 差 不 得 超 过 一 枚 核 仁 应 大 小 均 匀 为 了 获 得 最 佳 的 妊 娠 和 着 床 率, 移 植 时 应 选 择 在 PN 期 呈 现 良 好 发 育 形 态 的 胚 胎,( 如 下 图 中 Z1 所 示 ) DENS A GIII 原 核 形 态 模 式 A Z1 Z2 Z3 Z4 a) b) c) DENS B,C,D GIII Z1 Z2 Z3 Z4 选 择 培 养 系 统 B C D 在 培 养 配 子 和 胚 胎 时, 基 本 上 可 以 选 择 两 种 培 养 系 统 : A B 大 体 系 (0.5 ml 1.0 ml) 置 于 试 管 或 培 养 皿 的 孔 中, 覆 油 或 不 覆 油 皆 可 小 体 系 (0.05 ml 0.1 ml 液 滴 ) 封 盖 培 养 油 a) 培 养 体 系 具 有 较 大 的 表 面 积, 如 果 不 封 盖 培 养 油, 其 渗 透 压 在 几 天 内 就 会 发 生 改 变 因 此, 我 们 建 议 加 盖 培 养 油, 这 不 仅 能 够 用 作 稳 定 培 养 体 系 的 温 度 和 渗 透 压, 同 时 也 能 作 为 一 种 有 效 的 屏 障 阻 挡 外 界 尘 粒 及 微 生 物 的 污 染 石 蜡 油 因 其 粘 度 和 高 纯 度 特 性 被 用 作 培 养 油 OVOIL 是 一 种 药 PREPCULT A,B 物 级 的 轻 质 石 蜡 油, 使 用 0.22 µm 孔 径 的 无 菌 过 滤 器 进 行 过 滤, 从 而 达 到 无 菌 要 求 A a) B a) b) b) A. 封 盖 OVOIL 的 多 孔 培 养 皿 a) OVOIL b) 培 养 液 MICRO A,B 培 养 胚 胎 时 最 多 不 应 超 过 48 小 时 就 应 更 换 培 养 液 B. 封 盖 OVOIL 的 液 滴 a) OVOIL b) 培 养 液 液 滴 μl A a) 24 f) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 b) a) b) Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) c) d)

25 培 养 系 统 的 准 备 对 于 所 有 培 养 液 来 说, 胚 胎 理 想 的 培 养 条 件 是 6 % CO 2 和 5 % O 2 可 以 通 过 使 用 三 气 培 养 箱 或 可 注 入 混 合 气 体 (6% CO 2 5% O 2 以 及 89% N 2 ) 的 模 块 化 培 养 装 置 / 新 生 儿 抚 育 箱 来 建 立 这 种 气 体 环 境 使 用 低 氧 环 境 具 有 明 显 的 优 势 如 果 无 法 提 供 低 氧 环 境, 也 可 在 6 % CO 2 大 气 环 境 中 进 行 培 养 实 际 操 作 1 所 有 的 培 养 皿 ( 微 孔 或 试 管 ) 都 必 须 使 用 G-RINSE 进 行 冲 洗, 并 且 在 程 序 执 行 之 前 进 行 制 备 2 在 取 采 卵 操 作 母 细 胞 的 当 天 下 午, 首 先 准 备 好 一 个 60 mm 的 培 养 皿 并 在 皿 上 标 记 好 患 者 编 号 然 后 用 移 液 器 ( 装 配 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 向 培 养 微 孔 中 加 入 25 μl( 已 添 加 蛋 白 的 ) G-1 或 G-1 PLUS, 立 即 使 用 OVOIL 覆 盖 液 滴, 防 止 挥 发 每 次 制 备 培 养 皿 一 个 或 者 采 用 另 外 一 种 方 法 : 准 备 好 一 个 40 mm 的 培 养 皿, 在 皿 上 标 记 好 患 者 的 编 号 使 用 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 吸 管 头, 制 备 若 干 个 体 积 为 50 μl 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-1 或 G-1 PLUS 液 滴, 立 即 使 用 OVOIL 覆 盖 液 滴, 防 止 挥 发 每 次 制 备 培 养 皿 一 个 为 了 使 制 备 的 液 滴 能 够 呈 球 形, 可 以 这 样 操 作 : 首 先, 用 移 液 器 ( 装 配 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 在 40 mm 的 培 养 皿 底 制 备 6 滴 体 积 为 25 µl 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-1 或 G-1 PLUS 液 滴, 立 即 封 盖 培 养 油 立 即 使 用 OVOIL 覆 盖 液 滴, 防 止 挥 发 然 后, 将 移 液 器 换 上 新 的 枪 头 ( 须 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 并 用 ( 制 备 液 滴 所 用 ) 培 养 液 润 洗 一 下, 然 后 在 每 个 原 始 的 液 滴 上 再 添 加 25 µl 培 养 液 每 次 制 备 的 培 养 皿 数 量 不 得 超 过 一 只 这 个 方 法 可 以 让 液 滴 向 上 隆 起 呈 球 形 的 而 不 是 平 铺 的 3 立 即 把 培 养 皿 置 于 6 % CO 2 和 +37 C 的 培 养 箱 中 轻 轻 取 掉 培 养 皿 的 盖 子, 并 以 一 定 的 角 度 斜 盖 在 皿 上 上 述 方 法 可 以 确 保 培 养 皿 达 到 良 好 的 平 衡 在 培 养 箱 中, 培 养 皿 应 在 盖 子 半 开 的 状 态 至 少 平 衡 6 个 小 时 ( 这 是 培 养 液 在 封 盖 了 培 养 油 的 情 况 下 能 够 达 到 正 确 ph 值 的 最 短 时 间 ), 最 长 不 超 过 18 小 时 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 25

26 胚 胎 培 养 要 点 胚 胎 培 养 过 程 的 的 关 键 是 要 严 格 控 制 温 度 ph 值 以 及 渗 透 压 如 果 将 培 养 容 器 放 置 于 培 养 箱 外 时 间 过 长, 温 度 会 迅 速 下 降 因 而, 建 议 在 具 有 加 热 功 能 的 显 微 镜 恒 温 台 上 进 行 操 作 渗 透 压 的 变 化 十 分 缓 慢, 通 常 不 易 被 发 觉 培 养 系 统 应 保 持 正 常 湿 度, 最 好 覆 油 在 培 养 液 暴 露 到 空 气 中 时,pH 的 变 化 十 分 迅 速 应 尽 量 缩 短 培 养 皿 处 于 培 养 箱 外 的 时 间 通 过 囊 胚 移 植, 可 以 取 得 较 高 的 着 床 率 和 妊 娠 率 对 于 有 缺 陷 的 第 2 天 / 第 3 天 IVF-ET 周 期 是 无 法 通 过 囊 胚 培 养 和 移 植 来 补 救 的 培 养 用 于 移 植 或 者 冻 存 的 囊 胚 时, 应 严 格 控 制 实 验 室 相 关 条 件 为 了 使 扩 大 培 养 取 得 成 功, 提 供 足 够 数 量 的 培 养 箱 是 一 个 先 决 条 件 比 较 理 想 的 情 况 是, 假 如 每 周 有 5 个 取 卵 周 期 时, 实 验 室 应 有 两 台 培 养 箱 其 中 一 只 培 养 箱 用 于 胚 胎 培 养, 另 一 只 用 于 培 养 液 器 皿 的 预 平 衡 用 于 培 养 的 培 养 箱 为 减 少 开 箱 次 数, 不 应 用 于 培 养 液 的 预 平 衡 实 际 操 作 : 卵 裂 期 胚 胎 培 养 第 1 天 - 在 G-1 /G-1 PLUS 中 培 养 1 一 旦 移 除 了 颗 粒 细 胞, 后 续 的 所 有 操 作 均 应 使 用 经 过 拉 长 处 理 的 巴 斯 德 管 进 行 ( 详 见 第 62 页 Vitrolife 产 品, 移 植 针 ) 使 用 时, 可 以 用 含 有 硅 胶 软 管 的 注 射 器 连 接 到 这 种 经 拉 长 处 理 的 巴 斯 德 管 上, 以 方 便 对 吸 取 的 液 体 加 以 控 制 一 定 要 注 意, 转 移 胚 胎 时 所 使 用 移 液 管 吸 头 的 口 径 应 略 大 于 胚 胎 的 直 径, 因 为 小 口 径 的 吸 头 会 对 胚 胎 造 成 伤 害 一 般, 对 于 第 1 天 到 第 3 天 胚 胎 来 说, 采 用 μm 口 径 的 吸 头 就 可 以 了 使 用 适 当 尺 寸 的 吸 头 还 能 够 有 效 减 少 随 胚 胎 一 起 发 生 转 移 的 培 养 液 的 体 积, 通 常 胚 胎 每 个 胚 胎 进 行 转 移 时 所 携 带 的 培 养 液 的 体 积 不 应 多 于 1µL 2 去 除 卵 丘 细 胞 并 且 评 估 了 授 精 的 情 况 后, 原 核 胚 胎 移 到 单 孔 培 养 皿 上, 并 且 在 预 热 并 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 或 平 衡 过 的 G-GAMETE 中 进 行 洗 涤 操 作 时, 先 从 培 养 液 的 某 个 区 域 将 胚 胎 吸 入 移 液 管, 然 后 转 移 到 另 一 不 同 区 域 吹 出, 这 样 重 复 2-3 次 26 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

27 然 后, 胚 胎 至 少 在 培 养 皿 中 的 两 个 液 滴 中 连 续 进 行 洗 涤 洗 涤 越 充 分, 从 旧 培 养 皿 移 到 新 培 养 皿 产 生 的 风 险 就 越 少 在 培 养 液 滴 中, 残 留 的 MOPS 成 分 可 能 会 使 培 养 液 的 ph 值 降 至 正 常 值 以 下 3 把 胚 胎 置 于 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-1 /G-1 PLUS 液 滴 中 如 果 病 人 的 胚 胎 数 量 超 过 10 个, 实 验 室 应 准 备 两 个 培 养 皿 立 即 把 培 养 皿 送 回 培 养 箱 建 议 至 少 采 用 两 组 的 方 式 对 胚 胎 进 行 培 养 例 如, 如 果 患 者 的 胚 胎 数 量 为 6 个, 分 为 两 组 后 每 组 各 3 个 胚 胎, 而 不 是 一 组 4 个 另 一 组 2 个, 或 者 一 组 5 个 另 一 组 1 个 4 在 第 3 天, 胚 胎 可 在 经 过 平 衡 的 EmbryoGlue 或 者 是 经 过 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-2 或 G-2 PLUS 中 移 植 到 子 宫 内 或 者, 此 时 将 胚 胎 移 入 经 过 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 ) G-2 或 G-2 PLUS 中, 继 续 培 养 至 囊 胚 期 实 际 操 作 : 囊 胚 期 胚 胎 培 养 第 3 天 - 在 G-2 /G-2 PLUS 中 培 养 1 第 3 天 早 晨, 准 备 一 个 在 溦 滴 培 养 皿, 培 养 皿 上 标 记 好 患 者 身 份 的 编 号 用 移 液 器 ( 装 配 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 用 预 先 冲 洗 的 移 液 器 头 无 菌 针 头, 在 向 合 适 数 目 的 培 养 皿 的 微 孔 内 滴 加 入 250 μl( 已 添 加 添 加 蛋 白 的 )G-2 或 G-2 PLUS 液 滴, 立 刻 用 OVOIL 覆 封 盖 液 滴 防 止 以 防 挥 发 蒸 发 迅 速 一 次 只 能 准 备 一 个 培 养 皿 立 即 将 培 养 皿 置 于 放 入 +37 和 6% CO 2 条 件 的 培 养 箱 中 使 用 前 平 衡 的 时 间 不 应 少 于 6 小 时 注 意, 一 次 只 能 准 备 一 个 培 养 皿, 如 果 患 者 有 多 于 10 个 胚 胎 数 超 过 10 个 枚, 则 应 在 准 备 好 一 个 培 养 皿 后 再 开 始 准 备 2 第 二 个 培 养 皿 或 者 采 用 另 外 一 种 方 法 : 准 备 好 一 个 40 mm 的 培 养 皿, 在 皿 上 标 记 好 患 者 的 编 号, 然 后 用 移 液 器 ( 装 配 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 在 培 养 皿 底 制 备 若 干 个 体 积 为 50 μl 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-2 或 G-2 PLUS 液 滴, 并 立 即 封 盖 OVOIL 培 养 油 注 意, 每 次 仅 准 备 一 个 培 养 皿 为 了 使 制 备 的 液 滴 能 够 呈 球 形, 可 以 这 样 操 作 : 首 先, 用 移 液 器 ( 装 配 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 在 40 mm 的 培 养 皿 底 制 备 9 滴 体 积 为 25 µl 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-2 或 G-2 PLUS 液 滴 立 即 使 用 OVOIL 覆 盖 液 滴, 防 止 挥 发 然 后, 将 移 液 器 换 上 新 的 枪 头 ( 须 预 先 冲 洗 过 的 无 菌 枪 头 ) 并 用 ( 制 备 液 滴 所 用 ) 培 养 液 润 洗 一 下, 在 每 个 原 始 的 液 滴 上 再 添 加 25 µl 培 养 液 每 次 制 备 的 培 养 皿 数 量 不 得 超 过 一 只 这 个 方 法 可 以 让 液 滴 向 上 隆 起 呈 球 形 的 而 不 是 平 铺 的 立 即 将 培 养 皿 置 于 +37 和 6% CO 2 条 件 的 培 养 箱 中 使 用 前 须 平 衡 至 少 6 小 时 如 果 病 人 的 胚 胎 数 量 超 过 10 个, 应 制 备 两 个 培 养 皿 也 可 以 在 第 2 天 的 下 午, 制 备 囊 胚 培 养 皿, 并 且 在 6 % CO 2 和 +37 C 的 条 件 下 平 衡 过 夜 2 准 备 胚 胎 清 洗 皿 对 于 每 名 病 人, 每 10 个 胚 胎 应 制 备 一 个 预 先 加 温 并 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 或 平 衡 过 的 G-GAMETE 把 1 ml 的 G-MOPS 或 G-MOPS PLUS/G-GAMETE 加 入 中 央 培 养 皿 孔 中 把 2 ml 的 G-MOPS 或 G-MOPS PLUS/G-GAMETE 加 入 外 侧 槽 中 置 于 恒 温 台 上 待 用 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 27

28 3 为 每 个 患 者 都 准 备 一 个 胚 胎 分 类 皿 把 1 ml 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS/ G-GAMETE 加 入 中 央 培 养 皿 孔 中 把 2 ml 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS/ G-GAMETE 加 入 外 侧 槽 中 置 于 恒 温 台 上 待 用 G-MOPS 不 得 置 于 CO 2 培 养 箱 中, 但 可 置 于 密 封 的 容 器 中, 使 用 不 具 备 CO 2 的 培 养 箱 或 恒 温 试 管 架 上 预 热 4 第 3 天 早 上, 对 胚 胎 进 行 卵 裂 评 估 把 胚 胎 移 至 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-2 /G-2 PLUS 中 在 6 % CO 2 和 +37 C 的 条 件 下, 胚 胎 保 留 在 已 添 加 蛋 白 的 G-2 /G-2 PLUS 中, 直 到 在 第 5 天 早 晨 接 受 移 植 前 的 评 估 如 果 胚 胎 卵 裂 率 存 在 疑 问, 应 通 知 护 理 和 医 疗 人 员 5 在 洗 涤 培 养 皿 中 洗 涤 胚 胎 ( 该 步 骤 对 于 清 除 G-1 /G 1 PLUS 中 的 EDTA 至 关 重 要 ) 操 作 时, 先 从 培 养 液 的 某 个 区 域 将 胚 胎 吸 入 移 液 管, 然 后 转 移 到 另 一 不 同 区 域 吹 出, 这 样 重 复 2-3 次 在 洗 涤 后, 胚 胎 即 可 移 至 分 选 培 养 皿 中, 并 且 把 相 似 的 胚 胎 进 行 分 类 在 培 养 皿 中, 使 用 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-2 /G-2 PLUS 洗 涤 液 滴 进 行 冲 洗, 每 个 培 养 液 滴 中 最 多 可 以 放 置 五 个 胚 胎 立 即 把 培 养 皿 送 回 CO 2 培 养 箱 内 6 在 第 4 天, 使 用 已 添 加 蛋 白 的 G-2 /G-2 PLUS 制 备 三 个 培 养 皿 分 别 把 培 养 皿 标 上 移 植 冷 冻 和 保 留 ( 作 为 第 6 天 的 培 养 用 ) 培 养 皿 应 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 过 夜 平 衡 在 使 用 之 前, 培 养 皿 的 预 先 平 衡 时 间 不 得 短 于 6 个 小 时 ( 但 不 可 超 过 18 小 时 ) 7 应 在 平 衡 过 的 EmbryoGlue 或 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-2 /G-2 PLUS 中 进 行 移 植 在 使 用 之 前, 移 植 培 养 皿 应 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 至 少 平 衡 6 小 时 ( 但 不 可 超 过 18 小 时 ) 8 在 第 5 天, 应 当 对 胚 胎 进 行 评 估, 并 选 择 一 个 或 两 个 评 分 最 高 的 囊 胚 进 行 移 植 未 移 植 且 质 量 良 好 的 囊 胚 应 冷 冻 保 存 在 第 5 天, 如 果 胚 胎 未 形 成 囊 胚, 应 在 一 滴 新 鲜 的 平 衡 已 添 加 蛋 白 的 G-2 或 G-2 PLUS 中 培 养 24 小 时, 并 在 第 6 天 进 行 评 估 9 把 选 用 的 囊 胚 移 至 已 添 加 蛋 白 的 G-2 或 G-2 PLUS 中, 直 到 移 植 前 分 钟, 应 始 终 置 于 +37 6% CO 2 环 境 中 胚 胎 评 估 要 点 胚 胎 应 在 第 2 天 ( 授 精 后 小 时 ) 或 第 3 天 ( 授 精 后 小 时 ), 或 者 在 第 5 6 天 的 囊 胚 期 ( 授 精 后 小 时 ) 移 植 到 子 宫 28 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

29 应 尽 量 在 接 近 移 植 之 前 对 胚 胎 的 形 态 进 行 评 估 早 期 胚 胎 评 估 基 于 卵 裂 球 的 数 量 卵 裂 球 的 一 致 性 碎 片 的 形 成 和 百 分 比 卵 裂 球 的 颗 粒 出 现 情 况 以 及 卵 裂 率 有 关 囊 胚 的 评 估, 请 参 见 下 页 的 人 囊 胚 的 评 分 标 准 应 在 移 植 前, 无 论 处 于 何 种 发 育 阶 段, 都 应 将 选 取 移 植 的 胚 胎 置 于 平 衡 的 EmbryoGlue 或 者 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-2 /G-2 PLUS 中 人 类 囊 胚 的 评 分 标 准 文 献 出 处 :Gardner DK 和 Schoolcraft WB (1999) In-vitro culture of human blastocysts. in Towards Reproductive Certainty:Infertility and Genetics Beyond eds.jansen, R. and Mortimer, D. Parthenon Press, Carnforth, 第 页 要 点 评 分 系 统 基 于 囊 胚 的 形 态 外 观 评 估 其 发 育 能 力, 从 而 可 以 选 择 是 否 用 于 移 植 或 冷 冻 保 存 囊 胚 评 分 应 在 倒 置 显 微 镜 下 进 行, 且 须 保 持 生 理 ph 值 和 温 度 大 部 分 囊 胚 在 第 5 天 形 成 ( 参 见 下 页 图 示 ) 选 择 用 于 移 植 的 囊 胚 ( 最 多 两 个 ) 应 置 于 标 有 移 植 的 培 养 皿 中, 选 择 用 于 冷 冻 保 存 的 囊 胚 则 置 于 标 有 冷 冻 的 培 养 皿 中 建 议 移 植 的 囊 胚 数 量 不 超 过 一 个, 从 而 避 免 等 级 囊 胚 做 移 植 出 现 多 胎 妊 娠 的 并 发 症 优 选 达 到 3 级 或 更 高 级 的 囊 胚 优 先 选 择 评 分 最 高 的 囊 胚, 即 AA 实 际 操 作 1 囊 胚 的 评 估 结 果 由 数 字 和 字 母 组 成 数 字 1 到 6 表 示 扩 张 度 和 孵 化 状 态, 两 个 字 母 分 别 表 示 对 于 内 细 胞 团 (ICM) 和 滋 养 外 胚 层 的 评 分 2 在 解 剖 显 微 镜 上 进 行 初 步 评 估 3 囊 胚 评 估 的 第 二 步 应 在 倒 置 显 微 镜 上 进 行 对 于 等 级 达 到 3 到 6 的 囊 胚 ( 即 满 囊 胚 及 更 进 一 步 发 育 的 囊 胚 ), 就 可 以 评 估 其 内 细 胞 团 (ICM) 和 滋 养 外 胚 层 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 29

30 评 分 系 统 扩 张 度 和 孵 化 状 态 : 早 期 囊 胚 囊 胚 腔 小 于 胚 胎 体 积 的 一 半 2 囊 胚 囊 胚 腔 大 于 或 等 于 胚 胎 体 积 的 一 半 3 满 囊 胚 囊 胚 腔 完 全 填 满 了 胚 胎 4 扩 张 囊 胚 囊 胚 腔 体 积 大 于 早 期 胚 胎 体 积 且 透 明 带 逐 渐 变 薄 5 孵 化 囊 胚 滋 养 外 胚 层 开 始 通 过 透 明 带 脱 出 6 孵 化 后 囊 胚 囊 胚 腔 已 完 全 脱 离 透 明 带 内 细 胞 团 (ICM) 分 级 : A B C 结 构 紧 密, 细 胞 数 目 多 结 构 松 散, 细 胞 数 目 少 细 胞 数 量 极 少 滋 养 外 胚 层 评 级 : A B C 细 胞 数 目 多, 形 成 紧 密 结 合 的 上 皮 组 织 细 胞 数 目 少, 形 成 松 散 的 上 皮 组 织 细 胞 数 量 极 少 30 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

31 4AA 囊 胚 示 例 对 焦 点 : 内 细 胞 团 对 焦 点 : 滋 养 层 囊 胚 评 估 表 扩 张 度 / 孵 化 状 态 内 细 胞 团 滋 养 层 评 级 结 构 紧 密, 细 胞 数 目 多 结 构 松 散, 细 胞 数 目 少 3 满 囊 胚 ; 囊 胚 腔 完 全 占 据 胚 胎 细 胞 数 量 极 少 细 胞 数 目 多, 形 成 紧 密 结 合 的 上 皮 组 织 细 胞 数 目 少, 形 成 松 散 的 上 皮 组 织 A B C A B C 细 胞 数 量 极 少 4 扩 张 囊 胚 ; 囊 胚 腔 大 于 早 期 胚 胎 且 透 明 带 变 薄 5 孵 化 囊 胚 ; 滋 养 外 胚 层 开 始 通 过 透 明 带 脱 出 6 孵 化 后 囊 胚 ; 囊 胚 腔 完 全 脱 离 透 明 带 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 31

32 囊 胚 培 养 流 程 表 ( 示 例 ) 囊 胚 培 养 流 程 表 与 常 规 的 IVF 第 2/3 天 操 作 流 程 表 有 所 不 同 下 面 为 囊 胚 培 养 的 每 日 操 作 流 程 汇 总 表 我 们 建 议 您 把 该 页 公 示 给 实 验 室 的 所 有 人 员 如 果 使 用 PLUS 产 品, 则 不 需 要 添 加 蛋 白 否 则, 所 有 培 养 液 都 需 要 添 加 G-MM 或 HSA-solution, 但 EmbryoGlue G-GAMETE 和 G-RINSE 除 外 第 1 天 第 0 天 第 1 天 ( 取 卵 前 一 天 ) 根 据 常 规 的 IVF 操 作 程 序, 准 备 G-RINSE G-MOPS 和 G-IVF 用 于 取 卵 和 授 精 同 时, 也 为 ICSI 制 备 G-1 培 养 皿 如 果 使 用 G-GAMETE, 则 需 要 为 洗 涤 卵 母 细 胞 制 备 培 养 皿 在 G-IVF 中 采 集 卵 母 细 胞 和 授 精 ICSI 操 作 中, 卵 母 细 胞 在 注 射 后 应 立 即 置 于 G-1 中 下 午 稍 晚 准 备 G-1 培 养 皿, 用 于 第 1 天 使 用 为 提 取 卵 母 细 胞 制 备 G-MOPS 培 养 皿 评 估 IVF 和 ICSI 的 授 精 情 况 在 G-MOPS /G-GAMETE 中 冲 洗 并 置 于 G-1 中 进 行 培 养 第 2 天 第 3 天 第 4 天 可 选 择 的 胚 胎 评 估 评 估 胚 胎 的 卵 裂 情 况 在 下 午 早 些 时 候, 用 G-MOPS /G- GAMETE 冲 洗 胚 胎, 清 洗 培 养 皿 孔 并 移 至 G-2 中, 进 行 培 养 胚 胎 评 估 ( 可 选 项 ) 在 下 午 晚 些 时 候, 使 用 EmbryoGlue 或 G-2 制 备 培 养 皿, 用 于 移 植, 并 且 制 备 G-2 培 养 皿, 用 于 冷 冻 并 用 于 保 留 至 第 6 天 第 5 天 囊 胚 形 态 的 评 估 使 用 移 植 冷 冻 或 继 续 培 养 的 评 分 标 准 在 移 植 到 子 宫 前, 把 囊 胚 移 至 EmbryoGlue 或 新 鲜 的 G-2 中 第 6 天 囊 胚 形 态 的 评 估 使 用 移 植 或 冷 冻 的 评 分 标 准 到 第 6 天 时, 如 果 囊 胚 的 得 分 低 于 3BB, 则 冷 冻 保 存 的 效 果 不 佳 在 移 植 到 子 宫 前, 把 囊 胚 移 至 EmbryoGlue 或 新 鲜 的 G-2 中 32 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

33 胚 胎 移 植 胚 胎 移 植 (ET) 是 把 胚 胎 移 置 于 子 宫 中 的 过 程 通 常 情 况 下 经 由 子 宫 颈, 无 需 麻 醉 要 点 在 操 作 移 植 管 时, 应 穿 戴 无 菌 无 毒 无 粉 的 手 套 必 须 始 终 小 心 谨 慎, 防 止 移 植 管 尖 端 受 到 污 染 每 名 病 人 通 常 移 植 一 个 或 两 个 胚 胎 移 植 培 养 液 量 过 大 (60 μl) 以 及 移 植 管 内 气 泡 过 大 可 以 导 致 胚 胎 在 子 宫 颈 口 脱 落 或 附 着 在 移 植 管 外 侧 移 去 移 植 管 内 气 泡 可 减 少 这 些 问 题 的 发 生 因 此, 导 管 应 连 接 到 1cc 气 密 性 注 射 器, 且 导 管 中 抽 入 约 30 微 升 的 平 衡 EmbryoGlue 或 平 衡 已 添 加 蛋 白 的 G-2 /G-2 PLUS 连 续 液 柱 移 植 胚 胎 应 尽 量 靠 近 移 植 管 尖 端, 且 最 接 近 移 植 管 开 口 移 植 操 作 妇 科 医 生 实 际 操 作 1 移 植 前, 嘱 咐 患 者 部 分 充 盈 膀 胱 通 常 情 况 下 这 有 助 于 使 子 宫 处 于 较 合 适 的 易 于 插 入 柔 软 无 创 伤 性 移 植 吸 管 的 位 置 子 宫 后 位 患 者 则 需 要 排 空 膀 胱 2 应 使 用 无 毒 通 过 质 检 的 无 创 伤 一 次 性 移 植 软 管 移 植 3 建 议 在 超 声 引 导 下 实 施 胚 胎 移 植 4 病 人 摆 为 切 石 术 体 位 采 用 阴 道 扩 张 器 暴 露 宫 颈 口, 该 扩 张 器 应 使 用 添 加 抗 生 素 的 平 衡 G-RINSE 清 洗 必 要 时 使 用 无 菌 注 射 器 清 除 宫 颈 粘 液 5 建 议 在 胚 胎 移 植 时 使 用 超 声 引 导 方 法 观 察 移 植 管 通 过 子 宫 颈 管 的 过 程 插 入 试 验 导 管, 测 试 通 过 难 易 程 度 如 果 容 易 进 入, 即 可 将 胚 胎 装 载 到 移 植 管 中 进 行 移 植 操 作 如 果 较 难 进 入, 则 需 要 做 其 他 的 选 择 如 用 有 一 定 弹 性 的 套 管 引 导 移 植 管 进 入 宫 腔 无 论 使 用 何 种 方 式, 应 注 意 避 免 对 子 宫 颈 管 和 宫 腔 造 成 损 伤 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 33

34 6 胚 胎 移 植 的 操 作 人 员 应 小 心 操 作, 避 免 因 弯 曲 挤 压 或 损 伤 移 植 管 使 胚 胎 从 移 植 管 中 溢 出 7 移 植 管 应 通 过 子 宫 颈 管 并 超 过 子 宫 内 口 操 作 人 员 可 以 通 过 触 觉 反 馈 来 完 成 此 操 作 移 植 管 应 清 楚 标 记, 用 以 判 断 移 植 管 进 入 的 长 度 应 借 助 超 声 信 号 来 确 定 位 置 8 将 胚 胎 连 同 30µL 的 移 植 液 注 入 子 宫, 缓 慢 撤 回 移 植 管, 同 时 通 过 注 射 器 的 活 塞 维 持 稳 定 的 压 力 9 对 移 植 管 做 最 终 的 镜 检, 以 确 定 无 胚 胎 残 留 于 管 内 更 多 有 关 该 主 题 的 完 整 回 顾, 请 参 见 :Schoolcraft Surrey 和 Gardner (2001) Embryo transfer: techniques and variables affecting success. Fertil.Steril.76; 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

35 装 载 移 植 管 实 验 室 实 际 操 作 1 在 平 衡 过 的 EmbryoGlue 或 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-2 或 G-2 PLUS 中 进 行 胚 胎 移 植 2 在 冲 洗 过 的 中 央 孔 中 加 入 约 1 ml EmbryoGlue 3 在 冲 洗 过 的 中 央 孔 外 周 槽 中 加 入 约 2 ml EmbryoGlue 4 在 +37 C 和 6 % 的 CO 2 条 件 下, 预 先 平 衡 4 18 小 时 5 将 胚 胎 放 入 EmbryoGlue 中 预 培 养 至 少 10 分 钟 发 育 至 第 2 天 的 胚 胎 在 EmbryoGlue 中 的 放 置 时 间 时 间 不 应 超 过 30 分 钟 发 育 第 3 天 的 胚 胎 和 囊 胚 在 EmbryoGlue 中 的 时 间 不 应 超 过 2 小 时 6 用 1 ml 注 射 器 从 中 央 孔 培 养 皿 的 外 周 槽 中 抽 吸 培 养 液 冲 洗 注 射 器 并 移 除 注 射 器 内 的 气 泡 然 后 从 中 吸 入 ml 培 养 液 7 把 移 植 导 管 牢 靠 地 固 定 到 预 先 冲 洗 过 的 1 ml 无 毒 注 射 器 上 大 约 抽 取 ml 平 衡 过 的 移 植 培 养 液 冲 洗 移 植 管 8 再 用 注 射 器 从 培 养 皿 中 央 孔 中 吸 取 约 0.1 ml EmbryoGlue, 小 心 推 压 注 射 器 将 内 含 物 排 入 外 周 槽 中 直 到 剩 余 约 20 μl 为 止 9 在 显 微 镜 下, 小 心 地 将 胚 胎 和 5-10µL EmbryoGlue 吸 入 在 移 植 管 中, 然 后 在 末 端 吸 入 微 量 气 体 ( 在 尖 端 的 空 气 柱 有 利 于 尖 端 超 声 介 导 移 植 的 成 像 ) 小 心 将 移 植 管 导 入 子 宫 腔, 在 离 宫 腔 上 壁 约 1 cm 处 将 胚 胎 与 μl 培 养 液 一 同 注 入 宫 腔 内 始 终 保 持 住 注 射 器 活 塞 的 压 力 并 缓 慢 收 回 移 植 管 最 后, 对 移 植 管 进 行 镜 检, 以 确 定 管 内 无 胚 胎 残 留 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 体 外 授 精 - 胚 胎 移 植 35

36 36 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

37 显 微 操 作 显 微 操 作 包 括 ICSI( 胞 浆 内 单 精 子 注 射 ) 辅 助 孵 化 以 及 胚 胎 活 检 要 点 所 有 的 显 微 操 作 设 备 均 应 正 确 对 齐 定 位 以 保 证 最 佳 的 稳 固 性 建 议 避 免 门 电 梯 气 流 等 引 起 的 震 动, 以 及 能 引 起 干 扰 和 噪 声 的 各 种 因 素 倒 置 显 微 镜 应 配 备 经 过 准 确 校 正 的 恒 温 台 以 确 保 培 养 皿 中 液 滴 的 温 度 能 够 达 到 +37 在 操 作 过 程 中 保 持 温 度 的 稳 定 非 常 重 要 通 过 在 液 滴 上 封 盖 平 衡 过 的 培 养 油 可 以 有 效 维 持 正 常 的 渗 透 压 为 保 证 一 致 性 和 进 行 质 量 控 制, 所 有 操 作 过 程 均 应 使 用 最 高 质 量 的 无 毒 性 显 微 操 作 工 具, ( 详 见 第 62 页 Vitrolife 产 品, 显 微 注 射 针 和 固 定 针 ) Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 显 微 操 作 37

38 DENS A GIII A ICSI 操 a) 作 前 剥 卵 b) c) 进 行 ICSI 操 作 前, 卵 母 细 胞 需 除 去 卵 丘 颗 粒 细 胞 团 和 放 射 冠 此 过 程 称 为 剥 卵 此 操 作 可 以 在 大 体 积 不 封 盖 培 养 油 的 多 孔 皿 中 进 行, 也 可 在 封 盖 培 养 油 的 液 滴 中 进 行 DENS B,C,D GIII HYASE ( 透 明 质 酸 酶 ) 可 以 促 进 卵 丘 颗 粒 细 胞 团 和 放 射 冠 解 离 可 使 用 精 细 的 玻 璃 吸 管,( 详 见 第 62 页 Vitrolife 产 品, 剥 卵 针 ), 轻 轻 上 下 吸 打 卵 母 细 胞, 即 可 去 除 颗 粒 细 胞 吸 管 的 直 径 应 稍 大 于 卵 母 细 胞 的 直 径 ( 大 约 µm) 使 用 玻 璃 吸 管 时, 可 能 需 要 几 种 不 同 尺 寸 的 吸 管 吸 管 内 径 太 小 或 边 缘 不 整 齐 可 能 会 损 伤 卵 B母 细 胞 暴 露 于 HYASE 时 间 过 长 或 C 操 作 不 当 以 及 暴 露 于 低 于 生 理 ph 值 D和 温 度 条 件 下, 也 会 对 卵 母 细 胞 造 成 伤 害 处 于 胚 泡 期 的 卵 母 细 胞 特 别 敏 感 考 虑 到 上 述 原 因, 使 用 正 确 浓 度 的 HYASE 并 且 控 制 在 建 议 的 处 理 时 间 内 非 常 重 要 HYASE 为 10 倍 浓 缩 液, 使 用 前 应 使 用 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-MOPS /G- MOPS PLUS, 或 者 G-GAMETE 按 1:10 的 比 例 稀 释 a) 注 意 在 HYASE 中 的 处 理 时 间 超 过 30 秒 就 可 能 损 伤 卵 母 细 胞 PREPCULT A,B 实 际 操 作 A a) B a) 1 使 用 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 或 G-GAMETE 稀 释 HYASE 2 使 用 稀 释 的 HYASE 和 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-GAMETE 制 备 冲 洗 过 的 脱 颗 粒 培 养 皿, 用 于 冲 洗 卵 母 细 胞 b) b) 3 应 为 每 一 个 含 有 稀 释 的 HYASE 的 孔 准 备 相 应 的 4 个 清 洗 孔, 孔 中 放 入 约 1 ml 或 者 6 滴 ( 每 滴 μl)( 已 添 加 蛋 白 的 )G-MOPS /G-MOPS PLUS 或 G-GAMETE, 并 封 盖 培 养 油 ( 如 图 A,B 所 示 ) 如 果 使 用 G-MOPS /G-MOPS PLUS, 在 +37 大 气 环 境 下 平 MICRO 衡 约 15 分 A,B 钟 即 可 使 用 如 果 使 用 G-GAMETE, 培 养 皿 应 在 6% CO 2 环 境 中 平 衡 到 正 确 的 ph 值, 而 且 最 好 平 衡 过 夜 同 时, 制 备 ICSI 培 养 皿 ( 参 见 下 方 的 实 际 操 作 - 制 备 ) A f) a) b) a) b) c) d) e) c) d) A. B封 盖 培 养 油 的 液 滴 a) HYASE 溶 液 b f) 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS/G-GAMETE 洗 涤 液 滴 b) a) c) d) 38 显 微 操 作 MICRO SETUP A,B Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

39 B b) a) e) c) d) B. 5- 孔 培 养 皿 封 盖 培 养 油 或 不 封 盖 培 养 油 a) HYASE 溶 液 b e) 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS/G-GAMETE, 洗 涤 液 滴 4 使 用 大 口 径 的 吸 管,( 详 见 第 62 页 Vitrolife 产 品, 移 植 针 ), 将 3-5 枚 卵 母 细 胞 放 入 稀 释 的 HYASE 中 轻 轻 吸 打 卵 母 细 胞 卵 丘 颗 粒 细 胞 开 始 解 离 卵 母 细 胞 在 透 明 质 酸 酶 溶 液 中 处 理 的 时 间 不 应 超 过 30 秒 5 将 部 分 剥 离 的 卵 母 细 胞 移 至 第 一 冲 洗 液 中, 尽 量 少 地 携 带 透 明 质 酸 酶 溶 液 用 小 口 径 的 吸 管 ( 详 见 第 62 页 Vitrolife 产 品, 第 62 页, 剥 卵 针 ), 轻 轻 吸 打 每 一 个 卵 母 细 胞 以 除 去 放 射 冠 在 加 温 并 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 或 平 衡 过 的 G-GAMETE 中 冲 洗 卵 母 细 胞 使 用 新 培 养 皿 重 复 上 述 过 程, 直 到 所 有 卵 母 细 胞 都 脱 颗 粒 完 毕 6 通 过 观 察 卵 母 细 胞 是 否 有 极 体 ( 有 极 体 -M2; 无 极 体 -M1) 或 胚 泡 (GV) 的 存 在 与 否 来 确 定 其 成 熟 度 如 果 准 备 立 即 进 行 注 射, 将 所 有 成 熟 的 卵 母 细 胞 (M2) 置 于 准 备 好 的 ICSI 液 滴 当 中 如 果 完 成 剥 卵 过 程 的 卵 母 细 胞 在 注 射 前 需 要 孵 育 一 段 时 间, 可 将 卵 母 细 胞 置 于 ( 已 添 加 蛋 白 的 ) G-1 /G-1 PLUS 中 直 到 开 始 注 射 操 作 未 成 熟 的 卵 母 细 胞 (M1 和 GV) 应 置 于 培 养 液 中 进 一 步 孵 育 成 熟 实 际 操 作 - 制 备 1 在 +37 C 的 温 度 下, 把 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS 和 OVOIL 预 先 加 温 15 分 钟, 或 者 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 至 少 把 G-GAMETE 平 衡 至 少 4 小 时 2 从 冷 藏 室 取 出 ICSI ( 粘 性 精 子 注 射 溶 液 ) 并 且 平 衡 到 +20 ± 5 C 的 温 度 3 应 迅 速 制 备 ICSI 的 培 养 皿 把 一 滴 1 10 µl 的 ICSI 添 加 到 ICSI 培 养 皿 的 中 心 位 置, 并 添 加 6 10 µl 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS/G GAMETE 液 滴, 使 用 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 显 微 操 作 39

40 c) d) OVOIL MICRO 覆 SETUP 盖 为 了 避 A,B 免 微 液 滴 挥 发, 一 次 只 能 准 备 一 个 培 养 皿 操 作 应 当 迅 速, 所 有 需 要 的 物 品 都 应 放 在 手 边 (A, B) 每 名 病 人 制 备 两 只 培 养 皿 A 1 B a) b) 2 5 a) b) A. 选 项 1 a) 卵 母 细 胞 液 滴,1 到 6 (G-MOPS PLUS/ LOADSTRAW G-GAMETE ) CRYO 1 b) ICSI B. 选 项 2 a) 卵 母 细 胞 液 滴,1 到 6 (G-MOPS PLUS/G-GAMETE ) b) ICSI 4 如 果 使 用 G-MOPS PLUS, 则 培 养 皿 在 +37 C 的 温 度 下 至 少 加 温 15 分 钟 如 果 使 用 G-GAMETE, 则 培 养 皿 在 +37 C 和 6 % CO 2 的 条 件 下 至 少 平 衡 4 小 时 a) b) c) d) e) f) g) h) i) ICSI 操 作 流 程 a) Syringe b) Plastic tube c) Cotton plug sealing cement d) FS 2, 2cm e) Air bubble 1/4 cm ICSI 操 作 是 把 精 子 注 射 到 卵 母 细 胞 中 的 过 程 f) FS 2 + embryos, 2 3 cm g) Air bubble 1/4 ICSI 技 术 可 以 帮 助 因 男 方 具 有 严 重 不 育 症 而 无 法 cm h) FS 2, 1 cm i) Seal: plastic plug 生 育 的 夫 妇 实 现 成 功 妊 娠 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVP) 因 其 黏 性 而 常 用 于 ICSI 操 作 精 子 在 高 粘 滞 性 PVP 中 活 动 性 受 阻, 因 此 容 易 用 注 LOADSTRAW CRYO 2 射 针 捕 获 精 子, 从 而 可 以 在 显 微 注 射 前 进 行 正 确 地 制 动 并 断 尾 同 时,PVP 通 过 延 缓 注 射 液 的 速 度, 还 可 以 控 制 精 子 的 注 射 速 度 这 种 控 制 有 助 于 稳 定 显 微 操 作 流 程 并 降 低 注 入 卵 母 细 胞 中 液 体 的 体 积 所 有 这 些 因 素 都 对 显 微 操 作 的 成 功 均 有 重 要 影 响 a) b) c) d) e) f) g) h) i) 要 点 用 显 微 注 射 针 在 紧 挨 着 精 子 颈 部 下 端 的 位 置 划 过 ( 即 断 尾 ), 以 制 动 精 子 把 精 子 深 深 ( 达 到 卵 母 细 胞 直 径 的 %) 注 入 细 胞 质 中, 确 保 精 子 不 会 随 注 射 针 a) Syringe b) Plastic tube c) Cotton plug sealing cement d) BFS 2, 2cm e) Air bubble 1/4 cm 带 f) 出 BFS 来 2 + embryos, 2 3 cm g) Air bubble 1/4 cm h) BFS 2, 1 cm i) Seal: plastic plug 40 显 微 操 作 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

41 为 避 免 精 子 被 挤 到 卵 周 隙, 需 轻 轻 吸 取 少 量 胞 质 以 确 认 卵 膜 是 否 破 裂 注 入 卵 母 细 胞 的 ICSI (PVP) 应 尽 可 能 少 关 于 ICSI 显 微 注 射 针 和 固 定 针 ( 请 参 阅 第 62 页 Vitrolife 产 品 ) 实 际 操 作 1 在 ICSI 液 滴 的 中 间 放 入 少 量 (1-2 μl) 准 备 好 的 精 子 悬 液 在 恒 温 台 上 平 衡 数 分 钟 使 得 精 子 迁 移 至 液 滴 中 悬 液 的 外 围 2 用 注 射 微 管 吸 入 一 定 量 的 ICSI 以 降 低 精 子 粘 附 于 针 管 内 壁 的 风 险 3 将 剥 离 的 卵 母 细 胞 置 于 已 添 加 蛋 白 的 G-MOPS /G-MOPS PLUS/G-GAMETE 的 液 滴 中, 每 液 滴 一 个 卵 母 细 胞, 每 次 最 多 处 理 4 个 卵 母 细 胞 4 用 显 微 注 射 针 将 精 子 的 尾 部 压 断 以 制 动 精 子 在 操 作 过 程 中 不 要 损 伤 精 子 的 颈 部 区 域, 因 为 其 含 有 中 心 体 中 心 体 在 细 胞 分 裂 染 色 体 迁 移 时 非 常 重 要 无 效 的 断 尾 操 作 将 会 导 致 授 精 率 降 低 每 次 只 吸 取 单 个 制 动 的 精 子 5 移 动 培 养 皿, 使 卵 母 细 胞 液 滴 处 于 视 野 内 使 用 剥 卵 针 固 定 卵 母 细 胞, 以 供 注 射 使 卵 母 细 胞 极 体 处 于 7 点 或 1 点 钟 位 置 为 了 降 低 对 减 数 分 裂 中 形 成 的 纺 锤 体 的 损 伤 风 险, 须 在 4 点 钟 位 置 注 入 精 子 注 射 精 子, 应 尽 量 控 制 ICSI 的 液 量, 一 旦 注 射 完 成, 即 刻 停 止 显 微 注 射 针 内 液 体 的 流 动 注 意 培 养 皿 在 培 养 箱 外 放 置 的 时 间 当 操 作 人 员 不 够 熟 练 或 者 情 况 比 较 复 杂 时, 应 减 少 每 个 培 养 皿 中 准 备 的 卵 母 细 胞 的 数 量 6 当 完 成 所 有 卵 母 细 胞 的 注 射 后, 在 数 滴 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-1 /G-1 PLUS 中 冲 洗, 然 后 置 于 准 备 好 的 G-1 培 养 系 统 中 过 夜 培 养 7 在 注 射 后 第 二 天, 根 据 两 个 PN 和 两 个 极 体 的 出 现 与 否 来 评 估 卵 母 细 胞 的 授 精 情 况 未 受 精 的 退 化 的 卵 母 细 胞 以 及 多 于 2PN 或 少 于 2PN 的 卵 母 细 胞 应 终 止 培 养 评 估 完 成 后, 受 精 卵 应 用 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-1 /G-1 PLUS 冲 洗, 然 后 转 移 到 含 有 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-1 /G-1 PLUS 的 新 鲜 培 养 皿 中 培 养 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 显 微 操 作 41

42 难 度 较 高 的 ICSI 疑 难 病 例 病 例 的 难 易 程 度 主 要 取 决 于 三 种 因 素 : 操 作 人 员 设 备 精 液 样 本 操 作 人 员 的 培 训 经 验 耐 心 和 能 力 决 定 了 第 一 个 因 素 准 备 ICSI 时, 特 别 是 难 度 较 高 的 ICSI, 应 具 备 足 够 的 时 间 和 资 源 去 完 成 设 备 应 便 于 使 用, 且 能 够 提 供 稳 定 的 操 作 环 境, 从 而 使 得 操 作 人 员 能 够 集 中 精 力 解 决 在 寻 找 和 捕 获 精 子 时 遇 到 的 困 难 从 人 体 工 程 力 学 角 度 出 发 而 设 计 的 显 微 操 作 台 可 使 得 操 作 流 程 更 加 顺 畅 并 能 提 高 操 作 人 员 的 工 作 耐 久 性 精 子 样 本 有 时 候 也 会 有 一 些 问 题 例 如, 睾 丸 穿 刺 活 检 和 少 弱 畸 精 症 的 精 子 悬 液 通 常 表 现 为, 精 子 数 目 少 精 子 活 动 能 力 差 存 在 碎 片 和 其 他 细 胞 冷 冻 复 苏 的 附 睾 精 子 可 能 也 会 出 现 问 题 仅 有 一 小 部 分 精 子 存 活, 且 存 活 的 精 子 可 能 表 现 出 活 动 能 力 低 甚 至 不 活 动 ICSI 操 作 中 第 三 种 难 题 就 是 电 击 采 精 获 得 的 精 子 其 数 量 非 常 高, 活 动 能 力 却 非 常 差 此 外 还 含 有 其 他 细 胞 和 碎 片 精 子 数 量 少 活 动 能 力 差 或 者 前 向 运 动 差 使 用 SpermGrad 制 备 精 子 ( 参 见 精 子 制 备 ) 把 精 子 悬 浮 液 添 加 到 平 衡 过 并 已 添 加 蛋 白 的 G-IVF /G-IVF PLUS 液 滴 中 在 ICSI 操 作 开 始 前 将 精 子 转 移 至 ICSI 中 注 意 在 精 子 数 量 极 少 时, 不 要 使 用 梯 度 离 心, 而 是 将 精 液 样 本 在 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 ) G-IVF /G-IV F PLUS 中 清 洗, 并 在 g 离 心 10 分 钟 在 μl 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-IVF /G-IV F PLUS 中 回 溶 颗 粒 精 子, 并 尽 快 使 用 42 显 微 操 作 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

43 睾 丸 穿 刺 活 检 使 用 G-MOPS PLUS 采 集 样 本 将 组 织 样 本 转 移 至 无 菌 无 毒 性 的 培 养 皿 中, 并 将 其 分 散 成 小 块 状 将 分 散 开 的 小 块 组 织 转 移 至 小 锥 形 试 管 中 并 在 g 离 心 5 分 钟 弃 去 上 清, 并 在 G-MOPS PLUS 中 重 新 悬 浮 有 时 这 些 样 本 需 要 进 行 再 次 清 洗 将 5-10 μl 睾 丸 活 检 材 料 放 置 于 小 培 养 皿 中, 封 盖 OVOIL 培 养 油 然 后 收 集 睾 丸 精 子 并 放 入 新 鲜 G-MOPS PLUS 液 滴 中, 待 注 射 时 使 用 如 果 必 须 在 制 备 后 第 二 天 使 用, 准 备 好 的 精 子 可 在 +37 6% CO 2 条 件 下 于 ( 已 添 加 蛋 白 的 ) G-IVF /G-IVF PLUS 中 孵 育 胚 胎 活 检 胚 胎 活 检 指 将 卵 裂 球 从 胚 胎 中 取 出 并 做 种 植 前 遗 传 诊 断 (PGD) 的 过 程 要 点 胚 胎 活 检 通 常 在 胚 胎 培 养 第 3 天 的 早 上 进 行, 此 时 卵 裂 球 尚 未 开 始 致 密 化 使 用 Tyrode 酸 激 光 或 部 分 透 明 带 打 孔 的 方 法, 在 透 明 带 上 打 孔 应 使 用 单 独 的 针 管 移 取 活 检 的 卵 裂 球 ( 参 见 第 62 页 Vitrolife 产 品, 卵 裂 球 活 检 针 ) 注 意 G-PGD 为 MOPS 缓 冲 系 统, 其 操 作 方 法 十 分 类 似 于 G-MOPS ( 参 见 第 8 页 ) 切 勿 把 G-PGD 置 于 CO 2 培 养 箱 中, 而 应 在 恒 温 试 管 架 或 不 含 CO 2 的 培 养 箱 内 进 行 加 热 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 显 微 操 作 43

44 实 际 操 作 1 准 备 装 有 预 热 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-PGD 液 滴 的 培 养 皿, 并 用 OVOIL 封 盖 液 滴 2 在 数 滴 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-PGD 中 冲 洗 胚 胎 3 把 胚 胎 置 于 +37 C 的 G-PGD (MOPS 缓 冲 的, 不 含 Ca2+ 和 Mg2+) 中 4 使 用 固 定 针 固 定 胚 胎 5 在 透 明 带 上 打 孔 用 干 净 的 卵 裂 球 活 检 针 穿 入 孔 中, 轻 轻 吸 取 出 一 到 两 个 卵 裂 球 用 G-2/G-2 PLUS 充 分 清 洗 以 去 除 G-PGD, 将 胚 胎 放 入 平 衡 的 ( 已 添 加 蛋 白 的 )G-2/ G-2 PLUS 中 培 养, 直 到 胚 胎 活 检 分 析 确 认 完 成 挑 选 正 常 胚 胎 在 第 5 天 进 行 新 鲜 胚 移 植, 也 可 以 冷 冻 保 存 多 余 的 胚 胎 在 遗 传 诊 断 完 成 后, 胚 胎 移 植 通 常 在 第 5 天 进 行 胚 胎 移 植 注 意 耐 心 调 整 胚 胎 在 固 定 针 上 的 位 置, 以 便 能 清 楚 辨 认 并 取 样 有 核 卵 裂 球 如 果 已 经 开 始 致 密 化, 卵 裂 球 间 会 发 生 粘 连 而 很 难 取 样 耐 心 地 反 复 拉 动 和 移 动 针 管 使 卵 裂 球 缓 慢 分 离 若 活 检 针 边 缘 粗 糙 会 使 活 检 的 细 胞 裂 解 因 此 要 使 用 高 质 量 的 活 检 针 44 显 微 操 作 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

45 胚 胎 冷 冻 保 存 要 点 冷 冻 保 存 胚 胎 的 移 植 成 功 率 取 决 于 实 验 室 的 基 础 成 功 率 如 果 新 鲜 移 植 的 成 功 率 低, 其 冷 冻 胚 胎 的 移 植 成 功 率 也 会 受 到 影 响 冷 冻 胚 胎 的 成 功 率 还 取 决 于 保 养 良 好 且 精 确 校 准 的 冷 冻 设 备 此 外, 精 心 挑 选 发 育 形 态 良 好 的 胚 胎 进 行 移 植 也 同 样 至 关 重 要 设 备 清 单 以 下 清 单 仅 为 推 荐, 可 据 实 际 情 况 进 行 调 整 1 冷 冻 仪 : 基 于 成 本 空 用 空 间 及 维 护 和 服 务 水 平 来 考 虑 是 否 购 买 2 储 存 罐 : 实 验 室 须 配 置 单 独 储 存 人 类 胚 胎 的 容 器 传 统 方 法 是 用 液 氮 浸 没 传 染 性 疾 病 患 者 的 胚 胎 应 于 单 独 的 冷 冻 容 器 内 保 存 3 冷 冻 使 用 的 麦 管 或 塑 料 冷 冻 管 : 应 保 证 无 菌 无 毒 性 且 具 有 高 质 量 4 液 氮 (LN 2 ) 的 用 量 取 决 于 所 选 择 的 设 备 和 贮 存 系 统 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0) 胚 胎 冷 冻 保 存 45

46 冷 冻 保 存 指 在 对 细 胞 带 来 最 小 程 度 伤 害 的 前 提 下 所 进 行 的 冷 冻 和 复 苏 使 用 冷 冻 保 护 剂 的 目 的 就 是 使 细 胞 脱 水 并 降 低 在 冷 冻 时 水 分 子 的 结 晶 形 成 选 择 合 适 的 降 温 速 率 可 有 利 于 实 现 细 胞 最 大 程 度 脱 水 并 防 止 细 胞 内 冰 晶 形 成 冷 冻 保 护 剂 的 使 用 在 某 种 程 度 上 可 以 降 低 冷 冻 保 护 剂 所 致 的 高 渗 透 压 和 毒 性 损 伤 风 险 冷 冻 保 护 剂 的 选 择 是 基 于 胚 胎 的 不 同 细 胞 发 育 阶 段 的 丙 二 醇 常 用 于 卵 裂 期, 而 丙 三 醇 常 用 于 发 育 的 囊 胚 期 如 果 在 液 氮 中 存 储, 在 存 储 阶 段 并 不 会 发 生 细 胞 损 伤 冷 冻 和 复 苏 过 程 才 是 维 持 细 胞 存 活 率 高 低 的 关 键 胚 胎 先 被 置 于 含 冷 冻 保 护 剂 的 溶 液 中, 再 被 放 入 麦 管 或 冷 冻 管 内 然 后, 冷 冻 仪 以 精 确 控 制 的 速 率 降 低 这 些 容 器 周 围 的 温 度 在 达 到 冷 冻 溶 液 的 冰 点 时, 通 过 使 用 在 液 氮 内 冷 却 的 镊 子 接 触 这 些 容 器 来 诱 导 冰 晶 形 成 此 过 程 称 为 植 冰 或 冰 核 形 成 如 果 忘 记 植 冰 或 植 冰 不 充 分, 细 胞 将 会 因 为 脱 水 不 充 分 或 细 胞 内 冰 晶 形 成 而 受 到 损 伤 细 胞 外 冰 晶 的 形 成 对 于 胚 胎 的 内 脱 水 启 动 至 关 重 要 随 着 细 胞 外 非 渗 透 性 溶 质 浓 度 的 升 高 及 胚 胎 外 开 始 结 冰, 细 胞 内 水 分 外 流, 从 而 实 现 细 胞 脱 水 此 过 程 持 续 到 胚 胎 达 到 其 冰 点 如 果 冷 冻 速 度 过 快, 胚 胎 的 脱 水 将 不 够 充 分 如 果 冷 冻 后 的 胚 胎 复 苏 速 度 过 慢, 极 低 的 温 度 会 使 水 分 在 缓 慢 的 复 苏 过 程 中 在 细 胞 内 形 成 冰 晶, 这 会 对 细 胞 造 成 损 伤 复 苏 速 度 通 常 与 使 用 冷 冻 保 护 剂 的 类 型 和 到 40 为 止 的 冷 冻 速 率 相 关 如 果 胚 胎 冷 冻 为 快 速 冷 冻, 即 快 速 冷 冻 至 40, 复 苏 速 度 也 要 快, 即 立 即 置 入 +30 水 浴 (500 /min) 复 苏 如 果 为 慢 速 冷 冻, 即 慢 速 冷 冻 至 80, 复 苏 须 以 约 +10 /min 速 率 在 冷 冻 室 内 操 作 若 使 用 含 丙 三 醇 的 冷 冻 复 苏 液, 胚 胎 需 要 做 快 速 复 苏 更 多 有 关 冷 冻 保 存 操 作 的 信 息, 请 参 见 : Edgar DH, Karani J, Gook DA.Increasing dehydration of human cleavage-stage embryos prior to slow cooling significantly increases cryosurvival.reprod Biomed Online.2009 Oct;19(4):521-5 Gardner DK, Maybach J, Lane M (2001) Hyaluronan and RHSA increase blastocyst cryosurvival.proc 17th World Congress on Fertility and Sterility, Melbourne. pp 226 Lane et al (2003) Cryo-survival and development of bovine blastocysts are enhanced by culture with recombinant albumin and hyaluronan.mol Reprod Dev 64:70 78 Gardner DK et al (2003) Changing the start temperature and cooling rate in a slowfreezing protocol increases human blastocyst viability.fertil and Steril 79 (2): 胚 胎 冷 冻 保 存 Vitrolife G-Series 操 作 指 南 ( 版 本 7.0)

47 A f) a) b) a) b) 卵 裂 e) 期 胚 胎 冷 冻 保 存 c) - 全 新 慢 速 冷 冻 复 苏 液 Freezekit d) Cleave 和 Thawkit Cleave B 此 种 低 温 保 存 的 方 法 适 用 于 卵 b) 母 细 胞 原 核 期 卵 母 细 胞 至 8- 细 胞 胚 胎 a) 胚 胎 冷 冻 程 序 d) c) FreezeKit Cleave 包 括 两 种 溶 液, 用 于 冷 冻 原 核 期 卵 母 细 胞 和 卵 裂 期 胚 胎 冷 冻 液 含 有 MOPS 缓 冲 体 系 和 人 血 清 白 蛋 白 Equilibration solution 平 衡 液,ES, 不 含 有 冷 冻 保 护 剂 Freezing MICRO solution SETUP 冷 冻 A,B 液,FS, 含 有 1,2 - 丙 二 醇 和 蔗 糖, 用 作 细 胞 脱 水 的 冷 冻 保 护 剂 要 点 A B 由 于 复 苏 存 活 率 与 胚 胎 的 初 a) 始 质 量 密 切 相 关, 因 此 要 选 择 较 高 质 量 的 胚 胎 进 行 a) 冷 冻 保 存 2 在 开 始 操 作 前 应 核 对 患 者 身 份 并 做 好 记 录 准 备 b) 5 实 际 操 作 c) d) 标 记 培 养 皿 和 麦 管 每 个 培 养 皿 中 分 别 加 入 适 当 体 积 ( ml) 的 ES 和 FS 2 平 衡 到 室 温 为 了 避 免 冷 冻 液 被 稀 释, 请 在 转 移 胚 胎 时 尽 可 能 少 地 携 带 液 体 LOADSTRAW CRYO 1 3 在 ES 中 冲 洗 待 冷 冻 的 胚 胎 胚 胎 可 于 ES 中 放 置 10 分 钟 4 把 胚 胎 移 至 FS 中 并 放 置 10 分 钟 放 入 FS 后 可 以 马 上 开 始 装 载 麦 管 胚 胎 在 FS 中 的 总 放 置 时 间 为 10 分 钟 根 据 制 造 商 的 建 议 或 下 述 要 求 装 载 麦 管 a) b) c) d) e) f) g) h) i) b) a) 注 Syringe 射 器 b) Plastic tube c) Cotton f) plug FS + sealing 胚 胎, 2 3 cement cm d) FS 2, 2cm e) Air bubble 1/4 cm b) f) 塑 FS 料 2 管 + embryos, 2 3 cm g) Air bubble g) 空 1/4 气 柱 cm 1/4 h) cmfs 2, 1 cm i) Seal: plastic plug c) 棉 塞 密 封 粘 结 剂 h) FS, 1 cm d) FS, 2cm i) 封 口 : 塑 料 塞 e) 空 气 柱 1/4 cm 5 在 LOADSTRAW 室 温 下 把 麦 管 放 置 CRYO 到 冷 冻 机 2 里, 启 动 冷 冻 程 序 a) b) c) d) e) f) g) h) i) a) Syringe b) Plastic tube c) Cotton plug sealing cement d) BFS 2, 2cm e) Air bubble 1/4 cm Vitrolife G-Series f) BFS 操 2 作 + 指 embryos, 南 ( 版 本 ) cm g) Air bubble 1/4 cm h) BFS 2, 1 cm i) Seal: plastic 胚 胎 冷 plug 冻 保 存 47