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1 第 卷第 期质谱学报 年 月 $$$&' & 高分离快速液相色谱 四极杆飞行时间质谱法检测人参皂苷 在大鼠体内的分布 王恩鹏 斋藤哲男 孙 岩 陈长宝 刘淑莹 长春中医药大学 吉林省人参科学研究院 吉林长春 新泻药科大学应用生命科学研究院 日本新泻市 (-) 摘要 建立了高分离快速液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱 -/-.= & 法检测大鼠尾静脉注射人参皂苷 - 后 不同组织 心 肝 脾 肺 肾 脑 中 - 的分布情况 样本经蛋白沉淀处理 & ' $ $ :' $$ ) 色谱柱 ( 分离 采用含 < 甲酸的水溶液 - 乙腈 为流动相 梯度洗脱 以人参皂苷 - 作为内标 在电喷雾负离子模式下检测 结果表明 组织匀浆标准曲线的线性范围为 3 线性关系良好 最低检出限 & 为 3 最小定量限为 3 准确度 日内和日间精密度 提取回收率均符合生物样品的分析要求 大鼠尾静脉注射 溶液后 在大鼠体内不同组织中均能检测到 - 主要分布在肺 脾 肾 心 脑 肝等器官 其中在肺中分布最多 在肝中分布最少 该方法简单 灵敏 快速 检出限低 适用于检测人参皂苷 在生物体内的分布 关键词 高分离快速液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱 -/-.= & 人参皂苷 静脉注射 组织分布中图分类号 ( 文献标志码 文章编号 - - (- ()': : ) $ $ $ $ $ ( $ ( ; $ ( ; -' 3 &.. $ &* 3- *& - 3.-/$ $ ) /))- $ $ /))- & (* (*).) $ 9 '9 $ 9 3 ' '97 9 '- -3 $$$' -/-.= &7$$ $9 $ 3 9$ 3 $ $9 - $ $$ $ $' 3 收稿日期 (- - 修回日期 - - ) 基金项目 吉林省教育厅 十二五 科学技术研究项目 ( 长春市科技局重大科技攻关项目 ( 资助作者简介 王恩鹏 ) 男 汉族 吉林人 助理研究员 从事中药化学研究 通信作者 刘淑莹 女 汉族 黑龙江人 教授 从事中药化学和有机质谱学研究 - $ 网络出版时间 - - 网络出版地址 ' $9. (

2 第 期 王恩鹏等 高分离快速液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱法检测人参皂苷 在大鼠体内的分布 ( 89 9 $ 39 $ $ 5.3 $ '$ 7 ' ' 9 ' ' ' 3 ' $' $ 7$ 9 & ' $ $ :' $$ ) ( 7 '$ $$ 3$ < 9 7 9$ $$7$ - ( <- < (- <-( < - ( <- < $ $9-7$ $9$ $ 9 9 & $$$' :' $7 ' 9 -/-.= & ''97 $' & $ ' $ $7$ $ 3-3 $$ 3 $ 7 9 $3 9 7 /$ ' $ 9 $ 3- $ '$ $$ $ $ $ 9 3 $7 383$ $ 99$ 9 3$' $ - 7 7$ $ '$$ $ 9$$ '$ $ 9 '97 $$ 3 3 $ $9$ () $ '9 $ 9 3 ' '9 7 9 '- - 3 $$$' -/-.=-&3 $ $9 $ 5 $$ 9$ 人参系五加科植物 被称为 百草之王 在传统中医药中占据重要地位 目前 人参在中 国 韩国 日本 俄罗斯 美国和加拿大等国家被广泛种植 它作为一种补充食品深受人们欢 - 迎 人参皂苷 是人参皂苷中的主要成分 具有良好的抗氧化 抗衰老 降血糖 降血脂等功效 对于缺血性心律失常 体液免疫和细胞 - 免疫均有较好的作用 其结构示于图 近年来 有许多关于人参皂苷 的体内代谢及 药代动力学研究的报道 如 等利用高效液相色谱法对人参皂苷 的肠内菌群代谢产物进行检测 结果表明 - 在体内代谢的主要初级产物为人参皂苷 3 其继续水解可 ) 生成人参皂苷 和 陈广通等利用 -& -&& 法从口服 - 大鼠的粪便中检测出 个代谢产物 分别是 - 人参皂苷 3 - 人参皂苷 - 人参皂苷 人参皂苷 = - 羰基人参皂苷 和原人 参三醇 彭缨等采用 法测定大鼠静脉注射 种不同剂量 后的血药浓度 结果表明 组大鼠的药代动力学参 数成双隔室型 在该剂量范围内 - 的消除为线性动力学 近年来 人们在研究人参皂苷血浆药物浓度的同时 其组织分布也受到重视 两者结合能更好地阐明人参皂苷 的体内代谢 过程 有效地评价生物利用度 图 * 人参皂苷 的化学结构式 * $ $ $ 目前 人参皂苷的分析多采用高效液相色谱 - 紫外检测 -* 法 但该方法的分析

3 ( ) 质谱学报 第 卷 时间长 - 特别是分析生物样本时需要 以上 且由于生物样品中内源性干扰较多 影响了测定的准确度和灵敏度 液相色谱在没有标准品的情况下 不利于目标成分的准确测定和确认 高分离快速液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱 -/-.= & 法作为中药生物样品多成分复杂体系的分析工具 将快速液相色谱仪与高分辨质谱仪连接 液相色谱部分采用高压双元泵 提高了流动相的压力与流速 同时使用 粒径填料的色谱柱 可明显加快分析速度 与常规的 -* 相比 该方法具有准确度好 专属 - ) 性强 灵敏度高 分析速度快等优点 能够提高生物样品的分析效率 现已被广泛用于药物鉴定 代谢组学 药代动力学等领域的 - - 研究 本研究拟采用 -/-.= & 法考察大鼠静脉注射人参皂苷 后的组织分布特征 并对其进行专属性 线性范围及检测限 精密度与准确度 提取回收率 检测限和稳定性的考察 旨为进一步开发利用人参皂苷 奠定基础 * 实验部分 ** 仪器与试剂 3 系列 系统 3 ( /-.= 质谱仪 美国 3 公司产品 配有 & 离子源和 $$ 数据处理系统 ;&- - 型电热恒温水浴箱 北京长安科学仪器厂产品 高速冷冻离心机 德国 '' 9 公司产品 ) - 型电动玻璃匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司产品 超低温冰箱 美国. 公司产品.-) 型氮吹仪 天津奥特塞恩斯仪器有限公司产品 人参皂苷 标准品 色谱级 纯度 )< 购自吉林大学药学院 乙腈 色谱级 美国.9 公司产品 甲酸 色谱级 美国 &3 公司产品 超纯水 由美国 ' 公司的 -/ 系统制得 * 实验条件 ** 色谱条件 & ' $ $ :- ' $$ ) 色谱柱 ( 流动相 为含 < 甲酸的超纯水 为乙腈 梯度洗脱 ( < < ( <( < ( < < ( < 柱温 ( A 流速 进样量 ( * 质谱条件 电喷雾负离子电离模式 气体温度 ( A 干燥气流速 喷雾气压 8 毛细管电压 (8 裂解电压 ( 锥孔电压 ( 质量扫描范围 ( 样品测试前 使用调谐液校正质量轴 *- 溶液配制和样品处理 *-* 标准溶液和内标溶液的配制 精密称取 3 人参皂苷 标准品 用甲醇稀释至 配制成浓度为 3 的母液 然后用甲醇稀释成浓度为 3 的工作液 精密称取 3 人参皂苷 标准品 用甲醇定容至 配制成浓度为 (3 的内标溶液 *- 标准曲线的绘制 分别取 空白大鼠的组织 心 肺 脾 肾 脑 肺 匀浆清液于 ( '' 9 管中 向每个样品中加入不同质量的人参皂苷 配制成浓度分别为 ( ( ( 3 的系列标准溶液 加入 3 人参皂苷 作为内标 用移液枪混匀 再加入 甲醇 涡旋 ( 以 离心 取上清液 经 ( 滤膜过滤 进样检测 以人参皂苷 浓度为横坐标 - 与 - 的峰面积比值 // 为纵坐标 $ 进行线性回归 绘制标准曲线 *-- 动物实验 ( 只雄性 ;$ 大鼠 体重 D 3 动物合格证号 & - 吉 - 由长春生物制品有限公司动物中心提供 在标准环境下 湿度 ( D < 温度 (DA 昼夜循环 进食进水 实验前禁食 *-. 样品的采集与制备 将 ( 只大鼠随机分为 ( 组 其中 组为空白对照组 其余 组分别在尾静脉注射 383 人参皂苷 在 ( ) 后处死 取心 肝 脾 肺 肾 脑等脏器 以蒸馏水洗净 称其质量 按质量 - 体积比 ( 向各组织中加入生理盐水 冰上匀浆后 置于预置好的 A 高速冷冻离心机内 以 离心 取上清液于冻干机内冻干

4 第 期 王恩鹏等 高分离快速液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱法检测人参皂苷 在大鼠体内的分布 ( 加入 甲醇 涡旋 ( 超声溶解 ( 转移至 ( '' 9 管内 置于预置好的 A 高速冷冻离心机内 以 离心 取上清液 (A 下氮气吹干 向每个样品中加入 3 人参皂苷 内标溶液 用流动相定容至 制成浓度为 3 的溶液 经 ( 滤膜过滤 置于 A 冰箱中 待测 结果与讨论 * 专属性考察以大鼠的肺脏组织为例 在电喷雾负离子模式下 其总离子流图示于图 通过比较供 试空白组织色谱图 向空白组织中加入待测物和内标物后得到的总离子流图. 提取离子流图 和给药后不同时间测得的色谱图 发现组织中所含内源性物质不干扰被测物和内标物的测定 被测物峰形良好 在 和 节条件下 - 和内标 - 的保留时间分别为 ( 和 线性范围及检测限 大鼠组织样本的线性范围和标准曲线列于表 可以看出 该方法的线性关系良好 以 & 计算方法的最低检出限 为 3 注 空白大鼠肺脏总离子流图 向空白组织中加入 - 与内标物的总离子流图 - 的提取离子流图 9 内标物的提取离子流图图 负离子模式下 大鼠肺脏组织的总离子流图 $ & 表 * 大鼠组织样本的标准曲线 相关系数和线性范围 * &$ $ $ $ $ $ $ 组织相关系数线性范围 线性回归方程样本 3 心 $ ) 肝 $ ( 脾 $ ( 肺 $ C ) 肾 $ C () ) 脑 $ ) ) - 精密度与准确度按 节方法分别配制 - 各组织匀浆液高 中 低 个浓度 3 的质量控制 / 样品 每个浓度进行 ( 样本分析 连续测定 9 为保持实验条件一致 标准曲线的测定与上述样品测定同时进行 根据当日标准曲线计算 / 样品浓度 与配制浓度?? 对照 将 / 样品的结果进行计算 通过每一浓度的 种处理方法的浓度比值? 计算回收率 得出方法准确度 通过计算二者的浓度相对标准偏差得出方法的精密

5 质 谱 学 报 第卷 * 度方法的准确度和精 密 度 列 于 表 ) 结 果 表 峰面积值 G) 以每一浓度的 ) 种处理方 法的峰 明' ZE]5在各组织匀浆液中的日内和日间 精密 度 ]8K 均小于)*` 准确度在?* _*`* _*` 面积比值 G(G)$计算提 取 回 收 率 以 肺 匀 浆 液为 例提 取 回 收 率 分 别 为? _h _*$` ) 范围内?* h $` )? h) _$` 内标 \8$回 收 $ 率为?A h _ ` 表 D 质量控制样品的日内' D CG 稳定性考察 按 _ 节方法 分 别 配 制 ZE]5 各 组 织 匀 日间精密度和准确度 `G K-: 7 D/ * ( * -*.. `G L 3\L 浆液高)中)低 个 浓 度 的 G 样 品每 个 浓 度 进行 样 本 分 析 分 别 将 样 品 在 室 温 约 组织 浓度( 日内精密度 日间精密度 准确度 样本 Q(D$ ]8K(` ]8K(` ]P(` )* e $下放置 3) e 下冷藏 A3)* e 冻 融循环 次经处理后进样测定考察大鼠的各 心 _ f _ 个组织匀浆液中 ZE]5 在 室 温)冷 藏)反 复 冻 融 * 条 件 下 的 稳 定 性 以 每 一 浓 度 样 本 分 析 ** * * _ A _ f _ ** * 在大鼠体内不 同 时 间 点 * ) )) ) A3$各 组 * f 织中 ZE]5的分布情况示于图 结果表明'在 ** _? _ ) _ 心)肝)脾)肺)肾)脑 等 种 组 织 器 官 中 均 能 检 A _ ) * _ ** _? _ f* f * f _ ** * _? ) ** f _ 肝 种情况下得到 的 ZE]5 峰 面 积 与 时 间 点 的 偏 差均在 ` 以内说明各 组 织 匀 浆 液 中 的 待 测 物稳定性良好 脾 肺 肾 脑 D CP 组织分布考察 大鼠尾静脉注射 )* <Q(VQ ZE]5 溶 液 后 测到 ZE]5 ZE]5 在 各 组 织 中 的 分 布 迅 速 且 具 有不均衡性其含量排序为'肺 脾 肾 心 脑 肝 D CF 提取回收率 按 _ 节方法 分 别 配 制 ZE]5 各 组 织 匀 浆液高)中)低 个 浓 度 的 G 样 品每 个 浓 度 进行 样本分析连 续 测 定 W为 保 持 实 验 条 图 E 大鼠尾静脉注射 DQ5I &ZIN'后( N' 件一 致标 准 曲 线 的 测 定 与 上 述 样 品 测 定 同 时 H E$ N' L IJ 进行根据当 日 标 准 曲 线 计 算 G 样 品 浓 度 与配制浓度对 照将 G 样 品 的 相 应 峰 面 积 记 为 G 另取各 空 白 组 织 匀 浆 液离 心 后 得 上 清 液分别加入上述低)中)高浓度的标准溶液每 个浓度进行 样本分析$进样分析获得相应的 在各组织中的浓度变化 3 8 L -*5 -* &ZI 3DQ5I E 结论 本研 究 建 立 了 ]]DEGEFHa 78 法 测 定

6 第 期 王恩鹏等 高分离快速液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱法检测人参皂苷 在大鼠体内的分布 ( 人参皂苷 在大鼠体内的分布 该方法简便快速 专属性强 灵敏度高 分析效率好 可弥补人参皂苷类物质在紫外吸收差 检测限值高的缺陷 液相色谱仪结合 粒径填料色谱柱的使用 提高了色谱的分离效率 加快了分析速度 质谱检测采用电喷雾负离子电离模式 在尾静脉注射 - 大鼠的 种主要组织器官中均能检出 - 不同组织样本中的 - 定量范围在 3 之间 该方法适用于生物样品中人参皂苷类成分的高通量分析 参考文献 * / $ 3 ' 9$ '9 - $ $ 9 9 '' $ $ 3 - * '3 ' $ - $ $' 3. $ ( - *. & $ $9$ $' $ $ 3 ' 9 ''9-3 3 ) - ( 何道同 王兵 陈臖明 人参皂苷药理作用研究进展 辽宁中医药大学学报 )- 3 ; 3 3 $ ' 3 $$ ' 3 $ 3 $ $9 3 * $. 9 $ 9 )- $ (.. & *. - 9 $ : 9 9 ' $ ( )( - )() ; & $ - $9 9 $ $ $$ B 8 $ ) )- ( & $ 3 $ $9 $ 9 $$ () - ) ) 陈广通 杨敏 果德安 人参皂苷 在大鼠体内的代谢研究 中国中药杂志 ( - ( 3 3 * $ 9 3 $ $9 $ $ 9 ( - ( $ 彭缨 王淑君 潘卫三 等 人参皂苷 大鼠体内药物动力学研究 沈阳药科大学学报 - 3 ; & 5 ;$ 8 $3 $ $9 & 3 * $ - $ & 9$ - $ ' 9$ 9 $ 3 $ 3 $ 9 $ ' 3 - ) 陈英红 姜瑞芝 罗浩铭 等 人参总皂苷提取物指纹图谱研究 中国实验方剂学杂志 ( * - 3 & 9$ 3 ' $ 3 3 $ $9 : $ 3 9: $ :' = ( - $ 张金秋 夏娟 孙光芝 等 - 法测定人参花中 个人参皂苷含量 药物分析杂志 ( ( - &* 3 8 9$ 3 $ $9$ - $ $$ ( ( - $ 马静 李学林 唐进法 等 不同途径给药参麦注射液中人参皂苷 3 及 在大鼠体内药代动力学研究 中药药理与临床 $ 9 3 $ $9 3 9 $7 3 $ 9 9 $ & $ $ 9 - $ ;* ;/ / * & 9$ $ -' -

7 ( 质谱学报 第 卷 ' :.- '3 $ $9$ 3 9 $ 3 '9 $ ' '9 7 9 '- --3 $$ $' -/-.=-& 3 9 =9 $ - ( ; * 9 $ $ ' - 9 ' --3 $$$' 9 9 $$ ) - * = * 3 $ 3 ' $ 9 : ' 9 $$ ' - $$$' 3 - ' - ; ' ' $$ $ -& /-.=-& 9 $ 9 $ (- ) &* ;* ; * - 8 $ 9 3 $ $9 9$ $ 9 $ $ $ $ 3 -/-.=-& 9 9 $$ )) ' - * * / - 5 $ : '$ $ 3 -&& 9 $'- ' ' 8 $ 9 $$ ( ( - ; &* $ $ 9 $ 9 9 $ 9 '9 $ ' 97 9 ' $$$' $ - $ -) ;* ;&* 3 9 $ $ $$ $9-3-' 9-3 ' '9 7 9 '- --3 $$$' 9 $$ ( - (

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