第 26 卷第 2 期 2017 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.26No.2 Apr.2017 doi: /j.isn 利用叶绿素荧光快速筛选紫外诱变高含油小球藻刘长斌 1,2, 佟少明

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1 第 26 卷第 2 期 2017 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.26No.2 Apr.2017 doi: /j.isn 利用叶绿素荧光快速筛选紫外诱变高含油小球藻刘长斌 1,2, 佟少明 1 1, 侯和胜 (1. 辽宁师范大学, 辽宁省植物生物工程重点实验室, 辽宁大连 ;2. 大连工业大学, 辽宁大连 ) 摘要 : 本实验利用尼罗红荧光与叶绿素荧光比值表征小球藻的油脂含量, 快速筛选出一株紫外诱变高产油藻株经过叶绿素荧光分析表明, 诱变株 M2 的生长及光合作用没有显著变化检测诱变株 M2 总油脂含量 32.1%, 比野生藻株的 23.1% 提高了 9 个百分点关键词 : 叶绿素荧光 ; 小球藻 ; 紫外诱变 ; 油脂含量中图分类号 :Q945.11;S968.4 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) TheRapidlyScreeningofUV inducedhighlipidchlorela.sorokiniana UsingChlorophylFluorescence LIUChangbin 1,2,TONGShaoming 1,HOUHesheng 1 (1.LiaoningNormalUniversity,LiaoningKeyLabofPlantBiotechnology,Dalian116000,Liaoning,China; 2.DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,Liaoning,China) Abstract:AhighlipidstrainwasrapidlyscreenedfromUV inducedchlorela.sorokiniana,usingtheratioofnilered fluorescencevaluetochlorophylfluorescencetorepresentthelipidcontent.chlorophylfluorescenceanalysisindicated thattherewasnosignificantchangebetweentheinducedmutantsm2andthewildtypeongrowthandphotosynthesis. ThetotalfatcontentofmutationstrainM2is32.1%,witchincreased9percentoverwildalgaestrains. Keywords:Chlorophylfluorescence;Chlorela.sorokiniana;UV inducedmutation;lipidcontent 石化燃料日趋枯竭和温室效应的日益增强, 迫使人类急切地寻找一种新型的可再生能源小球藻在自然界中分布广泛, 能光合自养且生长迅速油脂含量高, 被认为是生产生物燃料的重要原料 [1 4] 紫外线对生物具有较强的生物学效应, 通过影响 DNA 的复制与转录, 引起基因突变和染色体畸变, 产生各种各样的变异, 实践证明紫外诱变与化学诱变剂相比污染小操作简单, 是一种有效的育种方法 [5,6] 总脂含量作为产油微藻筛选评价的重要指标之一, 其检测方法是微藻油脂开发利用的一个重要环节尼罗红 (NileRed,NR) 是一种亲脂性的荧光染料, 能与脂类物质结合, 在特定波长激发光的照射下产生荧光 [7] 研究表明, 尼罗红染色后的细胞荧光强度与细胞内油脂含量显著相关, 可以对细胞内的油脂进行定量分析 [8 10] 叶绿素 a 在植物细胞中的含量比较稳定, 能在固定波长光的激发下产生叶绿素荧光, 且与叶绿素 a 的量成正比, 可以利用叶绿素荧光来表征微藻的生物量 [11] 此外, 叶绿素荧光是收稿日期 : ; 修回日期 : 作者简介 : 刘长斌 (1982-), 男, 博士研究生, 研究方向为高产油微藻培育及微藻油脂代谢研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 ) @qq.com 通讯作者 : 侯和胜 (1955-), 男, 博士生导师, 教授, 研究方面为微藻分子生物学 ( 电子邮箱 )hesheng_hou@126. com

2 第 2 期刘长斌等 : 利用叶绿素荧光快速筛选紫外诱变高含油小球藻 127 光合作用的有效探针, 与光合作用过程的各个步骤密切偶联, 任何一步的变化都会影响到光系统 I (PSI), 从而引起荧光变化, 通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用过程的变化 [12] 本研究用尼罗红染色法 [13], 通过尼罗红荧光与叶绿素荧光比值表征小球藻的油脂含量, 利用多功能酶标仪从紫外诱变的小球藻中快速筛选出一株高产油藻株, 并用多激发波长叶绿素荧光仪 (MULTI COLOR PAM) 对诱变株与野生藻株进行叶绿素荧光分析 [14], 结果表明在本实验培养条件下诱变株 M2 的生长及光合作用与野生株没有显著差异 1 材料与方法 1.1 藻种及培养基实验所用小球藻 (C.sorokiniana) 由本实验室筛选获得, 所用培养基为 BG11 培养基氮胁迫培养基为不含氮 BG11, 固体 BG11 培养基含 1.8% 的琼脂糖 1.2 实验方法小球藻的培养将 C.sorokiniana 藻种接种到含有 100mLBG11 培养基的三角瓶中,25,40μmol m 2 s 1 光照强度, 光暗周期为 12L/12D 的条件下培养 C.sorokiniana 叶绿素荧光扫描及图谱分析取 2mL 新鲜培养液 ( 藻密度为个 /ml), 以 BG11 培养基为对照, 用分子荧光光度计进行荧光扫描, 各参数设置为 : 激发波长 (excitionwavelength, EX) nm, 吸收波长 (emisionwavelength,em) nm, 扫描狭缝宽度均为 10nm, 激发波长扫描间隔为 5nm, 每个样品重复测量 3 次小球藻 C.sorokiniana 细胞密度与叶绿素荧光关系的确立以 BG11 培养液为空白对照, 取 2mL 不同培养时期小球藻培养液, 根据三维图谱找到的荧光峰 (EX/EM=440nm/680nm) 测定小球藻的叶绿素荧光值, 每个样品重复测量 3 次同时, 用血球计数板计数法进行计数, 每个样品计数 3 次取平均值, 并以叶绿素荧光值为 X 轴, 细胞密度为 Y 轴建立关联曲线, 分析得出小球藻的叶绿素荧光强度与细胞密度的回归方程小球藻生长曲线的绘制取 1mL 活化好的小球藻藻液, 接种于含有 50mL BG11 培养基的三角瓶中培养 9 天, 每天取样测量叶绿素荧光值, 通过小球藻的叶绿素荧光强度与细胞密度的回归方程计算细胞密度, 以培养天数为 X 轴, 细胞密度为 Y 轴绘制生长曲线 NR 染色小球藻的荧光扫描及图谱分析取 1.6mL 稳定期藻液, 加入 400μL 二甲基亚矾,37 孵育 30min, 加入 20μLNR 混匀, 避光染色 5min, 以空白 BG11 培养基中加入等量的二甲基亚砜和 NR 作对照用分子荧光光度计进行三维荧光扫描, 各参数设置为 : 激发波长 nm, 吸收波长 nm, 扫描狭缝宽度均为 10nm, 激发波长扫描间隔为 5nm, 确定荧光峰小球藻油脂含量测定 (1) 相对油脂含量测定取培养后期藻液 2mL, 测定其叶绿素荧光值 (C), 取其中 1.6mL 进行 NR 染色, 根据 NR 的荧光峰确定其荧光测量参数, 检测其荧光值 (N), 以 N/C 表征小球藻的相对油脂含量高低 (2) 总油脂含量测定将培养至稳定期的小球藻离心收集, 转至无氮 BG11 培养基中氮胁迫培养 7 天, 再次离心收集藻体,80 烘箱烘干至恒重, 称藻 [11,15] 粉质量 m1 参考刘宪夫等方法将称好的藻粉放入 50mL 离心管中, 加入 4mol/L 盐酸, 震荡混匀, 室温下放置 30min, 然后沸水浴 3min, 立即放于 -20 速冷加入氯仿甲醇 2 1 提取,3 小时后离心转移上层有机溶剂, 重新加入溶剂再次抽提, 重复三次小球藻藻粉残渣烘干至恒重, 称重得 m2,m1 与 m2 之差即为油脂重量, 按公式算小球藻总油脂含量 [16] 小球藻的紫外诱变 m1-m2 m1 100% 计取对数生长期的小球藻分别稀释倍, 吸取 50μL 均匀涂布于固体 BG11 培养基上, 置于培养箱中培养 7 天后观察, 选取能形成单藻落, 藻落个数在 500 左右的稀释密度作为最适藻液诱变密度取指数生长期的藻液稀释至最适诱变密度, 取 50μL 均匀涂布于固体 BG11 培养基上, 设 3 个平行组,30W 紫外灯下 30cm, 分别照射 0,5, 10,12,15,18,20,25,30min, 避光培养 24h, 再置于光照培养箱中正常培养 10 天, 统计不同照射时间下培养基上长出的藻落数, 统计致死率, 选择小球藻致死率为 90% 左右的照射时间为本实验最佳诱变时间高油脂含量小球藻诱变株的筛选及总油脂含量检测

3 128 激光生物学报第 26 卷将在最佳诱变条件条件下存活的藻落转接到新鲜的 BG11 液体培养基中进行传代培养, 检测各诱变株的相对油脂含量, 以原藻种为对照, 筛选出相对油脂含量相对较高的藻株以 BG11 为培养基对筛选出的藻株进行传代培养 5 次, 测定原始藻株及突变藻总油脂含量叶绿素荧光参数的测量小球藻培养 6 天, 稀释藻浓度在 200μg/L, 对样品进行暗适应 20min [17], 利用 Multi Color PAM 测量 [17,18] 叶绿素荧光参数参考方法以 440nm LED 测量光测量小球藻光系统 I(PS I) 的最大量子产量 ((Fv/Fm) 用 440nm 的光及每 30s 一个光强梯度测定小球藻光响应曲线 2 结果 2.1 小球藻叶绿素三维荧光扫描与 EX/EM 的确定对小球藻叶绿素三维荧光扫描发现 EX=440 nm 时有最大荧光峰, 且 EM 值为 685nm, 所以测量小球藻叶绿素荧光值的激发波长 / 吸收波长为 EX440nm/EM685nm 2.2 小球藻细胞密度与叶绿素荧光关系的确定根据不同浓度小球藻的叶绿素荧光强度与对应的细胞计数绘图 ( 图 1), 并得到小球藻叶绿素荧光与细胞密度的回归方程为 y=1.9845x (y: 细胞密度,x: 叶绿素荧光值 ),R 2 =0.9979,P< 表明回归曲线线性良好在 530nm 时有最大荧光峰, 此时 EM 值为 578nm, 与 chen [13] [8] 等所使用波长接近, 与胡小文等所用波长有一定偏差, 可能是与不同藻株中的油脂成分差异或者是环境的极性差异造成的本文所有的相对油脂含量检测均采用 EX530nm/EM578nm 2.4 小球藻的紫外诱变及高产油藻种的筛选不同时间紫外照射下小球藻的致死率如图 2 所示, 紫外线照射对小球藻有致死作用, 半致死照射时间为 IC50=12min, 当 15min 时致死接近 90%, 当照射 25min 时致死接近 99%, 当照射 30min 时藻细胞全部死亡, 为了获得较多的诱变株又不至于因为辐射剂量过大而造成过多细胞死亡本实验选择的照射时间为 15min 图 2 不同照射时间下藻细胞存活数 Fig.2 Thenumberofalgaestrainatdiferentiradia tiontime 图 1 C.sorokiniana 叶绿素荧光值与细胞密度关系 Fig.1 Corelationcurvesaboutfluorescenceandcel densityofc.sorokiniana 2.3 NR 染色小球藻三维荧光扫描及 EX/EM 的确定对 NR 染色的小球藻进行 NR 荧光扫描发现 EX 高含油诱变株的筛选及总油脂含量的检测挑取诱变后的单藻落接种至新鲜的 BG11 培养基中培养至稳定期, 检测相对油脂含量 ( 图 3), 除 2 号 (M2) 和 24 号 (M24) 藻株外所有诱变藻株的相对油脂含量明均在之间与对照株的 0.74 接近,M2 和 M24 诱变株相对油脂含量均在 1.1 左右, 较对照及其他诱变藻株明显增加 ; 且 M2 诱变株的叶绿素荧光值为 38.8 略高于对照株的 36.9,M24 诱变株叶绿素荧光值 (34.6) 稍低于对照, 差异并不显著保存 M2 和 M24 藻种并进行传代培养 5 次, 测量其总油脂含量, 每个藻株重复测量 3 次结果见表 1, M2 总油脂含量为 32%, 比对照组的 23% 提高了 9 个百分点,M24 总油脂含量 25% 与对照株相比略有提高, 但不显著, 很可能是 M24 藻株在传代过程中发生了恢复突变

第 2 期刘长斌等 : 利用叶绿素荧光快速筛选紫外诱变高含油小球藻 129 图 3 诱变株的相对油脂含量 Fig.3 Therelativelipidcontentofinducedstrains 表 1 小球藻总油脂含量 Tab.1 TotallipidcontentofM2,M24,andWT WT M2 M24 藻粉重量 m1(g) 0.0334;0.0402;0.0385 0.

4 第 2 期刘长斌等 : 利用叶绿素荧光快速筛选紫外诱变高含油小球藻 129 图 3 诱变株的相对油脂含量 Fig.3 Therelativelipidcontentofinducedstrains 表 1 小球藻总油脂含量 Tab.1 TotallipidcontentofM2,M24,andWT WT M2 M24 藻粉重量 m1(g) ;0.0402; ;0.0489; ;0.0403; 藻渣重量 m2(g) ;0.0307; ;0.0330; ;0.0306; 总油脂含量 23% 32% 25% 2.5 诱变株与野生型小球藻生长曲线的比较选择诱变株 M2 测量其生长曲线并与野生藻株对照 ( 图 4), 诱变株 M2 生物量略低于对照株, 两者生长曲线非常接近, 表明诱变对诱变株的生长影响较小图 4 突变株与野生藻株生长曲线 Fig.4 GrowthcurveofM2andWT 2.6 小球藻光合参数的测定为比较诱变株 M2 与野生型小球藻的叶绿素及光合差异, 测量了两株小球藻的最大量子产量 (Fv/ Fm) 及实际量子产量 (Y(I)) 电子传递速率 (ETR) 及调节性能量耗散的量子产额 (Y(NPQ)) 光响应曲线 ( 图 5) 诱变株 M2 及野生型小球藻最大量子产量均为 0.6 左右, 诱变株略高, 但没有显著差异, 这与前面测得的叶绿素荧光值一致, 表明紫外诱变对小球藻光合潜能影响不大 ( 图 5a) 由图 5b 可以看出诱变株的 Y(I) 响应曲线与野生型几乎完全重叠, PAR 在 100μmol photons m 2 s 1 以下时诱变株 M2 的 Y(NPQ) 略小于野生型, 但响应曲线基本一致, 当 PAR 大于 243μmol photons m 2 s 1 时, 诱变株 M2 的 Y(NPQ) 逐渐高于野生株 ( 图 5c) 由 ETR 光曲线 ( 图 5d) 可以看出, 在 PAR 低于 200μmol photons m 2 s 1 时, 无论是诱变株还是野生株的 ETR 随 PAR 的增加呈线性增加, 且高度重合 ; 与 Y(NPQ) 一致, 当 PAR 大于 243μmol photons m 2 s 1 时诱变株 ETR 开始低于野生株, 这些表明在强光照射时诱变株 M2 的光合能力下降本实验小球藻培养选择的光照强度为 40μmol photons m 2 s 1, 故在本实验培养条件下诱变株 M2 与野生株的光合效率没有显著差异, 将该诱变株命名为 Chlorelasorokiniana M2

5 130 激光生物学报第 26 卷 apsi 最大量子产量,bY(I) 光曲线,cY(NPQ) 光曲线,dETR 光曲线 apsimaximumquantumyield,blightcurvesofy(i),clightcurvesofy(npq),dlightcurveofrela tiveetr 图 5 诱变株 M2 与野生藻株相关光合参数的测量 Fig.5 MeasurementsofparametersrelatedwithphotosynthesisinM2andWT 3 讨论通过诱变获取高产株, 是微生物育种的重要手段, 选择合适的方法能大大减少诱变株筛选的工作量 [19] 微藻油脂含量的快速检测是高产油藻株筛选及微藻产油的重要环节 [20,21], 目前普遍采用尼罗红染色的方法, 利用尼罗红荧光与微藻生物量建立关联检测微藻的油脂含量 [10,22] 本实验室的前期研究表明 [11], 衣藻扁藻的叶绿素荧光与细胞密度显著相关 ; 本实验对小球藻的叶绿素荧光和细胞密度的检测表明两者亦显著相关, 利用尼罗红荧光与叶绿素荧光的比值表征油脂含量, 用多功能酶标仪快速筛选出了高含油诱变株 M2 与以往对小球藻的紫外诱变育种方法相比, 本实验方法能大大减少筛选时间和工作量此外, 如利用此方法结合流式细胞仪可以直接从诱变藻液中筛选出油脂含量变化的藻株 [23], 能进一步减少实验工作量提高筛选效率利用本实验方法进行相对油脂含量检测的前提条件是微藻的叶绿素不能因诱变受到显著影响, 如果叶绿素发生变化容易产生假阳性同时, 理想的高含油藻株也希望其光合及生长能力不能下降叶绿素荧光与光合作用密切偶联, 通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用的变化因此本实验利用多激发波长叶绿素荧光仪检测了诱变株 M2 的叶绿素荧光并对光合参数进行了检测分析, 通过与野

6 第 2 期刘长斌等 : 利用叶绿素荧光快速筛选紫外诱变高含油小球藻 131 生藻株的比较, 发现诱变株的各光合参数及光响应曲线没有显著变化, 证明诱变没有对诱变藻株 M2 的叶绿素及光合作用产生显著影响本研究通过小球藻尼罗红染色荧光值 (EX530 nm/em578nm) 与叶绿素荧光 (EX440nm/EM685 nm) 的比值表征小球藻的相对油脂含量, 从紫外诱变的小球藻总快速筛选获得了一株富油藻株, 测量其总油脂含量比原始藻株提高了 9 个百分点, 通过对生长曲线和各光合参数的比较, 在本实验培养条件下诱变株 M2 的生长及光合作用没有受到显著影响, 并将其命名为 Chlorelasorokiniana M2 参考文献 [1] CHISTIY.Biodieselfrom microalgae[j].biotechnoladv, 2007,25(3): [2] WUX,RUANR,DUZ,etal.Curentstatusandprospectsof biodieselproductionfrommicroalgae[j].energies,2012,5: [3] MILANOJ,ONGHC,MASJUKIHH,etal.Microalgaebiofu elsasanalternativetofosilfuelforpowergeneration[j].re newableandsustainableenergyreviews,2016,58: [4] SUGANYAT,VARMANM,MASJUKIHH,etal.Macroalgae andmicroalgaeasapotentialsourceforcommercialapplications alongwithbiofuelsproduction:abiorefineryapproach[j].re newableandsustainableenergyreviews,2016,55: [5] 夏金兰, 宁进军, 陈程浩, 等. 耐高温小球藻紫外诱变育种及其耐高温性质研究 [J]. 中南大学学报 ( 自然科学版 ), 2013,44(3): XIAJinlan,NINGJinjun,CHENChenghao,etal.UVmuta genesisbreedingforhightemperatureresistingchlorelaandits propertiesofthermotolerance[j].journalofcentralsouthuni versity(scienceandtechnology),2013,44(3): [6] 周玉娇, 李亚军, 费小雯, 等. 小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选 [J]. 热带作物学报,2010,31(12): ZHOUYujiao,LIYajun,FEIXiaowen,etal.UV Iradiationof Chlorelavulgarisandscreeningofpetroliferousstrains[J].Chi nesejournaloftropicalcrops,2010,31(12): [7] GREENSPANP,FOWLERSD.Spectrofluorometricstudiesof thelipidprobe,nilered[j].journaloflipidresearch,1985, 26(7): [8] 胡小文, 马帅, 弓淑芬, 等. 荧光光谱法检测微藻中油脂 [J]. 中国油脂,2011,36(4): HUXiaowen,MAShuai,GONGShufen,etal.Determinationof microalgaelipidsbyfluorescentspectrometry[j].chiaoilsand Fats,2011,36(4): [9] GOVENDERT,RAMANNAL,RAWATI,etal.BODIPYstai ning,analternativetothenileredfluorescencemethodforthe evaluationofintracelularlipidsinmicroalgae[j].bioresour Technol,2012,114: [10] ALEM?N NAVAGS,CUELLAR BERMUDEZSP,CUARESMA M,etal.HowtouseNileRed,aselectivefluorescentstainfor microalgalneutrallipids[j].jmicrobiolmethods,2016, 128: [11] 张文蕾, 佟少明, 侯和胜. 利用叶绿素荧光监测微藻的生长及生理状态 [J]. 激光生物学报,2016,25(1): ZHANG Wenlei, TONG Shaoming, HOU Hesheng. Using chlorophylfluorescencemonitoringthegrowthandphysiological statusofmicroalgae[j].actalaserbiologysinica,2016,25 (1): [12] BAKERNR.Chlorophylfluorescence:aprobeofphotosynthe sisinvivo[j].annurevplantbiology,2008,59: [13] CHENW,ZHANGC,SONGL,etal.AhighthroughputNile redmethodforquantitativemeasurementofneutrallipidsinmi croalgae[j].journalofmicrobiolmethods,2009,77: [14] SCHREIBERU,KLUGHAMMERC,KOLBOWSKIJ.High endchlorophylfluorescenceanalysiswiththemulti COLOR PAM.I.Variouslightqualitiesandtheirapplications[J]. PAM ApplicationNotes,2011,1:1 21. [15] 刘宪夫, 孙利芹, 王长海. 小球藻油脂不同提取方法的比较 [J]. 食品研究与开发,2014,35(3): LIUXianfu,SUNLiqin,WANGChanghai.Thecomparisonof diferentextractionmethodoflipinfromchlorela[j].foodre searchanddevelopment,2014,35(3): [16] 胡小文. 高油脂微藻种质的筛选鉴定及新种培育 [D]. 海口 : 海南大学,2011. HUXiaowen.Screening,identificationoflipid richmicroalgal germplasmsandbreedingofnewvarieties[d].haikou:hain anuniversity,2011. [17] SHINW S,LEEB,JEONGBR,etal.Truncatedlight har vestingchlorophylantennasizeinchlorelavulgarisimproves biomasproductivity [J]. JournalofApplied Phycology, 2016:28(6): [18] LINL,FENGC,LIQ.Efectsofelectrolysisbylow amperage electriccurentonthechlorophylfluorescencecharacteristicsof Microcystisaeruginosa[J].EnvironSciPolutRes,2015, 22: [19] BALANR,SURAISHKUMARGR.Simultaneousincreasesin specificgrowthrateandspecificlipidcontentofchlorelavul garisthroughuv inducedreactivespecies[j].biotechnology Progres,2014,30(2): [20] GUMBIST,MAJEKEBM,OLANIRANAO,etal.Isola tion,identificationandhigh throughputscreeningofneutrallip idproducingindigenousmicroalgaefrom southafricanaquatic habitats[j].applbiochembiotechnol,2016,1 18. [21] MORSCHETTH,WIECHERTW,OLDIGESM,etal.Auto mationofanileredstainingasayenableshighthroughput quantificationofmicroalgallipidproduction[j].microbialcel Factories,2016,15:34. [22] ELSEY D,JAMESON D,RALEIGH B,etal.Fluorescent measurementofmicroalgalneutrallipids[j]. JMicrobiol Methods,2007,68: [23] TERASHIMAM,FREEMANES,JINKERSONRE,etal.A fluorescence activatedcelsorting basedstrategyforrapidisola tionofhigh lipidchlamydomonasmutants[j].theplantjour nal,2015,81:

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第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖

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