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1 实验二细菌培养与消毒灭菌 1 讨论课 : 细菌培养与消毒灭菌 2 示教 : 培养基与细菌生长状况 3 学生操作 : 1 细菌接种 - 平板分区划线法 ; ( 表皮葡萄球菌 大肠杆菌 ) 2 消毒灭菌效果初步检测 ; 3 正常菌群革兰染色 ;

2 第一部分

3 基本概念 一 消毒 (disinfection) 杀死致病微生物繁殖体 二 灭菌 (sterilization) 杀死所有微生物 三 清洁 (cleaning) 除去尘埃和污秽物, 利于后续消毒 灭菌等效果四 防腐 (antisepsis) 抑制体内 外细菌的繁殖 五 无菌 (asepsis) 无活细菌存在的状态

4 物理消毒灭菌法 一 热力灭菌法二 辐射灭菌法三 滤过除菌法四 超声灭菌法五 低温干燥抑菌法

5 热力灭菌法 1 干热灭菌法 : 焚烧 烧灼 干烤 红外线 2 湿热灭菌法 : 煮沸 巴氏消毒法 蒸汽法 高压蒸汽法

6 高压蒸汽灭菌器

7 辐射灭菌法 1 紫外线灭菌法 2 电离辐射灭菌法 3 微波灭菌法

8 紫外线辐射灭菌装置

9 紫外线辐射灭菌装置

10 紫外线辐射灭菌的效果

11 微波辐射灭菌器

12 微波辐射灭菌器

13 其他物理灭菌法 1 滤过除菌法 2 超声灭菌法 3 干燥 低温抑菌法

14 用于滤过除菌的各式滤器

15 化学消毒灭菌法 一 化学消毒剂的类型与杀菌原理 二 化学消毒剂的正确使用 三 影响消毒剂效果的因素

16 化学消毒剂的类型与杀菌原理 类别常用消毒剂杀菌原理 酚类石炭酸 洗必泰蛋白质变性 损伤细胞膜 灭活酶类 醇类乙醇蛋白质变性与凝固, 干扰代谢 重金属盐类升汞 红汞 硫柳汞氧化作用, 蛋白质变性与沉淀, 灭活酶类 硝酸银 蛋白银 氧化剂高锰酸钾 过氧化氢氧化作用, 蛋白质沉淀 过氧乙酸 漂白粉 碘酒 氯 氯胺 表面活性剂新洁尔灭 杜灭芬损伤细胞膜 蛋白质沉淀, 灭活酶类 烷化剂甲醛 环氧乙烷菌体蛋白质与核酸烷基化 戊二醛 染料龙胆紫抑制细菌繁殖, 干扰氧化过程 酸碱类醋酸 生石灰破坏细胞壁 细胞膜, 蛋白质变性与凝固

17 化学消毒剂的应用 病人排泄物与分泌物 :20% 漂白粉 5% 石炭酸 2% 来苏 皮肤 :2.5% 碘酒 70% 乙醇 2% 红汞 黏膜 : 眼结膜 :1% 硝酸银 2% 蛋白银 口腔 :3% 过氧化氢 生殖泌尿道 :0.01%-0.1% 洗必泰 0.1% 高锰酸钾 饮水 : 氯气 漂白粉 厕所 : 生石灰 空气 : 甲醛熏蒸法 过氧乙酸熏蒸法 手 :0.2%-0.4% 过氧乙酸浸泡 70% 乙醇擦洗

18 影响消毒剂效果的因素 消毒剂的性质 浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度与酸碱度 有机物含量

19 本章小结 1 消毒灭菌的基本概念 2 常用的物理消毒灭菌法 3 常用的化学消毒剂及其原理 应用

20 第二部分 细菌的培养与生长

21 一 培养基的种类 按培养基的组成成分组成成分分类分类 按培养基的物理状态物理状态分类 按培养基的功能功能分类

22 成分天然培养基不同划分一 培养基的分类 ( 一 ) 各种分类方法 合成培养基 含用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物按化学成分完全了解的物质配制而成的培养基

23 固体培养基常用来进行微生物的分按物理同划分在液体培养基中加入一定量凝固剂, 使其成为固体状态, 琼脂含量一般为 1.5%-2.0% 固体培养基常用来进行微生物的分 固体培养基离 鉴定 活菌计数及菌种保藏状态琼脂含量一般为 0.2%-0.7% 半固体培养基不半固体培养基 液体培养基 观察微生物的运动特征 分类鉴定及噬菌体效价滴定划不加任何凝固剂 大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究

24 按照培养基的用途 增菌培养基 : 可以配制成适合某种微生物生长而不 适合其他微生物生长, 从而达到从自然界分离这种微生 物的目的 选择培养基 : 选择培养基是根据某种或某一类群微 生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设 计出来的一类培养基 利用这种培养基可以将某种或某 类微生物从混杂的微生物群体中分离出来 ( 抑制 ) 鉴别培养基 : 普通培养基中加入能与某种代谢产物 发生反应的指示剂或化学药品, 从而产生某种明显的特 征性变化, 以区别不同的微生物

25 培养基配制过程 ( 举例 ) 1 称药 2 溶化 3 ph 值 4 过滤 5 分装 6 做棉塞 牛肉膏蛋白胨培养基 : 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水 7 包装 8 灭菌 121 3g 10g 5g 20g 1000ml ph 7.0~ o C 灭菌 20-30min

26 培养基类型及接种方法 培养基类型 固体平板培养基 固体斜面培养基 半固体培养基 液体培养基 接种方法 分区划线 涂布法 划线法 穿刺法 液体接种法 使用器材 接种环 涂布棒接种环接种针接种环 移液器

27 细菌生长状况 液体培养基 - 牛肉汤培养基 生长状况 : 表面生长 : 液体澄清形成菌膜 ( 需氧菌 ) 混浊生长 : 液体混浊底有沉淀 ( 兼性厌菌 ) 沉淀生长 : 液体澄清底有沉淀 ( 兼性厌氧菌, 链球菌多见 )

28 细菌生长状况 半固体培养基 - 观察细菌动力 有动力细菌 : 接种线模糊不清, 或培养基混浊 无动力细菌 : 细菌沿接种线生长, 培养基澄清

29 典型病原菌生长状况 庖肉培养基 生长情况 破伤风梭菌 - 肉汤微混浊 凡士林下产生微量气体 肉渣微变黑 产气荚膜梭菌 - 肉汤微混浊 产生大量气体, 将凡士林顶到 试管口

30 细菌 生长状况

31 细菌生长状况 Lowenstein- Jensen 培养基 生长情况 : 结核杆菌菌落呈黄色 干燥 凸起 类似花菜心样

32 细菌生长状况 固体培养基 : 斜面培养基 : 观察菌苔及色素 平板培养基 : 分离纯化单个菌落, 观察菌落大小 形状 边缘 表面 透明度 色素 溶血状况 菌落 : 由单个细菌生长繁殖形成

33 细菌菌落示教 培养基 普通平板 生长情况 金葡菌 - 菌落中等大小 光 滑 凸起 不透明 产脂溶性金黄色色素 绿脓杆菌 - 菌落大 边界不整齐 扁平 湿润 产水溶性绿色色素

34 细菌菌落形态观察 金黄色葡萄球菌菌落

35 细菌菌落形态观察 培养基血平板 生长情况金黄色葡萄球菌 - 菌落中等小 边界整齐 光滑 凸起 不透明 含金黄色脂溶性色素, 菌落周围形成 β- - 溶血圈 表皮葡萄球菌 - 菌落中等大小 边界整齐 光滑 凸起 不透明 含白色脂溶性色素 菌落周围不形成溶血圈

36 细菌菌落形态观察 黄色葡萄球菌菌落 表皮葡萄球菌菌落

37 链球菌依据溶血性质分类 (1)α- 溶血性链球菌 : 菌落周围有 1-2mm 宽的草绿色溶血环, 也称甲型溶血, 这类链球菌多为条件致病菌 (2)β- β 溶血性链球菌 : 菌落周围形成一个 2-4mm 宽 界限分明 完全透明的无色溶血环, 也称乙型溶血, 因而这类菌亦称为溶血性链球菌, 该菌的致病力强, 常引起人类和动物的多种疾病 (3)γ- 链球菌 : 不产生溶血素, 菌落周围无溶血环, 也称为丙型或不溶血性链球菌, 该菌无致病性, 常存在于乳类和粪便中, 偶尔也引起感染

38 细菌菌落形态观察 培养基 血平板 生长情况 甲型溶血链球菌 - 菌落小 凸起 无色 边缘整齐 菌落周围形成草绿色不完全溶血的 α- - 溶血圈 乙型溶血链球菌 - 菌落小 凸起 无色 边缘整齐 菌落周围形成完全溶血的 β- - 溶血圈

39 细菌菌落形态观察 β- 溶血 α- 溶血

40 细菌菌落形态观察 - 溶血 - 溶血 - 溶血

41 细菌菌落形态观察 培养基 巧克力色平板 生长情况 脑膜炎球菌菌落 - 边界整齐 无色 透明 湿润 凸起 呈露状

42 第三部分 操作一 : 分区划线接种法 学生操作 : 两人一组, 每人一块普通琼脂平板, 其中一人接种表皮葡萄球菌, 另一人接种大肠杆菌 划线方法参见示意图

43 操作二 : 消毒灭菌效果初步检测 可供选择的消毒灭菌方法 : 1. 紫外消毒灭菌法 (30min); % 戊二醛 ; % 的甲醛 ; 4. 70% 消毒酒精 ; 5. 01% 0.1% 新洁尔灭 ; % 高锰酸钾 操作步骤 : 1. 取大肠杆菌或表皮葡萄球菌按以上方法分区划线 ( 取与分区划线相同细菌 ); 2. 按以上述消毒灭菌方法处理 ( 液体取 1 滴 (50ul) 于划线处, 平板背面标记 ); 3. 细菌放置 37 培养过夜

44 操作三 : 正常菌群革兰染色观察 可供选择的取菌方法 : 1. 指甲缝内 ; 5. 外耳道 ; 2. 胳肢窝体表 ; 6. 小脚趾和无名脚趾之间 ; 3. 肛门外周 ; 7. 其它体表部位 4. 鼻腔 革兰染色操作 : 1. 棉签用生理盐水湿润, 反复取细菌涂片 ; 2. 进行革兰染色观察, 确定优势菌群

45 革兰染色操作步骤 : 水 洗水水洗洗涂片结晶紫碘液 固定 初染 10 s 媒染 10 s 脱色剂 10-20s G + G - 番红 / 沙黄复染 10s

46 讨论课专题 棒状杆菌 流感嗜血杆菌 布鲁菌 芽胞杆菌 鲍特菌 军团菌 ( 实验六 ) 铜绿假单胞菌 ( 实验七 ) 耶尔森菌

第一章 图 1 1 传染病的特征 9 T h1 T h2 细胞调节机制简图 正调节 负调节 细胞因子与细菌的相互作用机制目前尚未完全明了 有实验表明 细胞因子与细菌之间 存在有互利和互抑双重效应 例如 T N Fα 和 IFNγ 可抑制放线菌的生长而 IL 6 的作用则 反之 IL 1 2 和 GM CSF 可促进某些致病性大肠杆菌生长而 IL 1ra 可抑制之 研究表 明 某些致病性大肠杆菌有与

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