Microsoft Word doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word doc"

泔逄
5 years ago
Views:

1 山楂叶总黄酮对实验性大鼠心肌缺血的作用及其机制研究闵清, 白育庭, 余薇, 田庆龙, 劳超, 张羽萍 ( 咸宁学院药学院, 湖北咸宁 ) 摘要 : 目的研究山楂叶总黄酮对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血的保护作用及其作用机制方法取健康 SD 大鼠,,48 只, 随机分为正常对照组阳性对照组模型组及山楂叶总黄酮组 (50,100,200 mg kg ), 采用异丙肾上腺素 ( 给药剂量 10 mg kg, 每日 1 次, 连续 2 d) 造成大鼠急性心肌缺血模型, 观察急性心肌缺血大鼠心电图的变化, 测定血浆的乳酸脱氢酶 (LDH) 和肌酸激酶 (CK) 心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD) 过氧化氢酶(CAT) 和脂质过氧化物丙二醛 (MDA) 的含量, 并观察心肌缺血大鼠心肌形态学变化结果与模型组相比, 山楂叶总黄酮 (50,100,200 mg kg ) 均可有效对基金项目 : 咸宁学院重点研究项目 (XY ) 作者简介 : 闵清, 女, 博士, 教授 Tel:(0715) baimin0628@163.com 中国现代应用药学 2011 年 2 月第 28 卷第 2 期 Chin JMAP, 2011 February, Vol.28 No.2 95

2 抗异丙肾上腺素所致急性大鼠心肌缺血心电图 ST 段的抬高, 降低血浆 LDH 和 CK 活力 (P<0.05 或 P<0.01), 增加心肌组织 CAT 和 SOD 的活力 (P<0.05 或 P<0.01), 并减少 MDA 生成 (P<0.05 或 P<0.01), 减轻心肌病理变化结论山楂叶总黄酮对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血具有一定的保护作用, 其机制可能与其抗氧化作用有关关键词 : 山楂叶总黄酮 ; 异丙肾上腺素 ; 心肌缺血中图分类号 :R285.5 文献标志码 :A 文章编号 : (2011) Protective Effect and the Mechanisms of Crataegi Folium Flavonoids on Myocardial Ischemia in Rats MIN Qing, BAI Yuting, YU Wei, TIAN Qinglong, LAO Chao, ZHANG Yuping(The Pharmacy School of Xianning University, Xianning , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To study the protective effects and the mechanisms of Crataegi Folium flavonoids (CFF) on acute myocardial ischemia induced by isoproterenol in rats. METHODS The 48 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, positive control group, model group and the group of CFF(50, 100, 200 mg kg ). Myocardial ischemia model of rats were induced by subcutaneous injection of isoproterenol(10 mg kg for each time, once a day, and lasted for 2 days). The change of electrocardiogram(ecg) was observed. The levels of lactate dehydrogenase(ldh), cmatine kinase(ck) in blood plasma, the activity of superoxide dismutase(sod), catalase(cat), and the content of malondialdehyde(mda) in myocardial tissue were measured. The changes of myocardial morphology were observed as well. RESULTS Compared with the model group, CFF(50, 100, 200 mg kg ) could effectively fight against ST-segment elevation induced by isoproterenol, notably decrease serum LDH and CK enzymic activity, distinctly increase the levels of CAT and SOD in myocardial tissue(p<0.01 or P<0.05), significantly decrease the content of MDA in myocardial tissue, and relieve morphological changes of myocardial. CONCLUSION CFF has a protective effect on acute myocardial ischemia induced by isoproterenol in rat, the protective mechanisms of CFF may be related to anti-oxidation. KEY WORDS: Crataegi Folium flavonoids; isoproterenol; myocardial ischemia 山楂叶总黄酮 (Crataegi Folium flavonoids, CFF) 系蔷薇科植物山楂 (Crataegus pinnatifida Bge.) 叶子中的主要活性成分之一现研究表明 CFF 对心血管系统有明显的药理作用, 能使冠状动脉扩张, 有降血脂降血压抗氧化和强心作用, 能改善心脏活力和兴奋中枢神经系统 [1-2] 本课题组也证明 CFF 能改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能作用, 对心肌缺血再灌注损伤大鼠有保护作用但 CFF 对异丙肾上腺素致急性心肌缺血大鼠是否有保护作用研究不多本试验旨在通过观察 CFF 对异丙肾上腺素诱发的急性心肌缺血大鼠的保护作用及其机制探讨, 进一步阐述 CFF 的药理作用, 为临床合理应用提供科学的理论依据 1 仪器与试剂 1.1 药品与试剂 CFF( 山西省晋城中晋药业有限公司, 批号 : , 纯度 :95%); 血浆乳酸脱氢酶 (LDH, 批号 :080312) 肌酸肌酶(CK, 批号 :080305) 超氧化物歧化酶 (SOD, 批号 :080315) 过氧化氢酶 (CAT, 批号 :080408) 丙二醛(MDA, 批号 : ) 考马斯亮( 批号 :080722) 等检测试剂盒, 均购于南京建成生物工程研究所 ; 丹参注射液 ( 正大青春宝药业, 批号 :080602, 规格 :10 ml 10 g); 盐酸异丙肾上腺素注射液 (ISO, 批号 :070702, 上海禾丰制药有限公司, 规格 :2 ml 1 mg); 其余的试剂均为市售分析纯 1.2 实验动物健康 SD 大鼠,,48 只, 体重 (220±25)g, 由咸宁学院医学实验动物中心提供 ( 购于华中科技大学实验动物中心 ), 实验动物合格证号 : 随机分为 6 组, 即正常对照组, 阳性对照组, 模型组,CFF 高中低剂量组, 每组 8 只 1.3 仪器 ECG-6511 型心电图机 ( 上海光电医用电子仪器有限公司 );ECG-6511 显微镜 ( 德国莱卡 DME 型 );TECAN SUNRISE 酶标仪 ( 美国 ) 2 方法 2.1 实验分组与给药方法 CFF 低中高剂量组分别腹腔注射 CFF 50, 100, 200 mg kg, 阳性对照组腹腔注射丹参 0.2 g kg ; 模型组正常对照组分别腹腔注射生理盐水和蒸馏水 10 ml kg 各组每天给药 1 次, 连续给药 7 d [3-4] 2.2 心肌缺血模型制作 96 Chin JMAP, 2011 February, Vol.28 No.2 中国现代应用药学 2011 年 2 月第 28 卷第 2 期

3 除正常对照组外, 各组大鼠每天皮下注射 ISO 1 次, 每次给药剂量为 10 mg kg, 连续 2 d, 制作大鼠实验性心肌缺血模型, 正常对照组大鼠皮下等量多点注射生理盐水 2.3 心电图监测于第 2 次皮下注射 ISO 后, 用 20% 乌拉坦 (1 g kg ) 麻醉大鼠固定后, 于四肢皮下插入针形电极, 连接心电图机, 连续测量大鼠 Ⅱ 导联体表心电图分别记录第 7 天皮下注射盐酸 ISO 后在 5,10, 15,20,25,30 min, 连续心电监测大鼠 Ⅱ 导联心电图 ( 纸速 50 mm s, 增益 l mv=10 mm), 分析大鼠心电图 ST 段的变化情况 2.4 生化指标的测定心电图检测完后, 大鼠眼眶取血 2~3 ml, 并于 r min 下离心 15 min, 制备血浆按照试剂盒说明书, 用酶标仪测定 LDH 和 CK 的活力同时取大鼠心脏左心室在冰浴生理盐水中泵出淤血后, 取一部分用生理盐水制成 10% 组织匀浆, 在 r min 下离心 15 min, 取上清液, 按试剂盒说明书, 用酶标仪测定 SOD,CAT 活力和 MDA 含量, 并用考马斯亮兰法测定大鼠心肌组织蛋白含量 2.5 心肌形态学检查取左心室心尖部分, 置于 10% 甲醛溶液中固定 14~18 h 常规石蜡包埋 [5], 于缺血心肌中部沿左心室轴线每个 1 mm 连续切取数个 5 μm 厚的切片, 分别做苏木素 - 伊红 (HE) 染色, 光学显微镜下观察心肌细胞形态学变化 2.6 统计学方法所有数据以 x s 表示, 采用 SPSS 11.5 统计分析软件处理采用单因素方差分析进行多组间显著性检验, 两组间样本均数比较采用 t 检验,P<0.05 表示差异有统计学意义 3 结果 3.1 CFF 对急性心肌大鼠心电图 ST 段变化的影响分析大鼠心电图 ST 段的变化情况, 结果见表 1 由表 1 可知, 与正常对照组相比较, 各组大鼠皮下注射 ISO 10 mg kg 造成心肌缺血模型后,ST 段均显著抬高 (P<0.05), 表明心肌受损伤与模型组比较,CFF 低中高剂量组,ST 段抬高的变化值均显著下降 (P<0.05), 说明 CFF 低中高剂量组对心肌缺血均有一定的保护作用 ; 但低剂量与中高剂量相比, 改善作用不如中高剂量好, 且高剂量的效果更显著 (P<0.05), 中高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义表 1 CFF 对急性心肌大鼠心电图 ST 段变化的影响 (n=8, x s ) Tab 1 The effect of CFF on electrocardiogram ST of myocardial ischemia in rats(n=8, x s ) 组别 ST 段变化 /mv 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 正常对照组 0.15± ± ± ± ± ±0.01 模型组 0.42±0.02 1) 0.43±0.03 1) 0.44±0.03 1) 0.40±0.02 1) 0.38±0.02 1) 0.39±0.02 1) 阳性对照组 0.28±0.01 2) 0.27±0.01 2) 0.28±0.01 2) 0.26±0.01 2) 0.23±0.02 2) 0.24±0.02 2) CFF 低剂量组 0.32±0.02 2) 0.32±0.03 2) 0.31±0.03 2) 0.28±0.01 2) 0.31±0.02 2) 0.30±0.01 2) CFF 中剂量组 0.26±0.02 2) 0.30±0.02 2) 0.29±0.01 2) 0.27±0.01 2) 0.28±0.02 2) 0.26±0.01 2) CFF 高剂量组 0.25±0.01 2) 0.26±0.01 2) 0.27±0.01 2) 0.25±0.01 2) 0.25±0.01 2) 0.24±0.02 2) Note: Compared with normal control group, 1) P<0.05; compared with model group, 2) P< CFF 对急性心肌缺血大鼠血浆 LDH CK 活力变化的影响与正常对照组比较, 模型组大鼠血浆的 LDH, CK 活力明显增高 (P<0.01), 表明模型组大鼠心肌已受损伤, 实验性急性大鼠心肌缺血模型制作成功与模型组比较, 丹参 CFF( 高中低剂量 ) 给药后, 大鼠血浆的 LDH,CK 活力明显降低, 且 CFF 高中低剂量组之间有一定的剂量依赖性, 与阳性对照组比较无统计学意义结果见表 CFF 对急性心肌缺血大鼠心肌组织中 SOD 和 CAT 活力及 MDA 含量的影响大鼠心肌组织中 SOD 和 CAT 活力及 MDA 含量的变化见表 3 与正常对照组比较, 模型组大鼠心肌组织中 MDA 含量明显增大 (P<0.01),SOD 和 CAT 活力明显降低 (P<0.01); 与模型组比较, 丹参 CFF( 高中低剂量 ) 给药后, 明显降低大鼠心肌组织中 MDA 含量 (P<0.01), 显著增加大鼠心肌组织中 SOD 和 CAT 活力 (P<0.01), 且 CFF 高中低剂量组之间有一定的剂量依赖性, 与阳性对照组比较无统计学意义中国现代应用药学 2011 年 2 月第 28 卷第 2 期 Chin JMAP, 2011 February, Vol.28 No.2 97

表 2 CFF 对急性心肌缺血大鼠血浆 LDH CK 活力变化的影响 (n=8, x s ) Tab 2 The effect of CFF on plasma CK, LDH of myocardial ischemia in rats(n=8, x s ) 组别 LDH/U L CK/U ml 正常对照组 1 461.67± 28.01 2.899±0.104 模型组 3 055.

4 表 2 CFF 对急性心肌缺血大鼠血浆 LDH CK 活力变化的影响 (n=8, x s ) Tab 2 The effect of CFF on plasma CK, LDH of myocardial ischemia in rats(n=8, x s ) 组别 LDH/U L CK/U ml 正常对照组 ± ±0.104 模型组 ± ) 5.108± ) 阳性对照组 ± ) 3.228± ) CFF 低剂量组 ± ) 3.621± ) CFF 中剂量组 ± ) 3.432± ) CFF 高剂量组 ± ) 3.129± ) Note: Compared with normal control group, 1) P<0.05; compared with model group, 2) P<0.05 表 3 CFF 对急性心肌大鼠心肌组织中 SOD 和 CAT 活力及 MDA 含量的影响 (n=8, x s ) Tab 3 The effect of CFF on MDA, SOD, CAT of myocardial ischemia in rats(n=8, x s ) 组别 SOD/ CAT/ U mg prot MDA/ U mg prot nmol mg prot 正常对照组 ± ± ±0.088 模型组 ± ) 5.503± ) 2.827± ) 阳性对照组 ± ) ± ) 2.036± ) CFF 低剂量组 ± ) 9.202± ) 2.310± ) CFF 中剂量组 ± ) 9.459± ) 2.036± ) CFF 高剂量组 ± ) ± ) 1.905± ) Note: Compared with normal control group, 1) P<0.05; compared with model group, 2) P< 大鼠心肌形态学变化正常对照组光镜下可见心肌纤维排列整齐, 横纹清晰, 心肌及内膜细胞连续完整, 胞核居中, 胞浆着色均匀, 无细胞肿胀及炎性细胞浸润, 未见明显的组织学改变 ; 模型组光镜下可见心肌纤维肿胀, 肌横纹消失, 心肌间质灶性出血, 空泡变性明显血管淤血, 管腔增大内膜细胞局部排列紊乱, 核肿胀变圆甚至脱失, 间质水肿, 有较多炎细胞浸润, 组织间隙明显增宽 ; 阳性对照组较模型组改变轻微心肌纤维轻度肿胀, 局灶性断裂, 少量空泡变性内膜组织连续, 间质轻度水肿, 炎细胞浸润明显, 组织间隙增宽 ;CFF 高剂量组改善最明显, 光镜下可见组织学轻微改变, 心肌纤维排列整齐, 结构尚好, 心肌及内膜细胞排列整齐, 间质轻度水肿, 少量炎细胞浸润, 组织间隙轻度增宽 ;CFF 低剂量组光镜下较模型组改变轻微心肌纤维轻度肿胀, 局灶性断裂, 少量空泡变性心肌及内膜细胞排列尚可, 间质水肿, 少量炎细胞浸润, 组织间隙结果见图 1 图 1 CFF 对急性心肌大鼠心肌细胞形态变化的影响 A 正常对照组 ;B 模型组 ;C CFF 低剂量组 ;D CFF 高剂量组 ;E 阳性对照组 Fig 1 The effect of CFF on myocardial morphology of myocardial ischemia in rats A normal control group; B model group; C CFF low-dosage group; D-CFF high-dosage group; E positive control group 4 讨论 ISO 为人工合成的 β 受体强激动剂, 大剂量应用能诱导心肌产生不可逆的缺血性损伤模型, 其机制与脂质过氧化损伤膜通透性改变增加心肌耗氧量心肌钙超载等因素有关 [6-7] 心肌缺血时常伴有心电图的异常变化, 如 T 波高耸,J 点的偏移等, 因此常将 T 波 ST 段变化值作为评价心肌缺血损伤程度的重要指标心肌缺血时氧自由基大量产生, 组织内抗氧化能力下降, 氧自由基与细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸反应, 发生脂质过氧化其过氧化产物 MDA 对细胞膜有很强的破坏作用, 使其流动性和通透性发生变化, 细胞内外离子分布异常, 进而抑制心功能, 最终导致心肌细胞从可逆性损伤发展为细胞死亡 CK 和 LDH 从坏死的心肌细胞中漏出, 而且心肌缺血或心肌受损时血清 CK 和 LDH 含量增加, 并与心肌损伤程度正相关 [8-9] 本试验结果表明: 模型组, 可见大鼠 Ⅱ 导联心电图 T 波高耸,ST 段显著上抬, 血浆 CK 和 LDH 明显升高, 表明大鼠心肌明显受损伤 CFF 高中低剂量组均能很好的抑制大鼠心肌 T 波的高耸, 抑制 ST 段的抬高, 明显减低血浆中的 CK 和 LDH 的含量, 减少了心肌酶的漏出, 且能改善心肌形态学的病理变化提示了 CFF 具有有效的心肌保护作用文献 [10] 曾报道 CFF 能保护缺血再灌注损伤心肌细胞, 对 CK 和 LDH 的漏出有明显的抑制作用本研究结果进一步表明该药对心肌缺血大鼠有显著的保护作用众多研究表明, 心肌缺血的发生机理复杂, 98 Chin JMAP, 2011 February, Vol.28 No.2 中国现代应用药学 2011 年 2 月第 28 卷第 2 期

5 但目前认为大量氧自由基生成, 引发强烈的脂质过氧化反应, 是造成心肌细胞损伤的最主要机制 [11] MDA 是氧自由基产生的脂质过氧化物的中间代谢产物, 常被作为反映氧自由基生成和造成膜损害的指标 ;SOD 是心肌清除氧自由基所必需的酶,CAT 是过氧化物酶体的标志酶, 使过氧化氢还原成水, 清除体内的过氧化氢, 从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害, 是生物防御体系的关键酶之一本试验观察可见,CFF 治疗组可明显减低心肌组织 MDA 的含量, 明显增强心肌组织 SOD 和 CAT 的活力, 提示 CFF 具有良好的抗氧化作用, 通过提高心肌的氧自由基清除能力, 减少氧自由基的生成, 加快氧自由基的清除, 保护心肌细胞, 促进心功能的恢复因此, 抑制氧自由基生成或清除氧自由基作用也是 CFF 参与大鼠心肌缺血心功能保护作用的机制之一随着研究的深入,CFF 资源广泛有效成分含量高等特点有望成为预防和治疗心肌缺血的有效手段这对合理开发和利用山楂叶资源均具有重要的理论意义和实际应用价值总之,CFF 对大鼠心肌缺血具有保护作用, 其作用机制可能与清除自由基阻断氧自由基的来源减轻氧自由基对心肌细胞膜脂质过氧化损伤等作用有关 REFERENCES [1] LIU R H, YU B Y, CHEN L Y, et al. Relationship between HPLC fingerprint chromatogram and inhibitory effect on respiratory burst of rat PMN of leaves of crataegus [J]. China J Chin Mater Med( 中国中药杂志 ), 2008, 33(15): [2] HUANG P L, ZENG Z H. Antioxidant action of Ginkgo biloba leaves and hawthorn leaves [J]. Chin Pharm J( 中国药学杂志 ), 1996, 31(5): [3] RONA G, CHAPPEL C I, BATAZS T. An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat [J]. AMA Arch Pathol, 1959, 67(4): [4] KARTHICK M, STANELY M P. Preventive effect of rutin, a bioflavonoid, onlipid peroxides and antioxidants in isoproterenol-induced myocardial infarction in rats [J]. J Pharm Pharmacol, 2006, 58(5): [5] JU X Y, FANG T H, ZHANG W T. Effect of freezedrying powder of total flavonoids in Chinese hawthorn leaf on myocardial infarction caused by coronary ligation of anesthetic dogs [J]. J Nanjing Univ Tradit Chin Med( 南京中医药大学学报 ), 2005, 21(6): [6] RONA G. Catecholamine cardiotoxicity [J]. J Mol Cell Cardiol,1985, 17(4): [7] JIA Y X, YANG J H, PAN C S, et a1. Intermedin(I-53) protects the heart against isoproterenol-induced ischemic injury in rats [J]. Eur J Pharmacol, 2006, 549(1/3): [8] XU S Y, BIAN R L, CHEN X. Pharmacological Experimental Method( 药理实验方法学 ) [M]. 3rd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2002: [9] JIN H M, LU J, YIN L H. Cellular and Molecular Pathophysiology( 细胞分子病理生理学 ) [M]. Zhengzhou: Zhengzhou University Press, 2002: [10] MIN Q, BAI Y T, WU J L, et al. Protective effects of hawthorn leaves flavonoids on cardiac function in rats suffered from myocardial ischemia reperfusion injury [J]. Chin Pharm J( 中国药学杂志 ), 2005, 40(7): [11] BECKER L C, AMBMSIO G. Myocardial consequences of reperfusion [J]. Prog Cardiovasc Dis, 1987, 30(1): 收稿日期 :

TGF-β AngⅡ B SD ~ 220g SPF. SCXK No SYXK ~ 25 40% ~ 70% OR37G-C

TGF-β AngⅡ B SD ~ 220g SPF. SCXK No SYXK ~ 25 40% ~ 70% OR37G-C 2017 7 43 4 Journal of Southwest Minzu University Natural Science Edition Jul. 2017 Vol. 43 No. 4 doi10. 11920 /xnmdzk. 2017. 04. 008 1 1 1 2 1 1 3 1. 610212 2. 6100413. 610031 AngⅡ TGF-β. SD 60 180 ~