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1 中南大学学报 医学版! "$ ) <<-.-( " $$ 腺苷处理对热缺血死亡大鼠的供心保护 吴东凯 陈胜喜 罗万俊 蒋海河 中南大学湘雅医院心胸外科 长沙 :! $ 摘要 目的 研究腺苷处理对热缺血死亡大鼠供心的影响及可能机制 方法 大鼠被随机分为 组 组为正常心脏对照组 组! 组分别于心脏停搏后热缺血! 及 " + 取心 以 62! 液灌注 " + 后行颈部异位心脏移植 组! 组分别于心脏停搏后热缺血! 及 " + 取心 以加入腺苷的 62! 液 腺苷浓度为!. ++,< 灌注 " + 后行颈部异位心脏移植 移植术后 : 取移植心脏标本 观察其超微结构改变 检测心肌组织三磷酸腺苷 ()() 67 超氧化物歧化酶 ()(+( 丙二醛 +,,- 核转录因子 =,2 () *2=)+3 +8 肿瘤坏死因子 +((*2 6;2 白细胞介素 4, 的含量 结果 与 组! 组相比 组! 组心肌组织的 67 和 含量增加 含量减少 )+3+8 的表达水平下降 6;2 和 24 含量减少 均有统计学意义 $E. 结论 腺苷处理对热缺血死亡大鼠供心具有保护作用 其机制可能与改善供心的能量代谢 减轻脂质过氧化损伤 抑制 )+3+8 表达及减少炎性因子的生成有关 关键词 心脏移植 心脏保护 热缺血 腺苷 大鼠!."949 <0.(.!4 2":.!. $.!9 * -- 0 & % %%""%&% (&! %! % & :! $ $()*6+) *(+ 2 ( + (+.+ 8(+,- )(.&) (,).&)! " 6(*+ ( * +( + (+(*! " + (),- ()*( 62! *" + *,)(),. &)! " (+)( ( (+2 )*( 62! ),(( (!. ++,< *,)(),. **(,,(2,,*67 )+3+8 6;2 24 : *(2 ),.%!(++) +) &)! " &)! " ( ( 67 +-,(( ( ) ;2 24 $E..!(+ )* 收稿日期 9 % : %" 作者简介 吴东凯 博士 主治医师 主要从事心胸外科疾病的研究 通信作者! 陈胜喜 2+,-!5-.+. 基金项目 "! 湖南省科技厅项目 4?" 92 6( (()) -; *)+* 6,-* ?" 92.

2 $$4 中南大学学报 医学版! "$ ) <<-.-(+. ( + (+.6+(+ +-+)+-,-+2,(+,) ) 0- ())()( *)+3 +8 ( *,++-+*6;2 24., -(),)+ (+(( 腺苷 ( 作为机体一种重要的内源性活性物质 广泛存在于各种组织和体液之中 有!2 研究显示 腺苷参与了缺血预处理以及缺血后 " 处理的触发和调节机制 ( 等的研究认为 应用外源性腺苷可以减轻缺血 < 再灌注损伤的程度 缩小心肌梗死面积 显示其心肌保护作用 心脏移植注定其在手术过程中存在缺血 < 再灌注损伤 如何减轻上述损伤 更好地使移植心恢复功能 是移植研究中的重点 而腺苷在心脏移植方面应用的研究少见报道 因此 本研究拟通过对供心进行腺苷处理 来研究其对热缺血死亡大鼠供心心脏保护情况及探讨其可能的机制. / 材料与方法!.! 实验动物健康清洁级 )2,- 大鼠 雄性 体质量 J 由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供!. 实验仪器 /72! 手术显微镜为上海医用光学仪器厂产品 常规手术器械及显微手术器械各一套 四导生理记录仪 824 为日本? 公司产品 恒速输液泵为德国贝朗公司产品 =" 双目摄影生物显微镜为麦克奥迪实业公司产品 透射电镜 2 型 <2!" 型 为日本日立公司及日本株式会社产品 (! 高效液相色谱仪为美国 ( 公司产品 三锐色谱工作站为上海三锐公司产品 天美 $ 型分光光度计为上海天美科学仪器有限责任公司产品 78 仪 系杭州博日科技有限公司产品 系北京鼎国生物技术发展中心生产 电泳仪 2$ 系北京六一仪器厂生产!." 实验试剂!.".! 动物模型建立试剂! A 水合氯醛溶液及 62!.6+((2 ),(,(! 液为中南大学湘雅医院药剂科配制 肝素钠注射液为南京新百药业有限公司产品 腺苷注射液系沈阳光大制药有限公司产品 辽宁诺康医药公司提供 国药准字 " "!!.". 检测项目试剂三磷酸腺苷 67 为美国 + 公司产品 超氧化物歧化酶 丙二醛 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品 6( 为瑞士 8 公司产品 和 67 为上海生工生物技术有限公司产品 61 酶为上海申能博彩生物技术有限公司产品 为日本 6 公司产品 66 和! =8& 为美国 + 公司产品 8( 及琼脂糖为美国 7+ 公司产品 6;2 和 24 检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品 其余试剂均由长沙丽欣生物技术公司提供!.: 分组将大鼠随机分为 组 组 4 只 其余每组 4 对 具体分组如下 组为正常心脏对照组 组分别为心脏停搏后热缺血! 及 " + 取心移植组 组分别为心脏停搏后热缺血! 及 " + 取心移植并给以腺苷处理组!. 动物模型建立方法!..! 组动物模型将大鼠麻醉 固定 消毒后行腹部正中切口 显露下腔静脉 注入 <+ 肝素生理盐水! + 肝素化 剪开下腔静脉放血 沿腋前线剪开 将整个前胸壁向上翻起 自膈下下腔静脉进针 快速注入 : B 62! 液 4 + 同时向胸腔内置入冰屑 使心脏迅速停搏 分别游离左 右上腔静脉及下腔静脉 结扎 分离升主动脉和肺动脉 紧靠无名动脉起始部离断升主动脉 在肺动脉分叉处离断肺动脉 将心脏其余血管集束结扎 切断 摘除心脏 制备标本!.. 缺血再灌注组 组! 组 " 组 动物模型清洁级手术 供体用多道生物信息分析系统监测心电图 开始步骤同上述 待心率稳定后横断腹主动脉放血 制造失血性休克 至心电示波消失 认为死亡 心脏停搏达到预定时间! 及 " + 取心备用 取心过程同 组 供心

3 腺苷处理对热缺血死亡大鼠的供心保护 吴东凯 等 $$ 取出后放于 : B 生理盐水中 以输液泵连接供心升主动脉 置入 : B 恒温冰箱 以 62! 液灌注 " + 之后采用 * 技术行颈部异位心脏移植 : 即供心升主动脉和肺动脉干分别与受体右侧颈总动脉和颈外静脉采用套管法套扎固定 缓慢开放静脉及动脉血管夹 移植心自动复跳或经过短暂室颤后转为规则跳动 调整移植心位置防止血管扭曲 观察 J! + 待心率稳定 无明显渗血后 缝合切口 手术当天单笼饲养 喂食 A 糖盐水 不用抗生素 次日恢复普通饲养 通过视诊或触诊方法来观察移植心的搏动情况 按 等的标准 移植心脏术后早期心跳有力 心率! J 次 <+ 心脏有弹性且不硬胀 提示移植成功 心跳如果缓慢无力或心脏饱胀变硬或触不到心跳 则提示移植失败!.." 腺苷处理组 组! 组 " 组 动物模型供心取出后放于 : B 生理盐水中 以输液泵连接供心升主动脉 置入 : B 恒温冰箱 以加入腺苷的 62! 液 腺苷浓度为!. ++,< 4 灌注 " + 之后行心脏移植 移植步骤同缺血再灌注组!.4 移植物标本获取心脏移植术后 : 麻醉受体 采用清洁级手术原则 固定 打开受体原颈部手术切口 显露移植心 剪断颈动 静脉套管 取下移植心置入 : B 的 62! 液中 立即进行心肌标本的制取!. 检测方法及步骤!..! 透射电镜检查超微结构心肌标本获取后进行固定 包埋 制成超薄切片 行双重电子染色后以透射电镜观察 照片!.. 心肌组织 67 及 含量的测定用高效液相色谱法测定心肌组织 67 含量 用黄嘌呤氧化酶法 以 试剂盒测定心肌组织 含量 用硫代巴比妥酸反应法 以 试剂盒测定心肌组织 含量!.." 法检测 )+3+8 的表达引物序列 采用巢式引物 )+3 上游引物! C2666&&&6&&&& 2" C C2 &&&&&&66&6& 2" C 下游引物! C2&6&666&& 2" C C262 &&6&6&&62" C 扩增片段长度为 9 ) 2 上游引物! C2&&&&&2 &62" C C2&&&&6&6&&6&2" C 下游引物 C266&6&&&&6&&2" C 扩增片段长度为 :": ) 操作步骤! 8 提取 反转录 " 78 将 体系 上游引物 下游引物 67, ++,<!."! 78 = * 61 7,-+(. $. 进行扩增 即 9" B " + 9" B : ( 4 B : ( B (" 个循环 B 延伸 $ + : 产物用琼脂糖电泳检测 即取扩增产物 与! 加样染料及!! =8 荧光染料混合后 直接加样 进行电泳 约 " + 电泳完毕后染色 在紫外灯下观察 测定电泳各条带吸光度值 )+3 +8 表达值 )+3 吸光度值 <2 吸光度值!..: 法检测 6;2 和 24 含量应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中 6;2 和 24 水平!.$ 统计学处理所有数据以均数 D 标准差 D 表示 用 7!". 统计软件分析 比较两组之间的差异采用 检验 多组间的差异比较采用方差分析 以 $E. 表示差异有统计学意义 / 结 // 果.! 大鼠心脏移植术后情况各组大鼠术后均顺利存活 :. 大鼠心肌超微结构的变化 组心肌可见肌原纤维排列整齐 细胞核 线粒体结构完整 组 心肌肌原纤维排列明显稀疏 断裂 基质密度变淡甚至线粒体水肿 肌纤维的肌丝结构略模糊! 组 心肌肌原纤维排列稀疏 断裂更加明显 灶性肌丝溶解 线粒体水肿空泡化 部分心肌细胞核固缩 " 组 线粒体空泡化更加明显 部分破裂 部分心肌细胞核固缩 肌丝结构模糊 稀疏明显 局部可见灶性无结构区 组 肌纤维走向规则 部分线粒体轻度水肿 心肌受损程度较 组轻! 组 线粒体水肿增多 部分线粒体嵴丢失 肌纤维走向尚规则 少部分肌纤维结构模糊肿胀 断裂 但程度较! 组轻 " 组 肌丝结构模糊 扭曲断裂 较多线粒体水肿或空泡化 但程度仍较 " 组轻 图!

4 666 中南大学学报! 医学版" !6" 00)% % A$ `` ^ JE ^ F^ CF$ % ](J)Y$%<^TP_] Q390(*9(.%7MY"%<Z,[\H=DU6 M"%<QVW7XLTTUU7= 2()J1Q$;3R39)3(;<1SD>U66 L;O39)%OPQ$;3R39)3(;<SDT666 L"$%1M"%<1N0"% I%*(J/)3(;<1=6D>K=6D>1.3-%J* 89:/3*3)3(;7C)%<7DE6FGDHD@ 89:/3*3)3(;123"%<=>?@@A>B I%*(J/)3(;<P=TD>j=TD>P.3-%J* 89:/3*3)3(;PCY)%<PDTTFGDGD@ 89:/3*3)3(;P23"%<=Uh>UiUU W ](J)Y$%<^TP_] Q390(*9(.%PMY"%<Z,[\G=DUT MY"%<QVWPVLTTUUP= 2()YJPQY$;3R39Y)3(;<PkD>UTT L;O39Y)%OPQY$;3R39Y)3(;<kDTTTT I%*(J/)3(;<P=TD>t=TD>P.3-%J* 89:/3*3)3(;PCY)%<PDTTFGDGD@ 89:/3*3)3(;P23"%<=>qTrsDF, f(j)y$%<^tp_f Q390(*9(.%PMY"%<Z,[\G=DUT MY"%<QVWPVLTTUUP= 2()YJPQY$;3R39Y)3(;<PSD>UTT L;O39Y)%OPQY$;3R39Y)3(;<SDTTTT f(j)y$%<^tp_f Q390(*9(.%PMY"%<Z,[\G=DU6 MY"%<QVWPVL66UUP= 2()YJPQY$;3R39Y)3(;<PSD>U66 L;O39Y)%OPQY$;3R39Y)3(;<SD6666 I%*(J/)3(;<P=6D>e=6D>P.3-%J* 89:/3*3)3(;PCY)%<PD66FGDGD@ 89:/3*3)3(;Pb3"%<=Uc>^d@F f(j)y$%<^tp_f Q390(*9(.%PMY"%<Z,[\p=DUT MY"%<QVWPVLEEUUP4 2()YJPQY$;3R39Y)3(;<Pko>UEE L;O39Y)%OPQY$;3R39Y)3(;<koEEEE I%*(J/)3(;<P=TD>n4Eo>P.3-%J* 89:/3*3)3(;PCY)%<PDTTFGDGD@ 89:/3*3)3(;P23"%<=>lT^mTU,-.(*/0%P23"%<=a6P*,-.(*/0%P23"%<=aTP* 8,-.(*/0%123"%+4567*!"$%&()%*+,-.(*/0%P23"%<=aTP*,-.(*/0%P23"%<=aTP* g C N u 图 FG各组心肌超微结构改变$ dku UUU% + ]$+5 组% a$]5 组% "$+35 组% =$]35 组% O$+42 组% Y$]42 组%8$"组4* -JFG0."+-$ 1* +5/%( " 2* ">3> "1 3( 3 $%&$ "(.- %3)$ dku UUU% J]$8> (A +5 % a$8> (A ]5 % "$8> (A +35 % =$8> (A ]35 % O$8> (A +42 % Y$8> (A ]42 % 8$8> (A "F

5 腺苷处理对热缺血死亡大鼠的供心保护 吴东凯 等 $$9." 心肌组织 67 及 含量的测定与 组相比 组 " 组 组! 组心肌组织 67 含量均有降低 含量减低 含量增加 差异均有统计学意义 $E. 组的 67 含量 含量比 组高 含量比 组低 二者比较差异均有统 计学意义 $E.! 组的 67 含量 含量比! 组高 含量比! 组低 二者比较差异均有统计学意义 $E. " 组的 67 含量 含量比 " 组高 含量比 " 组低 二者比较差异均有统计学意义 $ E. 表! 表./ 各组心肌组织 $&( 及 +$ 含量的比较 ;4 &./$& ( +$!! ;4 组别 67 含量 <<! + 含量 <<+) 含量 <+,<+) $ 与 组比较 $ 与相应 组比较 组!. D."". D."!." D.! 组!.!4 D.::.$ D.: :.9 D.:! E. E. 组!:.$ D.:9 4. D.!9 ".9 D.!" E.! 组!."9 D.:" :.$ D.!$ 4.9 D.! E. E.! 组!.!! D.:.! D.!.: D. E. " 组 $.!$ D.$ ".! D.!4 9.:4 D."" E. E. " 组 9.49 D." ".99 D.$ $."4 D.4 E..: 心肌组织 )+3+8 表达及 6;2 和 24 含量的比较与 组相比 组 " 组 组! 组心肌组织 )+3+8 表达水平均增高 图 6;2 和 24 含量增高 差异比较均有统计学意义 均 $E. 组的 )+3 +8 表达水平 6;2 和 24 含量比 组低 二者比较差异均有统计学意义 均 $E.! 组的 )+3 +8 表达水平 6;2 和 24 含量比! 组低 二者比较差异均有统计学意义 均 $E. " 组的 )+3 +8 表达水平 6;2 和 24 含量比 " 组低 二者比较差异均有统计学意义 均 $E. 表 表 / 各组心肌组织 &%0$ 表达 &0" 和 4 含量的比较 ;4 &/&%0$ &0" 4!! ;4 组别 )+3+8 表达水平 6;2 含量 <)<+ 24 含量 <)<+ $ 与 组比较 $ 与相应 组比较 组.! D."!. D.9!. D!.! 组.:! D.: 9.9! D!.:9.! D.9" E. E. 组.$ D. 4."! D.9$!4. D!.! E.! 组.4 D.4 :.!" D!.: 9." D!.$ E. E.! 组.:9 D. "."9 D!.44 ".9! D!.44 E. " 组.9" D.9 4. D!.9 ".4: D!.4 E. E. " 组. D. :!.:9 D.9 $.!! D.$9 E.

6 $9 中南大学学报 医学版! "$ ) <<-.-(+.!"$ 图 /%&% 检测各组心肌组织 &%0$ 表达的情况 +! 组 组 " 组 :! 组! 组 4 " 组 " 组 "/&%0$ %&%!!+!&) &) "&) :&)! &)! 4&) " &) ". / 讨 // 论 当供心移植完毕 血流重新恢复灌注时 供心的心肌细胞内可发生一系列变化 从而导致供心缺血 < 再灌注损伤的发生 其可能机制包括 大量氧自由基的快速生成 2 交换的激活以及其他原因导致 超载 炎性反应 此外补体系统等也参与其中 移植后缺血 < 再灌注损伤可引起供心的血管内皮细胞 < 心肌细胞 < 微血管损伤 心肌细胞代谢紊乱 造成心脏移植早期功能损害甚至供心功能衰竭 $ 腺苷广泛分布于机体各个组织和器官 通过与! = 和 " : 种腺苷受体结合发挥其对各种应激情况的调控作用 9 目前认为在心肌细胞中至少有! = 和 " " 种受体的表达 而 受体虽然在心肌细! 胞内难以检测到 却在冠状血管中广泛存在 已证实腺苷参与了心肌缺血 < 再灌损伤的心肌保护!2 本研究显示 与 组比较 组心肌组织超微结构的损伤减轻 说明腺苷处理对热缺血死亡大鼠供心具有保护作用 与 组比较 组及 " 组心肌组织 67 含量均有增加 $E. 说明腺苷处理可改善供心的能量代谢 心脏移植后供心功能的恢复与心肌细胞内 67 的储备 合成 消耗有密切关系 热缺血时 67 生成减少 进入细胞内 细胞肿胀 线粒体 内质网等细胞器相应肿胀 而 67 的缺乏又使心肌细胞的离子转运发生障碍 更加重了能量代谢的障 碍 使供心功能受损 腺苷应用可提高缺血心肌细胞的 67 水平 通过! 腺苷受体介导的抗亲脂效应可以稳定细胞膜 减少细胞内乳酸产生和细胞内酸中毒的程度 并可以通过激活! 受体抑制去甲肾上腺素从交感神经末梢的释放 发挥其负性变时和变力作用!! 减少心肌细胞对氧的消耗 保存能量供应 从而保护供心 缺血 < 再灌注损伤的一个重要特点就是大量氧自由基的生成 是最重要的抗氧化酶 可有效清除机体内多余的氧自由基 而 可以间接反映脂质过氧化的程度 本研究显示 与 组比较 组心肌组织 含量增加 含量减少 $ E. 说明腺苷处理可以减轻供心在再灌注后的脂质过氧化 可能机制包括腺苷通过与 受体作用减少由中性粒细胞产生的超氧阴离子 抑制去甲肾上腺素从交感神经末梢! 受体介导 的释放和血小板 受体介导 血栓素的生成 进一步减少氧自由基的产生 还可以减弱由! 受体介导的脂解作用 稳定细胞膜 减轻脂质过氧化损伤! 从而保护供心 ;2= 是一组重要的蛋白 广泛调控着一系列基因表达 尤其是免疫反应 应激反应等相关的基因 心脏单纯性短暂缺血即可引起 ;2= 的活性迅速而显著地增高 而缺血 < 再灌注则可使其活性进一步升高 说明 )+3 是心脏应激反应快速表达基因 其激活因素 目前认为其在缺血和再灌注阶段均由氧自由基激活 ;2= 激活后可导致众多炎性细胞因子如 6;2 2! 2 24 及 2$ 等大量生成 引起心肌的炎症反

7 腺苷处理对热缺血死亡大鼠的供心保护 吴东凯 等 $9! 应 损伤 坏死以及凋亡!" 如 6;2 可以直接造成心脏的血管内皮细胞以及心肌细胞的损伤 降低心肌的收缩功能 甚至导致心功能衰竭!: 同样 24 作为一种重要的炎性细胞因子 也可引起心肌细胞结构和功能的损害! 此外 研!4 究显示 中性粒细胞及血管内皮细胞也是缺血 < 再灌注过程重要的参与者 二者单独或相互作用时均可导致大量炎性介质如 6;2 2! 24 及 2$ 等的生成 从而导致心肌损伤,! 等的研究显示 腺苷以及 受体选择性的激动剂可以减少中性粒细胞在血管内皮表面上的 滚动 从源头上抑制中性粒细胞对血管内皮细胞的黏附以及两者的相互作用 本研究显示 与 组! 组比较 组! 组心肌组织 )+3+8 表达水平 6;2 和 2 4 含量降低 $E. 说明腺苷可能一方面通过减少氧自由基的生成 降低心肌组织 )+3 +8 的表达水平 另一方面抑制中性粒细胞对血管内皮细胞的黏附以及两者的相互作用 使心肌组织内 6;2 和 24 含量减少 从而减轻缺血 < 再灌注所致的炎性损伤 发挥其对供心的保护作用 综上所述 本研究表明 腺苷处理对热缺血死亡大鼠供心具有保护作用 其机制可能与其改善供心的能量代谢 减轻缺血 < 再灌注所致的心肌组织脂质过氧化损伤 减少缺血 < 再灌注心肌 )+3+8 的表达水平以及心肌 6;2 和 24 的含量有关 但具体机制尚待进一步研究 参考文献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本文编辑 陈丽文

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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