论依据一材料和方法 ( 一 ) 供试菌种分离自云南省峨山县塔甸镇 (N ,E , 海拔 m) 玉米田罹病蛴螬, 编号 Ma 室内分离纯化后进行形态学与分子生物学鉴定 ( 二 ) 培养基马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基,

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高郦
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1 黄绿绿僵菌 Ma 菌株的分子鉴定及产孢特性研究云南农业大学薛锐, 刘思雨 (1. 云南农业大学植物保护学院, 云南昆明 ;) 云南农业大学学报 ( 自然科学 ) 2018 年 5 月 28 日陈斌教授中文摘要 : 对从云南省峨山县塔甸镇玉米田自然罹病蛴螬分离培养获得绿僵菌 Ma130821, 进行形态学与分子生物学鉴定, 同时对其产孢特性进行了研究结果表明绿僵菌 Ma 为黄绿绿僵菌 Metarhizium flavoviride, 以大米为基质, 在 L:8 D 光照条件下, 产孢量及孢子萌发率极显著高于其他培养条件因此, 以大米为固相产孢基质, 在 L:8 D 条件适宜于该菌株的培养英文摘要 : The biological characteristics of Metarhizium Ma was isolated from the infected grub in corn field in E shan county, Yunnan province. The strain Ma was identified based on the characteristics of morphological, cultural characteristics of microorganism colony and ITS 5.8S gene sequence, the conidial production characteristics was studied in the laboratory. Results showed that the strain Ma was identified as Metarhizium flavoviride. The conidia sporulation on the rice media and the germination rate of spores were all higher than on other solid mediums under the same culture conditions. The optimal temperature for production of spores was at 25 and the optimum photoperiod for spores production was at the 16 L:8 D photoperiod. 关键词 : 蛴螬 ; 种类鉴定 ; 黄绿绿僵菌 ; 产孢特性昆虫病原真菌是害虫生物防治的重要材料, 不同昆虫病原真菌菌株菌落生长速率产孢时间产孢量孢子萌发率及致病力是优良菌株筛选的重要指标 [1] 产孢特性是昆虫病原真菌开发研究的基础, 不同地理及不同寄主来源的昆虫病原真菌菌株产孢量存在明显差异 [2-3] 筛选适合固体产孢的条件是高毒力菌株筛选及利用的基础绿僵菌是半知菌亚门丝孢纲绿僵菌属真菌, 杀虫谱广致病性强, 是目前国内外应用最广泛的昆虫病原真菌之一, 也是害虫生防制剂开发研究的重要种类 [1] 黄绿绿僵菌 Metarhizium flavoviride 对蝗虫 [4] 褐飞虱 [5] [6] [7] 水稻二化螟和马铃薯叶甲等害虫具有良好的侵染致病作用, 已成为蝗虫生物防治的重要生防制剂 [8] 然而, 有关蛴螬黄绿绿僵菌的研究报道还很少见, 也未见自然侵染蛴螬黄绿绿僵菌菌株产孢特性的研究报道本研究以玉米田蛴螬种群中发生流行的一株黄绿绿僵菌 Ma 为材料, 通过对其在不同固体发酵培养基上的产孢量等产孢特性的研究, 筛选适于该菌株产孢的培养基质及光温条件, 为其开发利用提供理国家级大学生创新创业训练计划支持项目 ( ) 作者简介 : 薛锐 (1997-) 男, 北京人, 动植物检疫, 大三, 农业害虫综合防治研究刘思雨 (1991-), 男, 陕西扶风县人, 农业昆虫与害虫防治, 博士研究生, 主要从事昆虫病真菌研究

2 论依据一材料和方法 ( 一 ) 供试菌种分离自云南省峨山县塔甸镇 (N ,E , 海拔 m) 玉米田罹病蛴螬, 编号 Ma 室内分离纯化后进行形态学与分子生物学鉴定 ( 二 ) 培养基马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基, 萨氏培养液 SDY [1] ( 三 ) 试验方法 1. 固相产孢培养基制作与孢子粉收集 (1) 产孢培养基制作 [9] 采用液固双相法生产绿僵菌分生孢子粉首先, 将玉米粒大米麦麸稻壳分别在蒸馏水中浸泡 12 h 后沥去多余水分, 分别称取 100 g 麦麸稻壳,400 g 玉米粒大米, 均按 0.4% 的比例加入 KNO 3, 最后加入食用油 5 ml, 充分混匀, 放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌 30 min, 冷却至室温后制成固体培养基备用 (2) 固相产孢及孢子粉收集将菌株 Ma 的分生孢子粉接入萨氏培养液 SDY( 不含琼脂的 SDAY 培养基 ) 中, 使种子液的初始孢子浓度为孢子 /ml, 在 r/min 条件下振荡养培养 48 h, 然后将培养所得菌液按 1% 的接种量接入固体培养基中, 放入 25 黑暗条件下进行扩大产孢, 每天观察产孢情况, 待培养基上布满淡黄绿色分生孢子粉后即停止产孢培养然后, 将产孢盘置于 30 烘干处理 72 h 采用细粉过滤器筛取与收集孢子粉 2. 孢子粉质量检测 (1) 每克基质产粉量测定分别对不同产孢基质 (g) 以及收集到的孢子粉 (mg) 进行称重, 计算每克基质产粉量每克基质产粉量计算公式为 : 每克基质产粉量 (mg/g)= 固体培养基上收获的孢子粉重量 / 固体培养基重量 [10] (2) 不同孢子粉产孢量的测定准确称取上述孢子粉 0.1 g, 装入盛有 100 ml,0.01%tween-80 无菌水的锥形瓶内, 于 r/min 震荡 30 min, 用血球计数板计数, 如果孢子浓度过高, 适当稀释, 直到在光学显微镜 (400 ) 下能清楚看到单个孢子为止, 每个处理重复 5 次孢子粉含孢量计算公式 : 每 g 孢子粉含孢量 = 平均每小格孢子数稀释倍数 / 称量孢子粉重 [11-12] (3) 每克基质产孢数测定每克基质产孢数计算公式为 : 每克基质产孢数 = 每克基质产粉量每克孢子粉含孢量 [13] 3. 产孢温度的筛选用 1 中筛选的固体基质制作固体培养基, 分别置于和 30,16 L:8 D 光照条件下进行培养 [14-15] 待产孢完成后收集分生孢子并进行称重, 统计不同温度下固相产孢基质上孢子粉产量质量 4. 产孢光照条件筛选分别设定 16 L:8 D 和 14 L:10 D 的光周期, 利用设置的最适温度, 进行扩大培养待产孢完成后收集分生孢子并进行孢子粉产量和质量的测定, 评价方法同 2 5. 孢子粉含水量测定

3 先将 200 ml 锥形瓶在 120 干燥箱内烘至恒重准确称取 0.3 g 上述孢子粉于锥形瓶内, 至于 120 干燥箱内烘干至恒重冷却至室温后称重每个样品重复测定 3 次孢子粉含水量计算公式 : 孢子粉含水量 (%)=( 原孢子粉重量 - 烘干孢子粉重量 )/ 原孢子粉重量 100% [16] 6. 孢子萌发率的测定准确称取上述孢子粉 0.1 g, 装入盛有 100 ml,0.01%tween-80 无菌水的锥形瓶内, 将其稀释 10 倍, 制成培养液, 备用采用微室萌发法, 将悬浮液滴于凹玻片上, 盖上盖玻片, 放入垫有 3 层滤纸的培养皿中, 置于 25 光照为 L:D=16:8 的培养箱中每隔 12 h 观察一次, 统计孢子的萌发情况孢子萌发率计算公式 : 萌发率 (%)= 萌发的孢子数 / 观察孢子总数 100% [17] 7. 数据分析所有数据利用 DPS12.0 软件进行处理分析, 采用 Duncan 新复极差法比较不同温度及不同固体培养基上的产孢量等二结果与分析 ( 一 ) 基质对产孢的影响 1. 不同基质上的产孢量从表 1 看出, 黄绿绿僵菌 Ma 在 4 种固体培养基上于 25 条件下均能生长, 但是产孢量孢子粉含水量之间存在差异其中, 在麦麸培养基上, 每克基质产粉量和孢子含水量极显著高于大米玉米和稻壳培养基在大米培养基上, 黄绿绿僵菌每克孢子粉含孢量和每克基质产孢数均为最高分别为和孢子 /g, 均极显著高于麦麸培养基玉米培养基和稻壳培养基 2. 不同基质上所产分生孢子的萌发率从表 2 看出, 在 12~36 h 后, 大米培养基上生产的分生孢子的萌发率均显著高于麦麸稻壳玉米培养基所产孢子, 并且在 48 h 时, 大米培养基所产孢子累积萌发率达 99.00% 在 60h 后大米培养基所产孢子萌发率达到 % 72 h 后, 玉米培养基麦麸培养基和稻壳培养基所产孢子萌发率均达到 %

4 ( 二 ) 温度对产孢的影响 1. 不同温度下的产孢量从表 3 看出, 黄绿绿僵菌 Ma 在大米基质上于 20 条件下孢子粉含水量最高极显著高于和 30 在 25 条件下, 黄绿绿僵菌在大米基质上每克孢子含孢量最高达到孢子, 极显著高于其他温度 2. 不同温度下产生所产分生孢子的萌发率从表 4 看出, 在 h 后 25 条件所产孢子的萌发率极显著高于在第 48 h 时,25 20 条件下所产孢子的萌发率达到 % 培养到 72 h 时, 在条件下所产孢子的累积萌发率接近 %

5 ( 三 ) 光照对产孢的影响 1. 不同光周期下的产孢量从表 5 可以看出, 在 25 条件下, 黄绿绿僵菌 Ma 在两种光照条件下均能生长, 但是产孢量含水量之间存在差异其中, 在 16 L:8 D 光照条件下每克孢子粉含孢量达孢子, 极显著高于 14 L:10 D 光照条件并且在 16 L:8 D 下, 其每克基质产孢数和含水量均极显著优于 14 L:10 D 下产孢量 2. 不同光照下产生的分生孢子的萌发率测定从表 6 看出, 在和 48 h 后 16 L:8 D 条件下所产孢子的萌发率极显著高于 14 L:10 D 在 16 L:8 D 条件下于 48 h 时所产孢子的萌发率达到 % 14 L:10 D 光照条件下 60 h 后所产孢子的萌发率达到 %

6 三讨论黄绿绿僵菌已被开发用于蝗虫生物防治 [18], 对草原蝗虫种群的控制具有重要作用本研究发现该黄绿绿僵菌 Ma 菌株在大米基质上于 25,16 L:8 D 条件下, 产粉量产孢量均可达到最高, 具有良好的生防开发潜力这与许天委等 [19] 吴振强等 [20] [21] 宋龙腾的研究存在一定差异, 其原因可能在于黄绿绿僵菌多分离于褐飞虱蝗虫等, 而本试验菌株分离自罹病蛴螬, 由于寄主的差异造成产孢量的差异, 但具体原因还有待进一步研究虫生真菌孢子粉的生产多利用大米 [22], 也有些是利用粮食加工副产品如谷糠麦麸稻壳玉米粉等 [23-24], 还有研究表明可用紫茎泽兰等进行培养 [25], 但这些基质上生产的孢子粉或多或少都会因尘埃杂质而被污染, 影响孢子粉的纯度和含孢量, 影响孢子粉质量和贮存本试验利用大米玉米粒麦麸和稻壳等 4 种固体基质于不同温度和光照条件下发酵生产黄绿绿僵菌 Ma 分生孢子粉, 其产粉量含孢量含水量以及子孢子萌发率均能达到绿僵菌生产标准, 其中大米最好, 这与文献报道的丝孢纲虫生真菌菌株发 [26] 酵生产的结果相似, 其原因可能是由于大米中含蛋白质碳水化合物脂肪和维生素等物质, 能为黄绿绿僵菌的生长提供必需的营养物质此外, 该菌株在麦麸培养基上每克基质产粉量及孢子粉含水量均显著高于大米玉米和稻壳培养基, 其原因可能是由于麦麸培养基在产孢结束干燥后收孢过程中麦麸碎杂混合进入孢子粉, 而使孢子粉重量增加但有效孢子含量较低, 再加上由于麦麸颗粒较细, 在发酵过程中不易干燥, 因而收孢后进入孢子粉的麦麸颗粒较多, 且未完全干燥, 从而表现出在麦麸基质上产孢量高于大米玉米和稻壳此外, 由于其孢子粉含水量也高于大米玉米和稻壳培养基孢子粉含水量, 因而对干燥后孢子净含量则就较低, 从而有效孢子含量也较少, 不利于孢子粉的规模化生产温度光照及培养基 ph 是影响虫生真菌菌株生长产孢时间和产孢量的重要因素 [9] 本研究仅是在室内小规模的产孢结果, 在规模化产孢车间的产孢情况将是下一步深入开展研究的内容参考文献 [1] 蒲蛰龙, 李增智. 昆虫真菌学 [M]. 合肥 : 安徽科学技术出版社, [2] ANSARI M A, EVANS M, BUTT T M. Identification of pathogenic strains of entomopathogenic nematodes and fungi for wireworm control[j]. Crop Protection, 2009, 28(3): DOI: /j.cropro [3] 苏宇, 农向群, 张泽华. 绿僵菌菌株遗传多态性与地理来源及寄主种群分化的关联性 [J]. 中国生物防治, 2010,

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<4D F736F F D D2D2D31342D313038BAE92B2BD3C22D2DBCB8D6D6C9B1B3E6D5E6BEFAB6D4B6FEBBAFC3F8D3D7B3E6B5C4B6BEC1A6B2E2B6A8D3EBB8DFA1AD>

<4D F736F F D D2D2D31342D313038BAE92B2BD3C22D2DBCB8D6D6C9B1B3E6D5E6BEFAB6D4B6FEBBAFC3F8D3D7B3E6B5C4B6BEC1A6B2E2B6A8D3EBB8DFA1AD> Chinese Journal of Applied Entomology 2015, 52(3): 702 711. DOI: 10.7679/j.issn.2095 1353.2015.082 几种杀虫真菌对二化螟幼虫的毒力测定与 * 高毒力菌株的分子鉴定洪勇 1** 林华峰 1*** 岳霄霄 1 刘苏 1 叶恭银 1. 230036; 2. 310058 摘要目的 Chilo suppressalis

论依据 一材料和方法 ( 一 ) 供试菌种 分离自云南省峨山县塔甸镇 (N ,E , 海拔 m) 玉米田罹病蛴螬, 编号 Ma 室内分离纯化后进行形态学与分子生物学鉴定 ( 二 ) 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基,

论依据一材料和方法 ( 一 ) 供试菌种分离自云南省峨山县塔甸镇 (N ,E , 海拔 m) 玉米田罹病蛴螬, 编号 Ma 室内分离纯化后进行形态学与分子生物学鉴定 ( 二 ) 培养基马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基,