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1 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 項 千 芸 a 侯 庭 鏞 b 陳 兆 群 c 羅 欣 宜 b 吳 世 祿 a 陳 清 助 d a 中 國 醫 藥 大 學 醫 學 系 b 中 國 醫 藥 大 學 中 醫 所 c 中 國 醫 藥 大 學 中 藥 所 d 中 國 醫 藥 大 學 附 設 醫 院 新 陳 代 謝 科 摘 要 苦 瓜 (Momordica charantia L.) 為 中 草 藥, 亦 是 民 眾 日 常 食 用 之 蔬 果 在 現 代 生 物 性 療 效 方 面, 苦 瓜 具 有 治 療 糖 尿 病 及 其 相 關 併 發 症 ( 神 經 系 統 的 損 傷 白 內 障 ) 的 功 效, 也 具 有 抗 菌 抗 病 毒 抗 腫 瘤 節 育 抗 胃 潰 瘍 抗 瘧 治 療 亁 癬 抗 發 炎 和 抗 氧 化 等 活 性, 其 中 以 苦 瓜 萃 取 物 調 整 血 糖 或 應 用 在 治 療 糖 尿 病 及 其 併 發 症 方 面 最 為 顯 著, 但 其 活 性 成 分, 尤 其 是 活 性 蛋 白 質 與 相 關 作 用 機 轉 尚 未 完 全 釐 清 目 前 我 們 已 完 成 苦 瓜 不 同 品 種 萃 取 製 程 蛋 白 萃 取 液 調 整 血 糖 之 最 適 化 研 究, 證 實 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 具 有 調 整 血 糖 功 效, 也 利 用 區 隔 性 分 離 方 式, 驗 證 調 整 血 糖 之 最 佳 分 子 量 區 間 苦 瓜 蛋 白 及 可 能 之 活 性 物 質 進 一 步 應 用 蛋 白 質 體 學 技 術 分 析 具 調 整 血 糖 功 能 苦 瓜 萃 取 液 蛋 白 質 之 組 成 成 分, 並 探 究 苦 瓜 萃 取 液 調 整 血 糖 機 轉, 以 完 成 化 學 組 成 固 定 生 物 反 應 明 確 無 生 物 安 全 性 顧 慮 之 苦 瓜 調 整 血 糖 保 健 產 品 之 開 發 由 本 研 究 的 執 行, 預 期 可 確 定 苦 瓜 調 整 血 糖 的 功 效, 進 一 步 分 析 其 有 效 機 轉 及 組 成 份, 未 來 應 可 發 展 為 治 療 或 輔 助 糖 尿 病 治 療 的 中 草 藥 保 健 食 品, 甚 至 是 導 引 糖 尿 病 之 新 藥 開 發 關 鍵 詞 : 苦 瓜, 調 整 血 糖, 保 健 產 品, 蛋 白 質 體 學
2 90 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 前 言 開 發 具 調 整 血 糖 活 性 之 中 醫 藥 新 藥 的 系 列 產 品, 建 立 跨 國 性 具 產 業 應 用 性 之 智 慧 財 產, 是 輔 助 生 技 產 業 開 發 之 重 要 項 目 調 整 血 糖 製 劑 在 市 場 規 模 與 範 圍 之 預 估 方 面, 根 據 WHO 的 相 關 統 計 顯 示, 糖 尿 病 病 患 的 人 口 總 數 一 直 呈 現 驚 人 的 成 長, 從 1985 年 的 3 千 萬 人 1995 年 的 1 億 3 千 5 百 萬 人, 到 今 日 全 球 糖 尿 患 者 總 數 已 超 過 1 億 7 千 7 百 萬 人, 而 WHO 更 進 ㄧ 步 指 出, 到 2030 年 時, 全 球 罹 患 糖 尿 病 的 總 人 口 將 爆 破 3 億 3 千 6 百 萬 人 此 外, 糖 尿 病 相 關 疾 病 所 造 成 的 死 亡 人 數, 已 佔 全 球 每 年 死 亡 總 人 數 的 5% 左 右, 而 且 WHO 警 告 若 各 國 再 不 積 極 的 預 防 及 治 療 糖 尿 病 及 其 相 關 疾 病, 未 來 10 年 可 預 期 因 糖 尿 病 相 關 疾 病 所 造 成 死 亡 的 總 人 數 將 再 激 增 一 倍 ( 在 與 糖 尿 病 直 接 相 關 的 醫 療 費 用 統 計 方 面, 糖 尿 病 的 每 年 醫 療 費 用 幾 乎 佔 各 國 健 康 衛 生 相 關 預 算 總 額 的 2.5% 到 15% 反 觀 國 內 健 保 用 在 糖 尿 病 的 醫 療 費 用 方 面,90 年 時 約 271 億 元,91 年 健 保 糖 尿 病 人 醫 療 費 用 約 317 億 元, 年 增 率 約 17%, 所 以 糖 尿 病 在 國 內 亦 是 影 響 健 保 支 出 的 重 要 因 素 如 果 開 發 具 調 整 血 糖 活 性 之 中 醫 藥 新 藥 的 系 列 產 品, 一 方 面 可 提 高 台 灣 中 醫 之 能 見 度, 另 一 方 面 可 以 降 低 健 保 的 負 擔 而 且 台 灣 目 前 市 售 調 整 血 糖 的 保 健 產 品, 多 為 未 經 醫 師 處 方 的 中 草 藥 相 關 產 品 民 間 偏 方 或 傳 銷 商 品, 其 產 品 多 未 經 研 究 證 實 其 療 效, 在 製 程 上 是 否 經 有 GMP 認 可 亦 不 清 楚, 民 眾 服 用 後 其 效 果 堪 慮, 若 有 進 ㄧ 步 問 題 發 生, 又 多 增 健 保 醫 療 費 用 等 社 會 成 本 的 支 出 所 以 如 能 開 發 出 療 效 明 確 的 具 調 整 血 糖 活 性 之 中 醫 藥 新 藥 的 序 列 產 品, 應 能 降 低 相 關 事 件 的 發 生, 亦 能 增 進 國 民 的 健 康 糖 尿 病 是 重 要 的 慢 性 病 之 一, 主 要 可 分 為 胰 島 素 依 賴 型 與 非 胰 島 素 依 賴 型 糖 尿 病 胰 島 素 依 賴 型 的 糖 尿 病 病 人, 其 胰 臟 無 法 生 產 胰 島 素, 又 稱 做 第 一 型 糖 尿 病 非 胰 島 素 依 賴 型 糖 尿 病 病 人 則 是 胰 島 素 分 泌 不 足 或 對 胰 島 素 產 生 耐 受 性 所 導 致, 又 稱 做 第 二 型 糖 尿 病 無 論 第 一 型 糖 尿 病 或 第 二 型 糖 尿 病, 人 體 皆 會 有 高 血 糖 的 病 徵, 或 是 長 時 間 處 於 高 血 糖 的 體 液 環 境 中, 體 內 滲 透 壓 過 高, 容 易 造 成 人 體 神 經 系 統 的 持 續 傷 害, 以 及 讓 整 個 血 液 循 環 系 統 壓 力 變 大, 導 致 日 後 神 經 與 血 管 的 病 變 產 生 然 而, 對 於 糖 尿 病 致 病 機 轉 的 研 究 中, 也 發 現 有 許 多 訊 息 傳 遞 路 徑 與 葡 萄 糖 的 代 謝 相 關, 例 如, 葡 萄 糖 的 代 謝 特 定 器 官 對 葡 萄 糖 的 攝 取 路 徑 等 近 年, 除 了 從 insulin receptor 或 是 glucose transporters 的 研 究 方 向 去 研 究 糖 尿 病 的 治 療 外, 目
3 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 91 前 認 為 轉 錄 因 子 peroxisome proliferator-activated receptors(ppar) 是 治 療 的 新 標 的 物 (Rosenson, 2007), 此 外 已 有 文 獻 報 告 指 出 一 些 自 然 界 作 物 在 治 療 或 改 善 糖 尿 病 的 主 題 中 慢 慢 嶄 露 頭 角 (Iwashima et al., 2001; Storling et al., 2005; Zhao et al., 2005a), 這 些 觀 念 也 逐 漸 被 用 來 作 為 治 療 糖 尿 病 體 內 試 驗 的 重 要 發 展 方 向 因 此 由 insulin receptor, 到 PPAR 相 關 基 因 及 glucose transporters, 已 成 為 糖 尿 病 及 其 藥 物 研 發 一 主 要 路 徑 由 上 述 觀 點 轉 換 成 研 究 平 台, 在 體 外 試 驗 部 份, 對 於 胰 島 素 耐 受 性 所 導 致 脂 肪 傷 害 的 研 究 中, 以 細 胞 株 murine 3T3-L1 cells(karalee et al., 2001) 與 GLUT4(Maddux et al., 2001) 做 為 glucose uptake 機 轉 探 究 的 基 礎 脂 肪 組 織 過 多 的 形 成 堆 積, 與 肥 胖 第 二 型 糖 尿 病 有 著 密 切 關 係, 且 會 進 一 步 導 致 脂 肪 中 毒 產 生 造 成 細 胞 傷 害, 使 細 胞 內 脂 肪 細 胞 對 胰 島 素 產 生 耐 受 性 (Lelliott and Vidal-Puig, 2004) 若 細 胞 對 胰 島 素 產 生 耐 受 性, 則 會 於 脂 肪 細 胞 以 及 平 滑 肌 中 形 成 高 血 糖 的 狀 態 ; 然 而, 由 不 同 部 位 產 生 之 脂 肪 細 胞 被 傷 害 後, 也 會 產 生 不 同 的 生 理 或 病 理 的 機 制 反 應 在 體 內 動 物 實 驗 部 份, 囓 齒 類 動 物 是 最 佳 的 實 驗 動 物 種 類, 也 有 學 者 將 老 鼠 的 基 因 做 修 飾 後, 成 為 knockout 的 小 鼠 或 是 基 因 轉 殖 鼠, 藉 此 進 一 步 研 究 對 糖 尿 病 的 影 響 機 轉 (Rees and Alcolado, 2005; Masiello, 2006) 糖 尿 病 的 誘 因 可 以 藉 由 藥 物 的 不 當 使 用 意 外 傷 害 或 是 基 因 遺 傳 層 面 上, 導 致 不 同 動 物 糖 尿 病 的 發 生 在 1996 到 2006 年 之 間, 許 多 民 族 重 要 天 然 物 治 療 糖 尿 病 的 研 究 文 獻 投 稿 於 Journal of Ethnopharmacology 中, 多 利 用 此 實 驗 模 式, 其 中,Streptozotocin(STZ) 以 及 alloxan 誘 發 糖 尿 病 動 物 模 式 居 多, 各 有 69% 與 31% 的 出 現 率, 其 會 誘 發 高 血 糖 產 生, 但 與 人 糖 尿 病 病 程 差 異 度 較 大 至 於 knockout 的 小 鼠 或 是 基 因 轉 殖 鼠 中, 以 ob/ob mouse 最 廣 為 被 使 用 Ob/Ob mouse, 其 血 糖 值 能 夠 維 持 在 euglycemia ( mg/dl ) 以 及 持 續 補 償 對 胰 臟 ß-cell 反 應 的 狀 態, 保 持 在 高 胰 島 素 血 症 的 情 況 下 與 胰 島 素 耐 受 性 相 抗 衡 著 Ob/Ob mouse 模 式 中, 胰 島 素 的 耐 受 性 大 多 是 由 於 過 度 肥 胖 高 血 脂 以 及 高 血 糖 所 引 起, 上 述 這 些 症 狀 也 同 時 能 夠 在 第 二 型 糖 尿 病 病 人 中 被 發 現 傳 統 對 於 糖 尿 病 的 治 療, 現 代 藥 物 的 使 用 率 較 中 草 藥 來 的 廣 泛, 也 因 為 不 同 的 現 代 藥 物 在 使 用 上 有 藥 物 副 作 用 的 堪 慮,Li et al.(2004) 多 次 評 論 在 臨 床 上 常 用 來 治 療 糖 尿 病 的 傳 統 中 草 藥 處 方, 或 者 是 治 療 由 糖 尿 病 所 引 起 的 其 他 併 發 症 等, 發 現 中 草 藥 在 對 於 糖 尿 病 及 其 相 關 的 預 防 治 療 上 有
4 92 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 加 重 的 趨 勢 因 此, 我 們 將 這 些 在 文 獻 中 已 有 使 用 的 中 草 藥 重 新 統 整, 其 中 也 有 已 找 到 其 生 物 活 性 成 分 的 天 然 化 合 物 (Chen, 1987; Wu and Li, 1992; Gu and Jiang, 1997; Yin and Chen, 2000), 這 些 具 備 活 性 成 分 的 構 造 包 含 polysaccharides terpenoids flavonoids sterols alkaloids 及 其 他 等 上 述 已 發 表 的 天 然 化 合 物 中, 由 於 polypeptides 類 成 分 的 研 究 甚 少, 及 由 insulin receptor, 到 PPAR 相 關 基 因 及 glucose transporters 之 糖 尿 病 藥 物 研 發 路 徑 判 讀,polypeptides 類 成 分 較 有 可 能 在 上 游 產 生 效 果 因 此 研 究 調 節 血 糖 相 關 polypeptides, 應 較 具 有 新 穎 性 與 可 專 利 性, 未 來 進 一 步 希 望 發 展 成 新 藥 開 發 的 新 標 的, 以 及 用 在 臨 床 上 治 療 糖 尿 病 的 新 契 機 苦 瓜 是 葫 蘆 科 Momordica charantia L. 的 果 實, 廣 泛 分 布 於 亞 洲 亞 馬 遜 河 流 域 東 非 等 地, 因 此 許 多 民 族 經 常 把 苦 瓜 列 入 傳 統 藥 物 之 一, 用 於 治 療 及 預 防 一 些 慢 性 疾 病, 如 糖 尿 病 經 痛 痛 風 濕 疹 節 育 墮 胎 腎 結 石 肺 炎 亁 癬 等 方 面 在 台 灣, 苦 瓜 同 時 也 是 一 般 民 眾 經 常 食 用 的 蔬 果 之 一, 而 在 中 醫 藥 重 要 的 典 籍 中 亦 有 記 載, 如 本 草 綱 目 中 認 為 苦 瓜 有 苦 寒 無 毒 除 邪 熱 解 勞 乏 清 心 明 目 " 等 功 效 在 現 代 生 物 性 療 效 方 面, 苦 瓜 也 有 近 百 篇 的 相 關 文 獻, 其 中 主 要 有 針 對 幾 個 方 向, 如 治 療 糖 尿 病 及 其 相 關 的 併 發 症 ( 神 經 系 統 的 損 傷 白 內 障 ) 抗 菌 抗 病 毒 (HIV HSV) 抗 腫 瘤 節 育 抗 胃 潰 瘍 抗 瘧 治 療 亁 癬 抗 發 炎 和 抗 氧 化 等 活 性 (Grover and Yadav, 2004), 而 其 中 以 苦 瓜 萃 取 物 調 整 血 糖 或 應 用 在 糖 尿 病 及 其 併 發 症 最 為 顯 著, 但 這 些 研 究 多 偏 重 在 動 物 實 驗, 少 有 苦 瓜 調 整 血 糖 之 相 關 機 制 及 其 功 能 性 成 分 之 研 究 目 前 有 關 苦 瓜 在 糖 尿 病 方 面 的 研 究 有 降 低 正 常 動 物 血 糖 (Bailey et al., 1985; Day et al., 1990; Shibib et al., 1993; Ali et al., 1993; Cakici et al., 1994; Sarkar et al., 1996; Jayasooriya et al., 2000) 抗 alloxan 及 streptozotocin 所 誘 發 的 高 血 糖 (Akhtar, 1982; Karunanayake et al., 1984; Singh et al., 1989; Pari et al., 2001; Rathi et al., 2002a; Kar et al., 2003; Kedar and Chakrabarti, 1982; Bailey et al., 1985;Day et al., 1990; Karunanayake et al., 1990; Higashino et al., 1992; Shibib et al., 1993; Sarkar et al., 1996; Ahmed et al., 1998; Ahmed et al., 2001; Sitasawad et al., 2000; Grover et al., 2002; Rathi et al., 2002) 增 加 胰 臟 功 能 而 達 到 降 血 糖 的 作 用 (Day et al., 1990; Sarkar et al., 1996) 增 加 beta cells 的 數 目 (Ahmed et al., 1998) 促 進 胰 島 素 分 泌 及 胰 島 素 樣 作 用 (Welihinda et al.,1986; Higashino et al., 1992) 抑 制 糖 尿 病 大 鼠 肝 中
5 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 93 hexokinase, glucokinase, phosphofructokinase 及 受 質 glucose-6-phosphate 的 活 性 (Rathi et al., 2002) 等 而 根 據 相 關 研 究 指 出, 苦 瓜 的 化 學 成 分 有 皂 苷 生 物 鹼 三 萜 固 醇 及 蛋 白 質 等 成 分, 其 中 固 醇 類 皂 苷 化 合 物, 如 charantins, 及 一 些 蛋 白 質 成 分 被 認 為 具 有 降 血 糖 的 活 性 (Raman and Lau, 1996) 在 許 多 種 類 的 植 物 中, 皂 苷 類 成 分 的 降 血 糖 活 性 已 有 許 多 相 關 研 究, 甚 至 已 有 文 獻 研 究 該 類 成 分 結 構 與 降 血 糖 活 性 之 關 係 (Matsuda et al., 1998) 但 是 相 對 於 其 他 植 物 成 分 的 研 究, 苦 瓜 中 已 分 離 出 具 降 血 糖 活 性 的 蛋 白 質 成 分, 在 糖 尿 病 動 物 模 式 的 研 究 相 對 較 少, 且 也 缺 乏 進 ㄧ 步 的 分 子 機 轉 的 研 究, 因 此 我 們 希 望 鎖 定 小 分 子 量 的 蛋 白 質, 設 立 萃 取 小 分 子 量 蛋 白 質 的 萃 取 製 程, 以 進 一 步 針 對 苦 瓜 機 能 性 蛋 白 質 進 行 深 入 的 研 究 機 能 性 食 品 必 須 具 備 含 有 已 被 闡 明 化 學 結 構 的 功 能 因 子 且 功 能 因 子 在 食 品 中 穩 定 存 在 等 要 件, 而 苦 瓜 中 負 責 調 整 血 糖 的 功 能 因 子 尚 需 進 一 步 之 研 究, 因 此, 實 驗 室 擬 由 已 建 立 之 調 整 血 糖 分 析 系 統, 對 台 灣 省 產 之 各 苦 瓜 品 種 進 行 評 估, 並 以 胰 島 素 信 息 傳 導 路 徑 分 析 其 調 節 血 糖 之 相 關 機 轉 進 一 步 再 經 由 不 同 萃 取 方 法 搭 配 分 析 化 學 及 蛋 白 質 體 學 技 術 等 方 法, 搜 尋 苦 瓜 中 功 能 性 成 分 及 其 對 胰 島 素 信 息 傳 導 的 影 響 經 由 本 研 究 的 執 行, 預 期 可 發 現 苦 瓜 中 的 功 能 性 成 分, 未 來 應 可 進 一 步 發 展 為 治 療 或 輔 助 糖 尿 病 治 療 的 中 草 藥 保 健 食 品 內 容 苦 瓜 為 中 草 藥, 本 草 綱 目 中 認 為 苦 瓜 有 苦 寒 無 毒 除 邪 熱 解 勞 乏 清 心 明 目 " 等 功 效, 而 其 中 以 苦 瓜 萃 取 物 調 整 血 糖 或 應 用 在 治 療 糖 尿 病 及 其 併 發 症 方 面 最 為 顯 著, 但 這 些 研 究 多 偏 重 在 動 物 實 驗, 少 有 苦 瓜 調 整 血 糖 之 相 關 機 制 及 其 功 能 性 成 分 之 研 究 一 般 而 言, 機 能 性 食 品 必 須 具 備 含 有 已 被 闡 明 化 學 結 構 的 功 能 因 子 且 功 能 因 子 在 食 品 中 穩 定 存 在 等 要 件, 而 苦 瓜 中 負 責 調 整 血 糖 的 功 能 因 子 尚 需 進 一 步 之 研 究 因 此, 實 驗 室 已 建 立 之 調 整 血 糖 的 動 物 模 式, 已 確 定 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 具 調 整 血 糖 功 效, 進 一 步 也 利 用 區 隔 性 分 離 方 式 驗 證 調 整 血 糖 之 最 佳 分 子 量 區 間 苦 瓜 蛋 白 目 前 已 建 立 超 音 波 震 盪 透 析 分 子 量 及 等 電 點 分 離 等 不 同 苦 瓜 特 定 品 種 萃 取 製 程, 已 確 定 特 定 品 種 苦 瓜 之 萃 取 液 在 動 物 試 驗 中 具 調 整 血 糖 功 效 因 從 上 述 Khanna 等 人 的 研 究 中 發 現 苦 瓜 調 整 血 糖 的 功 能 性 蛋 白 主 要
6 94 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 為 小 分 子 量 的 蛋 白 質, 為 了 快 速 分 析 出 苦 瓜 中 功 能 性 蛋 白 質 之 類 型, 我 們 分 別 以 熱 水 水 甲 醇 乙 醇 酸 性 乙 醇 等 溶 媒 萃 取 不 同 極 性 的 蛋 白 質 成 分, 並 將 各 種 苦 瓜 的 不 同 部 位 直 接 均 質 後 萃 取 蛋 白 質 成 分, 再 以 SDS-PAGE 分 析 其 小 分 子 量 蛋 白 質 所 佔 之 比 例 和 比 較 各 品 種 苦 瓜 蛋 白 質 之 差 異, 以 找 出 萃 取 苦 瓜 小 分 子 量 蛋 白 質 最 有 效 的 方 法 進 一 步 搭 配 凝 膠 層 析 (gel filtration) 等 方 法, 製 備 苦 瓜 可 能 調 整 血 糖 之 區 隔 性 成 分 本 項 研 究 中 主 要 以 活 性 分 析 平 台 及 動 物 模 式 交 叉 實 驗, 引 導 苦 瓜 活 性 蛋 白 的 萃 取 與 純 化 策 略 調 整 血 糖 動 物 模 式 之 建 立 根 據 Day 等 人 的 方 法, 建 立 正 常 動 物 降 血 糖 模 式 動 物 模 式 是 以 8 週 齡 體 重 20±1 公 克 的 雌 性 BALB/c 小 鼠 為 實 驗 動 物, 在 禁 食 18 小 時 後, 分 別 以 口 服 或 腹 腔 注 射 方 式 給 予 高 濃 度 的 葡 萄 糖 溶 液 (2g/kg 體 重 ) 經 實 驗 證 實 葡 萄 糖 溶 液 以 腹 腔 注 射 的 方 式 給 予 小 鼠, 可 以 使 小 鼠 維 持 穩 定 的 高 血 糖 狀 態 ( 左 圖 ) 而 以 腹 腔 注 射 葡 萄 糖 溶 液 (0.5~4 g/kg 體 重 ) 進 行 劑 量 反 應 的 測 試, 發 現 血 糖 濃 度 會 隨 著 葡 萄 糖 注 射 濃 度 的 上 升 而 增 加, 在 腹 腔 注 射 30 分 鐘 後, 血 糖 濃 度 會 達 到 高 峰, 而 2 小 時 後, 血 糖 濃 度 會 下 降 成 背 景 值 ( 右 圖 ) 因 此 我 們 利 用 每 公 斤 體 重 4 公 克 的 葡 萄 糖 濃 度 腹 腔 注 射 的 條 件, 進 行 後 續 苦 瓜 萃 取 液 調 整 血 糖 的 實 驗 目 前 已 確 定 至 少 一 種 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 (MCSE) 調 整 血 糖 的 效 果 將 不 同 濃 度 的 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 以 口 服 方 式 的 方 式 投 與 小 白 鼠, 再 注 射 葡 萄 糖 溶 液 (4g/kg 體 重 ) 後, 檢 測 其 血 糖 的 變 化 結 果 顯 示, 血 糖 濃 度 隨 著 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 濃 度 的 增 加 而 下 降, 而 於 2 小 時 後, 血 糖 濃 度 會 下 降 成 背 景 值, 證 明 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 確 實 具 有 調
7 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 95 整 血 糖 的 功 能 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 之 療 效 進 一 步 以 糖 尿 病 動 物 模 式 分 析 其 療 效, 糖 尿 病 有 許 多 動 物 模 式, 因 本 研 究 希 望 以 第 二 型 糖 尿 病 為 主 要 之 標 的, 因 此 經 由 本 研 究 團 隊 過 去 之 經 驗, 選 擇 果 糖 誘 導 的 胰 島 素 耐 受 型 Sprague-Dawley(SD) 大 鼠 糖 尿 病 模 式, 進 行 苦 瓜 蛋 白 質 萃 取 液 在 調 整 血 糖 方 面 療 效 的 活 性 評 估 (Chen et al., 2001) 依 照 本 團 隊 過 去 的 研 究 顯 示, 高 果 糖 飲 食 組 的 胰 島 素 及 游 離 脂 肪 酸 含 量 約 為 正 常 組 的 兩 倍, 而 在 三 酸 甘 油 脂 方 面 則 約 為 2.5 倍, 在 陽 性 對 照 組 方 面 則 降 回 背 景 值 左 右 故 本 實 驗 以 g SD 大 鼠, 分 別 給 予 正 常 與 高 果 糖 的 飲 食 連 續 6 週 陽 性 對 照 組 與 苦 瓜 組 則 分 別 在 高 果 糖 飲 食 中 同 時 給 予 troglitazone 和 苦 瓜 蛋 白 萃 取 液 或 其 功 能 性 成 分 進 行 治 療, 最 後 再 測 定 其 血 壓 胰 島 素 游 離 脂 肪 酸 三 酸 甘 油 脂 等 相 關 生 化 數 值 之 改 變 除 了 SD 大 鼠 糖 尿 病 模 式 外, 另 有 其 它 胰 島 素 非 依 賴 型 糖 尿 病 動 物 模 式, 以 雙 重 驗 證 苦 瓜 蛋 白 質 萃 取 液 調 整 血 糖 的 活 性 (Luo et al., 1998; Apweiler and Freund, 1993; Chen and Wang, 2005; Rees and Alcolado, 2005) 動 物 模 式 的 建 立 方 法 如 下.. 以 3 週 週 齡 的 C57BL/6J 小 鼠, 分 別 給 予 正 常 與 高 脂 肪 (35.5% 脂 肪 ) 的 飼 料 3 週 後, 再 以 STZ 100mg/kg 誘 發 糖 尿 病, 對 照 組 則 注 射 等 體 積 之 溶 媒 (0.05 M citric acid, ph4.5), 持 續 給 予 相 同 之 飲 食 在 STZ 注 射 後 的 適 當 時 間 給 予 不 同 的 苦 瓜 蛋 白 萃 取 液 治 療 及 抽 血 檢 測 其 血 糖 之 變 化, 陽 性 對 照 組 則 投 予 tolbutamide(200 mg/kg) 進 行 治 療 STZ 注 射 後 的 第 31 天 將 小 鼠 犧 牲 採 集 其 血 液 與 相 關 組 織, 進 行 血 糖 組 織 切 片 與 糖 尿 病 控 制 相 關 機 轉 之 檢 測 以 6~7 週 的 Obese(fa/fa) Zucker 大 鼠 正 常 飼 養 12 週, 待 其 自 行 產 生 胰 島 素 耐 受 性 及 高 血 糖 等 糖 尿 病 症 狀 後, 再 給 與 藥 物 治 療 並 觀 察 相 關 生 化 數 值 的 變 化 本 實 驗 以 上 述 動 物 模 式 為 基 礎, 將 測 試 不 同 苦 瓜 萃 取 液 在 不 同 動 物 模 式 交 叉 實 驗, 以 引 導 較 高 療 效, 較 低 成 本 之 調 整 血 糖 保 健 產 品 之 開 發 應 用 蛋 白 質 體 學 技 術, 搜 尋 具 調 整 血 糖 功 能 苦 瓜 萃 取 液 中 蛋 白 質 組 成 成 分, 利 用 苦 瓜 可 能 調 整 血 糖 之 區 隔 性 成 分 為 基 礎, 以 2D-PAGE-MS 進 行 其 組 成 蛋 白 質 成 分 之 鑑 定 與 分 析 簡 述 如 下 : 將 製 備 好 的 苦 瓜 各 部 位 樣 品, 先 以 二 維 凝 膠 電 泳 分 析, 再 以 影 像 成 像 系 統 擷 取 並 分 析 其 結 果 之 後, 切 下 欲 檢 測 蛋 白 質 的 點 並 消 化 後, 再 以 質 譜 儀 進 行 序 列 分 析, 最 後 將 胺 基 酸 序 列 利 用 蛋 白 質 資 料 庫 進 行 搜 尋 比 對 蛋 白 質 序 列 比 對 資 料 經 生 物 資 訊 學 工 具
8 96 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 分 析, 歸 類 其 蛋 白 質 家 族, 推 測 可 能 功 能 後, 進 一 步 分 析 基 因 啟 動 子 上 轉 錄 因 子 結 合 位 的 種 類, 研 究 其 生 合 成 的 調 控 機 制 下 圖 為 本 研 究 團 隊 利 用 已 建 立 之 蛋 白 質 體 相 關 技 術 平 台, 進 行 兩 個 不 同 部 位 的 蛋 白 質 二 維 凝 膠 電 泳 分 析 之 初 步 成 果, 相 同 點 以 綠 色 表 示, 相 異 點 以 紅 色 表 示 在 此 蛋 白 質 體 相 關 技 術 平 台 中, 兩 個 不 同 部 位 的 蛋 白 質 二 維 凝 膠 電 泳 分 析 選 擇 最 具 有 意 義 的 點 進 行 液 相 層 析 串 連 質 譜 儀 液 相 層 析 串 連 質 譜 儀 水 解 特 定 胜 肽 所 形 成 之 圖 譜, 經 資 料 庫 比 對 後 可 分 析 出 胺 基 酸 序 列 最 後 將 相 關 序 列 經 NCBI 蛋 白 質 資 料 庫 進 行 比 對 分 析, 分 析 其 胺 基 酸 序 列 二 維 凝 膠 電 泳 分 析 選 擇 最 具 有 意 義 的 點, 至 少 需 分 析 5 段 胺 基 酸 序 列, 其 中 至 少 須 有 3 段 胺 基 酸 序 列 與 NCBI 蛋 白 質 資 料 庫 比 對 分 析 具 高 度 相 似 性, 方 能 判 讀 其 蛋 白 質 之 種 類 臨 床 上 治 療 糖 尿 病 的 藥 物, 主 要 是 以 biguanides sulphonylureas thiazolidinediones D-phenylalanine 衍 生 物 等 藥 物 為 主, 而 這 些 藥 物 的 共 同 點 都 是 藉 由 影 響 胰 島 素 分 泌 或 改 變 其 訊 息 傳 導 路 徑 來 發 揮 其 療 效 因 此, 可 先 將 具 有 胰 島 素 受 體 的 細 胞 株 3T3-L1 誘 發 分 化 成 脂 肪 細 胞 後, 處 理 不 同 的 苦 瓜 萃 取 物 或 其 成 分, 再 投 與 放 射 線 標 定 的 葡 萄 糖 後, 觀 察 各 種 處 理 組 的 細 胞 是 否 會 將 葡 萄 糖 攝 入 細 胞 內, 以 分 析 不 同 的 苦 瓜 萃 取 物 或 其 成 分 是 否 具 有 調 整 血 糖 的 功 能 下 圖 為 本 研 究 團 隊 誘 發 細 胞 分 化 的 初 步 結 果, 分 別 是 以 顯 微 鏡 在 固 定 放 大 倍 率 (200X) 下 觀 察 3T3-L1 在 誘 發 分 化 前 後 的 細 胞 形 態 變 化 左 圖 為 在 Oil Red 染 色 下, 觀 察 3T3-L1 原 來 的 細 胞 形 態,3T3-L1 呈 現 出 原 本
9 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 97 的 纖 維 母 細 胞 的 形 態 特 徵 中 間 圖 則 為 3T3-L1 在 誘 發 分 化 後 所 形 成 的 脂 肪 細 胞, 從 圖 中 可 觀 察 到 細 胞 內 具 有 明 亮 的 油 室, 此 即 是 脂 肪 細 胞 的 特 徵 之 一 右 圖 是 中 間 圖 的 細 胞 再 經 由 Oil Red 染 色 後 進 行 觀 察, 從 圖 中 可 以 更 清 楚 的 看 到 被 染 成 紅 色 的 油 室, 證 明 3T3-L1 已 經 確 實 被 誘 導 分 化 成 脂 肪 細 胞 Preadipocytes(Oil Red) adipocytes adipocytes(oil Red) 下 圖 為 3T3-L1 分 化 成 的 脂 肪 細 胞 經 胰 島 素 及 藥 物 等 處 裡 後, 其 對 氚 (3H) 標 定 葡 萄 糖 的 不 同 攝 取 能 力 陰 性 對 照 組 只 有 誘 導 分 化 未 做 任 何 其 他 處 理, 以 胰 島 素 刺 激 葡 萄 糖 的 攝 取 為 陽 性 控 制 組, 最 後 給 予 藥 物 看 藥 物 是 否 能 刺 激 其 葡 萄 糖 的 攝 取 由 下 圖 結 果 顯 示 藥 物 可 以 成 功 的 促 進 脂 肪 細 胞 葡 萄 糖 的 攝 取
10 98 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 上 述 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 (MCSE) 調 整 血 糖 的 效 果 可 能 與 促 進 3T3-L1 脂 肪 細 胞 攝 取 葡 萄 糖 有 關 3T3-L1 分 化 成 的 脂 肪 細 胞 後, 再 經 胰 島 素 或 不 同 濃 度 的 MCSE 處 理, 測 定 對 氚 (3H) 標 定 葡 萄 糖 的 攝 取 能 力 結 果 顯 示 隨 著 MCSE 濃 度 的 上 升, 細 胞 攝 取 葡 萄 糖 的 能 力 也 增 加, 證 明 MCSE 可 以 藉 由 促 進 細 胞 攝 取 葡 萄 糖, 而 降 低 血 糖 濃 度 3T3-L1 細 胞 經 胰 島 素 刺 激 後, 會 經 由 下 圖 兩 條 主 要 路 徑 調 節 葡 萄 糖 轉 運 分 子 (GLUT4) 在 細 胞 膜 上 的 量, 以 促 進 細 胞 膜 外 的 葡 萄 糖 攝 入 細 胞 內 第 一 條 主 要 路 徑 是 經 由 胰 島 素 刺 激 後 活 化 insulin receptor-β subunit(ir), 之 後 藉 由 將 insulin receptor substrate 磷 酸 化 後, 活 化 phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K), 再 經 由 相 關 路 徑, 活 化 下 游 的 protein kinase C(PKC) 和 Akt, 最 後 促 進 GLUT4 轉 運 與 細 胞 內 的 糖 質 新 生 另 ㄧ 條 路 徑 是 經 胰 島 素 刺 激 活 化 Ras 後, 活 化 MAPK 相 關 路 徑 之 轉 錄 因 子 ( 包 括 PPARγ AP-1), 增 加 GLUT4 的 產 生, 以 達 到 降 低 血 糖 的 反 應 因 此 本 研 究 擬 以 Western blot 分 析 相 關 訊 息 傳 導 以 electrophoretic mobility shift assay 探 討 對 轉 錄 因 子 的 影 響 及 以 免 疫 螢 光 分 析 法 測 定 細 胞 表 面 GLUT4 的 translocation, 分 析 苦 瓜 機 能 性 成 份 調 整 血 糖 之 可 能 機 轉 本 項 研 究 與 本 校 附 醫 新 陳 代 謝 科 陳 清 助 醫 師 合 作 執 行
11 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 99 化 學 組 成 固 定 生 物 反 應 明 確 及 無 安 全 性 顧 慮 之 苦 瓜 調 整 血 糖 保 健 產 品 之 開 發, 主 要 以 活 性 分 析 平 台 及 動 物 模 式 交 叉 實 驗, 引 導 苦 瓜 最 大 活 性 物 質 的 萃 取 策 略 的 製 定 未 來 如 進 一 步 確 認 某 一 種 蛋 白 質 為 苦 瓜 中 之 可 能 相 關 調 整 血 糖 因 子, 進 一 步 可 設 計 為 大 量 富 集 活 性 蛋 白 及 固 定 蛋 白 質 組 成 的 苦 瓜 萃 取 製 程 目 前 已 確 定 在 苦 瓜 在 在 特 定 分 子 量 區 間 具 較 佳 之 血 糖 調 整 效 應 苦 瓜 調 節 血 糖 保 健 食 品 的 產 品 設 計 可 與 產 業 界 協 同 進 行 由 本 研 究 篩 選 出 具 調 整 血 糖 之 功 能 性 蛋 白 後, 配 合 前 述 的 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 分 析, 找 出 哪 一 品 種 苦 瓜 的 特 定 部 位 含 量 最 高, 再 以 不 同 的 方 法 進 行 活 性 蛋 白 質 的 萃 取 及 純 化, 進 ㄧ 步 以 本 研 究 的 活 性 平 台 與 動 物 實 驗 進 行 驗 證, 製 訂 出 合 理 的 各 種 活 性 蛋 白 含 量 範 圍 之 後 再 採 用 cgmp 之 製 程 將 市 售 苦 瓜, 進 行 萃 取 與 部 分 純 化 後, 製 造 成 苦 瓜 調 整 血 糖 保 健 食 品 之 原 型 產 品, 在 原 型 產 品 療 效 確 認 後, 同 時 確 立 並 修 正 其 製 程, 以 加 速 相 關 保 健 產 品 的 開 發 時 程
12 100 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 參 考 文 獻 1.Ahmed, I., Adeghate, E., Sharma, A.K., Pallot, D.J., Singh, J., Effects of Momordica charantia fruit juice on islet morphology in the pancreas of the streptozotocin-diabetic rat. Diabetes Research Clinical Practices 40, Ahmed, I., Lakhani, M.S., Gillett, M., John, A., Raza, H., Hypotriglyceridemic and hypocholesterolemic effects of anti-diabetic Momordica charantia(karela) fruit extract in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes Research Clinical Practices 51, Akhtar, M.S., Trial of Momordica charantia Linn(karela) powder in patients with maturity-onset diabetes. Journal of Pakistan Med Association 32, Ali, L., Khan, A.K., Mamun, M.I., Mosihuzzaman, M., Nahar, N., Nur-e-Alam, M., Rokeya, B., Studies on hypoglycemic effects of fruit pulp, seed, and whole plant of Momordica charantia on normal and diabetic model rats. Planta Medicine 59, Bailey, C.J., Day, C., Turner, S.L., Leatherdale, B.A., Cerasee, a traditional treatment for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice. Diabetes Research 2, Cakici, I., Hurmoglu, C., Tunctan, B., Abacioglu, N., Kanzik, I., Sener, B., Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts in norrmoglycaemic or cyproheptadine-induced hyperglycaemic mice. Journal of Ethnopharmacology 44, Chen, F.C., Present advance in chemical and pharmacological research of natural products for anti-hyperglycemia. Chinese Traditional and Herbal Drugs 18: Day, C., Cartwright, T., Provost, J., Bailey, C.J., Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts. Planta Medica 56, Fröde TS, Medeiros YS Animal models to test drugs with potential antidiabetic activity. Journal of Ethnopharmacology 115: Grover, J.K., Rathi, S.S., Vats, V., Amelioration of experimental diabetic neuropathy and gastropathy in rats following oral administration of
13 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 101 plant(eugenia jambolana, Mucuna pruriens and Tinospora cordifolia) extracts. Indian Journal of Experimental Biology 40, Gu, G.Y. and Jiang, Y., A survey on anti-hyperglycemic constituents from plants. World Phytomedicines 12: Higashino, H., Suzuki, A., Tanaka, Y., Pootakham, K., [Hypoglycemic effects of Siamese Momordica charantia and Phyllanthus urinaria extracts in streptozotocin-induced diabetic rats(the 1st report)] Nippon Yakurigaku Zasshi 100, Iwashima, Y., Abiko, A., Ushikubi, F., Hata, A., Kaku,K., Sano, H., Eto, M. 2001Downregulation of the voltage-dependent calcium channel(vdcc) β-subunit mrnas in pancreatic islets of type 2 diabeticrats. Biochemical and Biophysical Research Communications 280: Jayasooriya, A.P., Sakono, M., Yukizaki, C., Kawano, M., Yamamoto, K., Fukuda, N., Effects of Momordica charantia powder on serum glucose levels and various lipid parameters in rats fed with cholesterolfree and cholesterol-enriched diets. Journal of Ethnopharmacology 72, Kar, A., Choudhary, B.K., Bandyopadhyay, N.G., Comparative evaluation of hypoglycaemic activity of some Indian medicinal plants in alloxan diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology 84, Karalee, J.J., Anderson, R.A., Graves, D.A A hydroxychalcone derived from cinnamon functions as a mimetic for insulin in 3T3-L1 adipocytes. Journal of the American College of Nutrition 20: Karunanayake, E.H., Jeevathayaparan, S., Tennekoon, K.H., Effect of Momordica charantia fruit juice on streptozotocin-induced diabetes in rats. Journal of Ethnopharmacology 30, Karunanayake, E.H., Welihinda, J., Sirimanne, S.R., Sinnadorai, G., Oral hypoglycaemic activity of some medicinal plants of Sri Lanka. Journal of Ethnopharmacology 11, Kedar, P., Chakrabarti, C.H., Effects of bittergourd(momordica charantia ) seed & glibenclamide in streptozotocin induced diabetes mellitus. Indian Journal of Experimental Biology 20, Lelliott, Vidal-Puig, A.J Lipotoxicity, an imbalance between
14 102 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 lipogenesis de novo and fatty acid oxidation. International Journal of Obesity and related Metabolic Disorders 28: Li, W.L., Zheng, H.C., Bukuru, J., De Kimpeb N Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus. Journal of Ethnopharmacology 92: Maddux, B.A., See, W., Lawrence Jr., J.C., Goldfine, A.L., Goldfine I.D., Evans, J.L Protection against oxidative stress-induced insulin resistance in rat L6 muscle cells by micromolar concentrations of alpha-lipoic acid. Diabetes 50: Masiello, P Animal models of type-2 diabetes with reduced pancreatic β-cell mass. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology 38: Matsuda, H., Li, Y., Murakami, T., Matsumura, N., Yamahara, J., Yoshikawa, M., 1998 Antidiabetic principles of natural medicines. III. Structure-related inhibitory activity and action mode of oleanolic acid glycosides on hypoglycemic activity. Chemical & Pharmaceutical Bulletin 46, Pari, L., Ramakrishnan, R., Venkateswaran, S., Antihyperglycaemic effect of Diamed, a herbal formulation, in experimental diabetes in rats. Journal of Pharmacy Pharmacology 53, Raman, A. and Lau, C., Anti-diabetic properties and phytochemistry of Momordica charantia L.(Cucurbitaceae). Phytomedicine 2, pp Rathi, S.S., Grover, J.K., Vats, V., The effect of Momordica charantia and Mucuna pruriens in experimental diabetes and their effect on key metabolic enzymes involved in carbohydrate metabolism. Phytotherapy Research 16, Rees, D.A., Alcolado, J.C Animal models of diabetes mellitus. Diabetic Medicine 22: Rosenson, R.S Effects of peroxisome proliferator-activated receptors on lipoprotein metabolism and glucose control in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Cardiology 99: Sarkar, S., Pranava, M., Marita, R., Demonstration of the hypoglycemic action of Momordica charantia in a validated animal model
15 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 103 of diabetes. Pharmacology Research 33, Shibib, B.A., Khan, L.A., Rahman, R., Activity of Coccinia indica and Momordica charantia in diabetic rats: depression of the hepatic gluconeogenic enzymes glucose-6-phosphatase and fructose-1,6- bisphosphatase and elevation of both liver and red-cell shunt enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Biochemistry Journal 292, Singh, N., Tyagi, S.D., Agarwal, S.C., Effects of long term feeding of acetone extract of Momordica charantia(whole fruit powder) on alloxan diabetic albino rats. Indian Journal of Physiology Pharmacology 33, Sitasawad, S.L., Shewade, Y., Bhonde, R., Role of bittergourd fruit juice in stz-induced diabetic state in vivo and in vitro. Journal of Ethnopharmacology 73, Storling, J., Zaitsev, S.V., Kapelioukh, I.L., Karlsen, A.E., Billestrup, N., Berggren, P.O., Mandrup-Poulsen, T Calcium has a permissive role in interleukin-1 β-induced c-jun N-terminal kinase activation in insulin-secreting cells. Endocrinology 146: Welihinda, J., Karunanayake, E.H., Sheriff, M.H., Jayasinghe, K.S., Effect of Momordica charantia on the glucose tolerance in maturity onset diabetes. Journal of Ethnopharmacology 17, WHO 37.Yin, J. and Chen, M.D., Present advance in active constituents of Chinese medicinal herbs for anti-hyperglycemia. Information on Chinese Traditional Medicine 6: Zhao, Y.F., Keating, D.J., Hernandez, M., Feng, D.D., Zhu, Y., Chen, C Long-term inhibition of protein tyrosine kinase impairs electrophysiologic activity and a rapid component of exocytosis in pancreatic β-cells. Journal of Molecular Endocrinology 35:
16 104 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 ABSTRACT Bitter gourd(momordica charantia L.) is a commonly known vegetable and medicinal herb. Severalscientific papers indicated that bitter gourd extracts are used for the treatment of diabetes and its complications, such as nephropathy, cataract and insulin resistance, by regulating the levels of blood glucose. However, the active components of bitter gourd responsible for hypoglycemic activities remained to be identified. In the first-year project, we have demonstrated that the protein extracts of bitter gourd exhibited the hypoglycemic activities by glucose tolerance test in mice. By molecular weight cutting assay, we identified that specific protein components were responsible for the regulation of blood glucose. In the second- year and third-year project, we will compare the effects of various species and parts of bitter gourd on the regulation of blood glucose. The protein components of bitter gourd will be identified by proteomic approach and the hypoglycemic mechanism of protein components will be demonstrated by molecular biology approach. The chemical defined, bioactivity defined, and biosafe bitter gourd health food for the regulation of blood glucose will be further developed. The better understanding of the functional proteins could provide the molecular evidences for the hypoglycemic activity of bitter gourd and further develop as the health food for the improvement of diabetes. Key words:bitter gourd, hypoglycemic activity, health food, proteomics
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95 年 訂 定 96 年 11 月 修 正 97 年 10 月 修 正 100 年 2 月 修 正 101 年 4 月 修 正 102 年 1 月 修 正 103 年 4 月 修 正 103 學 年 度 入 學 新 生 適 用, 舊 生 可 比 照 適 用 1. 研 究 生 須 於 入 學 後 第 二 學 期 開 學 前 選 定 指 導 教 授, 經 課 程 委 員 會 認 定 後 方 得 繼 續
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