中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 2721 刺五加 GAPDH 基因组 DNA 的克隆与分析 * 杨果, 尤鹏升, 国红玉, 李志栋, 龙月红, 邢朝斌华北理工大学生命科学学院, 河北唐山

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1 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 2721 刺五加 GAPDH 基因组 DNA 的克隆与分析 * 杨果, 尤鹏升, 国红玉, 李志栋, 龙月红, 邢朝斌华北理工大学生命科学学院, 河北唐山摘要 : 目的克隆刺五加 GAPDH 基因的 DNA 及启动子序列, 并进行生物信息学分析方法以刺五加的基因组 DNA 为模板, 采用 PCR 和 TAIL-PCR 技术克隆 GAPDH 基因的全长 DNA 序列及 5 端上游启动子序列, 并对其进行生物信息学分析结果克隆到长 bp 的刺五加 GAPDH 基因全长 DNA 及启动子序列该基因共包含 12 个外显子和 11 个内含子, 其剪切均符合 GT-AG 原则刺五加 GAPDH 的启动子片段长 bp, 转录起始位点 A 位于起始密码子 ATG 上游 61 bp 处启动子除含有 TATA-box CAAT-box 等基本元件外, 还有诸多与激素应答光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件结论首次克隆到刺五加 GAPDH 基因的全长 DNA 及启动子序列, 为深入研究 GAPDH 基因结构特征与功能奠定基础关键词 : 刺五加 ;GAPDH 基因 ; 内含子 ; 启动子 ; 生物信息学分析中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) DOI: /j.issn Cloning and analysis on GAPDH genomic DNA from Eleutherococcus senticosus YANG Guo, YOU Peng-sheng, GUO Hong-yu, LI Zhi-dong, LONG Yue-hong, XING Zhao-bin College of Biology, North China University of Science and Technology, Tangshan , China Abstract: Objective To clone and analyze the full length DNA and promoter sequence of GAPDH gene from Eleutherococcus senticosus. Methods PCR and TAIL-PCR techniques were used to clone the full length DNA sequence and promoter sequence of GAPDH gene of E. senticosus, then these two sequences were analyzed by bioinformatics methods. Results Length of bp of E. senticosus GAPDH gene DNA and promoter sequence was cloned. Gene structure analysis showed that it contained 12 exons and 11 introns, and the splicing principles of its exon and intron were consistent with GT-AG; The promoter sequence length was bp, and the transcription start site located 61 bp upstream of the initiation codon ATG; The promoter elements such as TATA-box, CAAT-box, as well as many cis-regulatory elements were related to hormone signal response, light response and stress signals. Conclusion The full length DNA and promoter sequence of GAPDH gene in E. senticosus is successfully cloned and reported for the first time, and it provides a stable foundation for further study of GAPDH gene structure and function of E. senticosus. Key words: Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim.; GAPDH gene; intron; promoter; bioinformatic analysis 刺五加 Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim. 为五加科五加属植物, 是我国传统的珍贵药用植物 [1] 在临床上刺五加被称之为适应原样药物 [2], 具有抗衰老抗辐射抗病毒抗肿瘤等药理作用 [1] 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH) 由 4 个 30~ 的亚基组成, 相对分子质量为 , 是糖酵解过程中的关键酶 GAPDH 具有高度保守性稳定表达的管家基因特点, 因此作为内参基因广泛用于功能基因表达量的研究 [3] 在刺五加中 GAPDH 也被广泛作为研究刺五加三萜皂苷类化合物生物合成关键酶基因的内参基因 [1] 在真核生物的基因中, 内含子一度被视为是无基因功能的垃圾序列, 然而现有研究表明, 内含子在基因的表达调控中起着重要作用 [4], 在基因表达调控方面, 扮演着不可或缺的重要角色 [5-6] 同时, 启动子也是位于基因 5 端上游区的一段能与 RNA 聚合酶和转录因子特异结合的 DNA 序列, 决定基因转录表达及调控的重要收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 河北省教育厅资助科研项目 (QN ); 华北理工大学培育基金 (SP201508); 华北理工大学大学生创新创业训练计划 (X ) 作者简介 : 杨果 (1994 ), 男, 研究方向为药用植物分子生物学 * 通信作者邢朝斌 (1975 ), 男, 教授, 研究方向为分子生药学 Tel: (0315) xzbheuu@126.com

2 2722 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月顺式作用元件 [7-9] 但对刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列中内含子及启动子的克隆分析研究尚未见报道目前有关刺五加 GAPDH 基因内含子结构和启动子的研究尚未见报道本研究首次克隆并分析了刺五加 GAPDH 基因的 DNA 及启动子序列, 为进一步研究该基因的表达调控和功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料与试剂刺五加采自辽宁省本溪市桓仁满族自治县, 经华北理工大学生命科学学院邢朝斌教授鉴定为五加科植物刺五加 Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim. 以新鲜嫩叶作为提取基因组 DNA 的试材 Ex Taq DNA 聚合酶 LA Taq DNA 聚合酶 dntp DL5000 DNA Marker 购自 TaKaRa 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 pgm-t 克隆试剂盒 TOP-10 感受态细胞购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司, 琼脂糖购自 Sigma-Aldrich 公司, 氨苄青霉素 IPTG X-gal 购自北京拜尔迪生物技术有限公司, 其他试剂均为国产分析纯引物由 Thermo Fisher 公司合成 1.2 方法刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的克隆按照试剂盒说明书的要求, 称取 0.1 g 刺五加叶片, 提取基因组 DNA 利用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性根据刺五加 GAPDH 基因的 cdna 序列 [1], 应用 Primer premier 5.0 软件设计 2 对 PCR 扩增 DNA 序列的引物引物分别为 GAPDHQS GAPDHQX GAP11S 和 GAPBY3( 表 1) 以提取的刺五加基因表 1 引物列表 Table 1 List of primers 引物名称引物序列 (5 3 ) GAPDHQS ATCAAGATCGGGATCAACG GAPDHQX AAACGAACGGGAGACTCAA GAP11S TTCCTCTGTTTCCCAATACCAA GAPBY3 AACTGGCCTCTCACCAAAGAGAA GAPBY2 CAACTCTAGCAACCAGACGACCG GAPBY1 TCATTTACCGTTGATCCCGATCT GAPBYN0 GCTTTAGATCGATTGAACAGGG AD6 CA(A/T)CG(A/T/G/C)C(A/T/G/C)GA(A/T/G/C) 组 DNA 为模板进行 PCR 扩增, 反应体系为 25 μl: 模板 1 μl,dntp 4 μl,10 Ex Taq Buffer 2.5 μl, 上下游引物各 1 μl,ex Taq DNA 酶 0.2 μl,ddh 2 O 15.3 μl 反应条件:94 预变性 1 min,94 变性 30 s,53 退火 50 s,72 延伸 8 min, 共 40 个循环, 最后 72 补充延伸 15 min PCR 产物回收克隆及序列测定 PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳后, 切下目的条带, 按照琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书进行回收纯化将回收的 PCR 产物连接入 pgm-t Vector, 转化入大肠杆菌 TOP-10 感受态细胞中, 涂布于含氨苄青霉素 IPTG X-gal 的 LB 平板上培养 13 h 随机挑选 20 个阳性克隆子送往 Invitrogen 公司进行测序刺五加 GAPDH 基因启动子的克隆根据项中获得的刺五加 GAPDH 基因的 DNA 序列, 设计 3 个嵌套的反向特异下游引物 GAPBY2 GAPBY1 GAPBYN0( 表 1) 并利用交错式热不对称 PCR ( thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR ) 的上游随机简并引物 AD6 依次与 GAPBY2 GAPBY1 GAPBYN0 配对进行连续 3 轮的 TAIL-PCR 扩增第 1 轮 TAIL-PCR 扩增的反应体系为 25 μl: 刺五加基因组 DNA 1 μl,dntp 4 μl, 2 GC Buffer I 12.5 μl, 引物 GAPBY2 1 μl,ad6 引物 2.5 μl,la Taq DNA 聚合酶 0.25 μl,ddh 2 O 3.75 μl 反应结束后取第 1 轮 PCR 产物稀释 10 倍作为模板进行第 2 轮 PCR 扩增, 反应体系为 25 μl: 模板 DNA 1 μl,dntp 4 μl,2 GC Buffer I 12.5 μl,gapby1 引物 1 μl,ad6 引物 2.5 μl,la Taq DNA 聚合酶 0.25 μl,ddh 2 O 3.75 μl 最后取第 2 轮 PCR 产物稀释 100 倍作为模板进行第 3 轮 PCR 扩增, 反应体系为 25 μl: 模板 1 μl,dntp 4 μl,2 GC Buffer I 12.5 μl, GAPBYN0 引物 1 μl,ad6 引物 2.5 μl,la Taq DNA 聚合酶 0.25 μl,ddh 2 O 3.75 μl 3 轮 PCR 的反应条件见表 2 反应结束后将 TAIL-PCR 产物按照项中的方法电泳回收克隆及测序生物信息学分析利用 NCBI 的 Spidey ( 工具分析 GAPDH 基因结构 ; 利用 BDGP( tools/splice.html) 预测 5 端上游转录起始位点 ; 利用 PlantCARE( webtools/plantcare/html/) 分析 GAPDH 基因启动子的顺式作用元件

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 2723 表 2 TAIL-PCR 反应程序 Table 2 TAIL-PCR reaction process 反应循环次数温度设定第 1 轮 TAIL-PCR 1 94 2 min 5 1 94 30 s,25 3 min,72 3 min 15 94 30

1 刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的克隆以刺五加基因组 DNA 为模板, 利用引物对 GAPDHQS-GAPDHQX 和 GAP11S-GAPBY3 进行 PCR 扩增, 分别获得长为 2 680 664 bp 的条带 ( 图 1), 与预期长度相符利用 DNAMAN 6.

3 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 2723 表 2 TAIL-PCR 反应程序 Table 2 TAIL-PCR reaction process 反应循环次数温度设定第 1 轮 TAIL-PCR min s,25 3 min,72 3 min s,44 1 min,72 3 min min 第 2 轮 TAIL-PCR s,44 1 min,72 3 min min 第 3 轮 TAIL-PCR 与第 2 轮 PCR 的条件相同 2 结果与分析 2.1 刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的克隆以刺五加基因组 DNA 为模板, 利用引物对 GAPDHQS-GAPDHQX 和 GAP11S-GAPBY3 进行 PCR 扩增, 分别获得长为 bp 的条带 ( 图 1), 与预期长度相符利用 DNAMAN 6.0 软件将 2 条片段序列进行拼接, 获得长为 bp 的序列, 经 NCBI 的 BLAST 比对, 确定该序列为刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列, 且其中包含起始密码子 ATG 和终止密码子 TAA, 说明成功克隆得到了 GAPDH 基因的 DNA 全长序列 bp bp bp bp bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp ATG M 1 2 M M-Marker 1- 引物 GAP11S 和 GAPBY3 的 PCR 扩增产物 2- 引物 GAPDHQS 和 GAPDHQX 的 PCR 扩增产物 3- 第 1 轮 TAIL-PCR 扩增产物 4- 第 2 轮 TAIL-PCR 扩增产物 5- 第 3 轮 TAIL-PCR 扩增产物 M-Marker 1-PCR products amplified by GAP11S and GAPBY3 2-PCR products amplified by GAPDHQS and GAPDHQX 3-products of the primary TAIL-PCR 4-products of the secondary TAIL-PCR 5-products of the tertiary TAIL-PCR 图 1 刺五加 GAPDH 基因及启动子的克隆 Fig. 1 Cloning of GAPDH gene and promoter from E. senticosus 2.2 刺五加 GAPDH 基因 DNA 序列的分析获得的刺五加 GAPDH 基因全长 DNA 序列中共含有 12 个外显子和 11 个内含子, 其中外显子的长度变化幅度为 33~277 bp, 内含子的长度变化幅度为 81~216 bp( 图 2) 该基因在表达为成熟 mrna 的过程中, 外显子与内含子的剪切都符合 GT-AG 原则, 即内含子的 5 端剪切位点为 GT,3 端剪切位点为 AG 内含子中 (A+T) 的量为 60.78%~73.64%,(G+C) 的量为 26.36%~39.22%,(A+T) 的量显著高于 (G+ C) 的量, 与非编码区中具有较高的 AT 量相符 TAA 3 - 外显子 - 内含子 ATG 为起始密码子,TAA 为终止密码子 - exons - introns ATG initiation codon, TAA termination codon 图 2 刺五加 GAPDH 基因的结构 Fig. 2 Genomic structure of GAPDH gene in E. senticosus 2.3 刺五加 GAPDH 基因启动子的克隆与生物信息学分析利用 3 条嵌套式引物, 经过连续 3 轮 TAIL-PCR 扩增获得长 bp 的片段 ( 图 1) 比对发现, 该片段的 3 端序列与 2.2 项中 GAPDH 基因的 5 端序列完全重合, 与预期相符, 因此确定成功克隆得到刺五加 GAPDH 基因的启动子序列刺五加 GAPDH 基因的转录起始位点为 A( 标记为 +1), 位于起始密码子 ATG 上游 61 bp 处, 与多数基因的转录起始位点多为 A 的特点相符 ( 图 3) 利

2724 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 1 242 1 172 1 102 1 032 962 892 822 752 682 612 542 472 402 332 262 192 +1 122 52 +19 -TATA-box -TATA-box -CAAT-box ATG-起始密码子

4 2724 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 TATA-box -TATA-box -CAAT-box ATG-起始密码子 +1-转录起始位点 A -CAAT-box ATG -the initiation codon +1- the transcription start site A 图3 刺五加 GAPDH 基因启动子序列 Fig. 3 Promoter sequence of GAPDH gene from E. senticosus 用 PlantCARE 分析的结果表明 GAPDH 的启动子动子中说明刺五加 GAPDH 基因的转录表达调控中存在典型核心启动元件 TATA-box 11 个与多种因素有关 CAAT-box 25 个其中 TATA-box 位于讨论 bp 等处 CAAT-box 位于本研究通过 PCR 和 TAIL-PCR 技术成功克隆得 bp 等处另外其中还含有多到了长为 bp 的刺五加 GAPDH 基因 DNA 及种与激素应答逆境胁迫和光响应等元件相关表启动子序列其中启动子序列长 bp 编码区 3 如脱落酸响应顺式作用元件 ABRE 水杨酸中存在 12 个外显子 11 个内含子内含子的长度响应顺式作用元件 TCA-element 赤霉素响应元变化幅度在 bp 与已报道的其他物种件 GARE-motif P-box 生长素响应元件 GAPDH 基因相比刺五加的 GAPDH 中内含子数 AuxRR-core TGA-element 应答光响应顺式作量偏多长度偏长而外显子与内含子的剪切均符用元件 AE-box ATCT-motif Box II G-Box 合 GT-AG 原则这与其他物种内含子剪切的特征 GAG-motif I-box Sp1 TCCC-motif 等厌氧诱相符[10] 刺五加 GAPDH 基因内含子中 A T 量导必要的顺式作用元件 ARE 涉及缺氧诱导的增为 60.78% 73.64% 推测刺五加 GAPDH 基因内含强子功能元件 GC-motif 干旱诱导相关的 MYB 子可能在转录表达方面起重要作用[11] 结合位点 MBS MYBHv1 结合位点刺五加 GAPDH 基因的启动子除存在基本的调控 CCAAT-box 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件元件外还含有多种与激素应答逆境胁迫和光响应 CGTCA-motif TGACG-motif 真菌诱导子响应等元件等推测刺五加 GAPDH 基因的转录表达受到元件 Box-W1 胚乳表达相关元件 GCN4_motif 多种环境因素和生理条件的调控研究表明 GAPDH Skn-1_motif 醇溶蛋白代谢有关的顺式作用元件基因在逆境胁迫下转录表达水平会出现明显变化[12] O2-site 防卫和胁迫响应顺式作用元件 TC-rich 如水稻在水分胁迫下 GAPDH 基因转录表达会增 repeats 昼夜节律顺式作用调控元件 circadian 强[13] 推测刺五加的 GAPDH 基因可能参与逆境胁迫等以上诸多顺式作用元件存在于 GAPDH 基因启应答在抵抗逆境胁迫方面或许存在着重要的作用

5 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 2725 表 3 刺五加 GAPDH 基因启动子顺式作用元件分析 Table 3 Cis-acting regulatory element analysis of GAPDH gene promoter from E. senticosus 调控元件拷贝数序列元件功能 5UTR Py-rich stretch 1 TTTCTTCTCT 提高转录水平 ABRE 2 ACGTGGC 脱落酸响应顺式作用元件 AE-box 1 AGAAACAT 部分光响应组件 ARE 4 TGGTTT 厌氧诱导必要的顺式作用元件 ATCT-motif 1 AATCTAATCC 光响应保守 DNA 的部分元件 AuxRR-core 1 GGTCCAT 生长素响应顺式作用调控元件 Box II 1 CCACGTGGC 部分光响应元件 Box-W1 2 TTGACC 真菌诱导子响应元件 CAAT-box 25 CAATT 启动子和增强子区的一般顺式作用元件 CCAAT-box 1 CAACGG MYBHv1 结合位点 CGTCA-motif 2 CGTCA 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件 G-box 10 CACGTT 光响应顺式作用调控元件 GAG-motif 1 GGAGATG 部分光响应元件 GARE-motif 5 TCTGTTG 赤霉素响应元件 GC-motif 2 CCCCCG 涉及缺氧诱导的增强子功能元件 GCN4_motif 1 TGAGTCA 胚乳表达相关顺式调控元件 I-box 1 CTCTTATGCT 部分光响应元件 LAMP-element 1 CTTTATCA 部分光响应元件 MBS 2 CAACTG 干旱诱导相关的 MYB 结合位点 MRE 1 AACCTAA 光响应 MYB 结合位点 O2-site 1 GATGACATGA 醇溶蛋白代谢有关的顺式作用调控元件 P-box 2 CAACAAACCCCTT 赤霉素响应元件 Skn-1_motif 3 GTCAT 胚乳表达相关元件 Sp1 3 CC(G/A)CCC 光响应元件 TATA-box 11 TTTTA 据转录起始位点 30 个碱基的启动子中心元件 TC-rich repeats 2 ATTTTCTTCA 防卫和胁迫响应顺式作用元件 TCA-element 1 CAGAAAAGGA 水杨酸响应顺式作用元件 TCCC-motif 1 TCTCCCT 部分光响应元件 TCT-motif 1 TCTTAC 部分光响应元件 TGA-element 1 AACGAC 生长素响应元件 TGACG-motif 2 TGACG 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件 box II 1 TCCACGTGGC 部分光响应元件 circadian 1 CAANNNNATC 昼夜节律顺式作用调控元件 TATCCAT/C-motif 1 TATCCAT 协同 G-box 作用参加糖抑制应答的顺式作用元件 W-box 2 TTGACC 补充诱导子, 受伤及病原体应答目前有关刺五加 GAPDH 基因内含子结构和启动子的研究尚未见报道本研究首次克隆并分析了刺五加 GAPDH 基因的 DNA 及启动子序列, 为进一步研究该基因的表达调控和功能奠定基础参考文献 [1] 邢朝斌, 吴鹏, 陈龙, 等. 刺五加 GAPDH 基因的克隆及序列分析 [J]. 中草药, 2012, 43(1): [2] 中国药典 [S]. 一部 [3] Morgante C V, Guimaraes P M, Martins A C, et al.

6 2726 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷第 15 期 2016 年 8 月 Reference genes for quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction expression studies in wild and cultivated peanut [J]. BMC Res Notes, 2011, doi: / [4] Jungerius B J, van Laere A S, Te Pas M F, et al. The IGF2-intron3-G3072A substitution explains a major imprinted QTL effect on back fat thickness in a Meishan European white pig intercross [J]. Genet Res, 2004, 84(2): [5] Lev-Maor G, Sorek R, Shomron N, et al. The birth of an alternatively spliced exon: 3 splice-site selection in Alu exons [J]. Science, 2003, 300(5623): [6] Salgueiro S, Piguocchi C, Parry M A. Intron-mediated gusa expression in tritordeum and wheat resulting from particle bombardment [J]. Plant Mol Biol, 2000, 42(4): [7] 张伟, 刘勋成, 赵金会, 等. 水稻组蛋白脱乙酰化酶基因 HDA705 启动子的克隆与表达特性分析 [J]. 热带亚热带植物学报, 2014, 22(1): [8] 陈迪新, 李艳梅, 郭国宁, 等. 桃 PG 基因启动子克隆及序列分析 [J]. 华北农学报, 2014, 29(6): [9] 邢朝斌, 吴鹏, 修乐山, 等. 刺五加功能基因密码子偏好性的分析 [J]. 中草药, 2013, 44(5): [10] 张津京, 陈辉, 冯志勇, 等. 斑玉蕈甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析 [J]. 食用菌学报, 2011, 18(2): 5-9. [11] 杨寅桂, 娄群峰, 陈劲枫, 等. 黄瓜 CSHSP70 基因内含子结构分析 [J]. 中国农业科学, 2007, 40(12): [12] Park S J, Huh J W, Kim Y H, et al. Selection of internal reference genes for normalization of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qrt-pcr) analysis in the canine brain and other organs [J]. Mol Biotechnol, 2013, 54(1): [13] Arumugam P M, Lihuang Z, Akiyama T. Molecular cloning, characterization, expression and chromosomal location of OsGAPDH, a submergence responsive gene in rice (Oryza sativa L.) [J]. Theor Appl Genet, 2002, 105(1):

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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