复旦学报 医学版 年 月 #!#!# 6%( #!# '.(!#0! ' #$ '"!#24 #! #2 "#'! 2#$ #$!# $'"!'# "! 2$ 6%( #!# '.(!#0! #$ '"! # " 24 "#'! 2#$#$!# $'"!'# "! $#! $ '.(!# 6%( #

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1 复旦学报 医学版 )% 及其受体,0/ 在大鼠骨关节炎 &% 关节软骨和滑膜中的表达 蔡国平 俞永林 熊 敏 张新潮 刘德昌 复旦大学附属金山医院骨科 上海 复旦大学附属华山医院骨科 上海 摘要 目的 检测肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子 #' #& 4 2 4!!# 6%( 及其受体成纤维细胞生长因子诱导因子 #"2#$#'.( 及蛋白在大鼠骨关节炎 # #$#-( 关节软骨和滑膜中的表达情况 初步了解 6%( 及其受体 在 -( 发病中的作用 方法 只大鼠中随机选取 只行膝关节前交叉韧带切断 # #"' # ##( 1 制作 -( 模型作为实验组 另外 只接受手术但不切断前交叉韧带作为假手术组 剩余 只作为正常对照组 饲养至 周时 实验组及假手术组随机各取 只处死 只正常对照组在第 周处死 采集所有动物关节软骨及滑膜组织 用实时定量 3 及 6 # # 分别检测 6%( 和 在 '.( 及蛋白水平的表达情况 结果 术后第 和第 周实验组动物关节滑膜中 6%( 及 的 '.( 及蛋白表达水平显著上调 与假手术组及正常对照组比较 差异均有统计学意义 术后第 周实验组动物关节软骨中 6%( 及 的 '.( 及蛋白表水平与假手术组及正常对照组比较 差异均有统计学意义 结论 6%( 及其受体 的 '.( 及蛋白表达水平在大鼠 -( 关节软骨及滑膜组织中的表达显著增高 它们可能是参与 -( 的重要细胞诱导因子 关键词 骨关节炎 -( 肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子 6%( 成纤维细胞生长因子诱导因子 中图分类号 文献标志码 ( ) & )%,0/!# #!"&%" # (5 &!" * *"& /5-. +,(. /& $ 15 & $" '" 2 %#"#"# %" "# "( " '" 2 %# #"# %" "# "( " %& ' ###$0! #'#& 4 2 4!!# 6%( #!##"2#$# '.(!# #$ # # " ' ## #$# -('# ##$!' 6%( #!## #$# 5#$ # 2' # # #$-( '#$! # # #"' ### ( 1 #$0! ' # "!#$ "2#$#( 1 #$ $'"!#$ #$ 2 # # #$ '# "! (##$ #'!# #$ # #$ 24 #$ # "!2 #"# # " ' # $ 6%( '.(!# 2 ## #$ ' #$ &#' 3 6 # 上海市卫生局科研项目 上海市金山区卫生局科研项目 &!"#$%&' "

2 复旦学报 医学版 年 月 #!#!# 6%( #!# '.(!#0! ' #$ '"!#24 #! #2 "#'! 2#$ #$!# $'"!'# "! 2$ 6%( #!# '.(!#0! #$ '"! # " 24 "#'! 2#$#$!# $'"!'# "! $#! $ '.(!# 6%( #!## # " '# # 2#$ -( "#$"$ #$#$ #$ ' 2$ $ ' #$ '!## & # #$! -(!#$" # #$# -(#'#& 4 2 4!!# 6%( #"2#$# (! + #7!!+- '. 00/.53 + #7!! +- '.1.. 骨关节炎 # #$#-( 是最常见的关节疾病之一 在老年人中发病率较高 国际 -( 专题会议 年 对该病的定义为 -( 是力学和生物学因素作用下导致软骨细胞 细胞外基质和软骨下骨降解与合成耦联失衡所致 尽管 -( 的发病机制目前仍不明确 但已有研究表明 各种致病因素在炎性细胞因子参与下 促进了关节软骨和滑膜中各种蛋白酶的表达 引起关节软骨基质胶原纤维网和蛋白多糖的降 解 最终导致关节软骨发生退行性改变 肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子 #' #& 4 2 4!!# 6%( 是一种属. 配体超家族成员的细胞因子 能微弱诱 导肿瘤细胞凋亡 研究发现 6%( 可在多种细胞上表达 是一种多功能的细胞因子 它们通过与细胞表面的特异性受体结合 不仅可诱导细胞凋亡 而且具有促进炎性细胞因子和趋化因子分泌以及细 胞增生等生物学效应 那么 在 -( 骨关节软骨基质退变降解过程中 6%( 是否协同其他炎性细胞因子 趋化因子和 3 等共同参与了关节软骨降解的演变过程 它是否也在在 -( 形成机制中充当一定角色 本研究拟通过大鼠 -( 模型检测 6%( 及其受体 '.( 及蛋白在病变关节软骨及滑膜中的表达情况 拟对 6%( 在 -( 发病机制中的作用有初步的认识 材料和方法 动物模型 清洁级 6# 大鼠 只 周龄 雌雄各半 质量 " 上海斯莱克实验动物 有限公司 随机选取 只作为实验组 行膝关节前交叉韧带切断 # # "' # ## ( 1 制作 -( 模型 另取 只作为假手术组 动物仅做手术而不切断前交叉韧带 剩余 只大鼠作为正常对照组 饲养至 周时 分别从实验组及假手术组随机各取 只处死 正常对照组动物在第 周处死 采集所有动物关节软骨及滑膜组织 主要试剂及仪器 美国 公司 * 3 试剂盒 广州达晖生物公司 低温冷冻离心机 美国 "' 公司 实时定量 3 检测仪 ### ' 美国 ( 公司 旋涡振荡器 /6&( 上海青浦泸西仪器厂 手握式电动匀浆机 德国 4 公司 3 膜 美国! 公司 孔径为 ' 电泳仪 '!# 美国 & 公司 电转仪 3 & 大连竞迈科技有限公司 扫膜仪 - 美国 1& 公司 兔抗鼠 6%( 抗体 美国 # 公司 兔抗鼠. 抗体 美国 %!#' 公司 二抗 羊抗兔 美国 (' 公司 (3, 抗体 美国 (' 公司 组织中总 2% 抽提 '" 组织中加入 '1 预冷 电动匀浆器 ' 处理 将匀浆液移至 '1%!! 管中 加入氯仿 1 振荡摇匀 下 ' 离心 ' 小心吸出水层 加入二倍体积的异丙醇 约 1 混匀 冰箱内静置 ' 取出后于 ' 离心 ' 弃上清 沉淀用 1 的 7 乙醇洗涤沉淀 于 ' 离心 '

3 蔡国平 等 6%( 及其受体 在大鼠骨关节炎 -( 关节软骨和滑膜中的表达 将沉淀按上一步骤重复处理一次后 充分吸尽残留液 打开管盖 置干式恒温器 烘干 加入 1 %3 处理水溶解.( 经分光光度仪 ' 与 ' 测定分析并定量后 所有样品置 冰箱保存待用 逆转录 62% 按试剂盒说明将经过稀释后的.( 样本进行逆转录 反应体系 1 逆转录缓冲液 1 " 逆转录酶 1 1 %3 处理水 1.( 模板 1 反应条件 $ ' # " -$ 根据 6%( 及 基因序列信息设计并合成 3 引物 6%( 引物序列 &( & & ( ((( & 引物序列 &((((( ((& & (( ( ((&(3, 引物序列 & (( ( & & (( & 扩增体系 1 * 0 1 上游引物 1 下游引物 1 1, - 1.( 模板 1 扩增反应条件 ' 预变性 ' 变性 退火 延伸 共进行 个循环 ' 再次延伸 ' 数据采用仪器自带软件分析 ( 53'#2 用 # 法进行各基因表达的相对定量 蛋白提取 '" 组织剪碎后加 '1 53( 蛋白提取液 冰浴条件下制成匀浆 于 ' 离心 ' 弃沉淀 上清用 ( 法测定蛋白浓度后用液氮保存待用 )% 和,0/ 蛋白的 # 分析 " 蛋白经 7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 后 电转移至 3 膜 将膜用 7 脱脂奶粉 3 配制 室温封闭 $ 加一抗 稀释 室温孵育 $3 洗涤 次 加, 3 标记的二抗 稀释 室温 $3 洗涤 次 用 % 1 显色 用分析软件 & 凝胶成像分析系统 计算目的蛋白和内参 (3, 谱带灰度值 以目的蛋白和内参谱带灰度值的比值示目的蛋白的相对表达水平 数据分析 实验数据录入 3 统计软件 对计量数据进行正态性检验 以 表示 再进行单因素方差分析 为差异有统计学意义 结 果 &% 大鼠模型的建立 在 -( 大鼠模型造模后 和 周 大鼠的膝关节均有不同程度的 -( 表现 周时 关节积液增多 滑膜增生水肿 关节软骨水肿增厚 周时 滑膜增生水肿加重 关节软骨水肿增厚 软骨面多数色泽灰暗 且有磨损及不规则 似天鹅绒 周时 滑膜增生严重 软骨面糜烂 部分出现溃疡 相同时间点假手术组及正常对照组大鼠无明显滑膜增生 关节软骨光泽 平整和透明 大鼠关节滑膜组织中 )% " 2% 和蛋白的表达 造模后 周 实验组大鼠滑膜组织中 6%( '.( 的表达水平与正常对照组及假手术组相比 差异无统计学意义 造模后 周和 周 实验组大鼠滑膜组织中 6%( '.( 的表达水平明显高于假手术组及正常对照组 表 不同组动物滑膜组织中 6%( 蛋白的 6 # # 图谱如图 所示 经分析计算 各组动物 6%( 蛋白水平与基因表达水平相仿 表 表 0 不同组大鼠滑膜组织中 )% " 2% 的表达 相对表达平均水平 0)% " 2%!"!! # ##! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' # #$ '"!

4 复旦学报 医学版 年 月 表. 不同组大鼠滑膜组织中 )% 蛋白的表达.)%!"!!! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' 图 0 不同大鼠滑膜组织中 )% 及,0/ 蛋白表达的 # 图谱,0)%,0/!"!! # +.' "!$'"!-( "! # #$ '"! 大鼠关节软骨组织中 )% " 2% 和蛋白的表达 实验组大鼠 -( 关节软骨组织中 6%( '.( 的表达水平仅造模后第 周高于相应假手术组及正常对照组 差异有统计学意义 表 造模后第 及第 周的表达与相应假手术组及正常对照组差异无统计学意义 表 不同组大鼠软骨组织中 )% " 2% 的表达 相对表达平均水平 )% " 2%#!! # ##! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' # #$ '"! 不同组大鼠软骨组织 6%( 蛋白的 6 # # 图谱如图 所示 经分析计算 各组大鼠 6%( 蛋白水平与基因表达水平相仿 表 表 / 不同组大鼠软骨组织中 )% 蛋白的表达 /)% #!!! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' 图. 不同组大鼠软骨组织中 )% 及,0/ 蛋白的 # 图谱,.)%,0/ #!!# +.' "!$'"!-( "! # #$ '"! 大鼠滑膜组织中,0/" 2% 和蛋白的表达 造模后 周 实验组 '.( 的表达与正常对照组及假手术组相比 差异无统计学意义 造模后 周和 周 实验组 '.( 的表达分别高于相应的假手术组及正常对照组 差异均有统计学意义 表 图 和表 分别为不同组大鼠滑膜组织中 蛋白的 6 # # 图谱和表达水平 各组动物的 蛋白表达情况与基因表达情况相似

5 蔡国平 等 6%( 及其受体 在大鼠骨关节炎 -( 关节软骨和滑膜中的表达 表 5 不同组大鼠滑膜组织中,0/" 2% 的表达 相对表达平均水平 5,0/" 2%!"!!# ##! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' # #$ '"! 表 ; 不同组大鼠滑膜组织中,0/ 蛋白的表达 ;,0/!"!!! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' # #$ '"! 大鼠关节软骨组织中,0/ " 2% 和蛋白的表达大鼠 -( 关节软骨组织中 '.( 的表达仅在造模后第 周高于假手术组及正常对照组 差异有统计学意义 表 造模后第 及第 周的表达与相应假手术组及正常对照组相比 差异无统计学意义 图 和表 分别为不同组动物软骨组织 蛋白的 6 # # 图谱和表达水平 各组动物的 蛋白表达情况与基因表达情况相似 表 4 不同组大鼠软骨组织中,0/" 2% 的表达 相对表达平均水平 4,0/" 2%#!! # ##! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' # #$ '"! 表 3 不同组大鼠软骨组织中,0/ 蛋白的表达 3,0/ #!!! $ # 24 $ 24 $ #$ 24.' $' # #$ '"! 讨 论 -( 是最常见的关节疾病之一 主要特征是关节软骨的组成 结构和功能发生改变 表现为关节软骨变性 萎缩 软骨下骨硬化 囊性变 关节边缘骨赘形 成等 病情严重可致残 既往对 -( 的病理研究集中在异常关节生物力学的影响 近几年主要侧重于探讨软骨细胞的病理生物学机制 目前认为 在各种致病因素作用下 炎性细胞因子介导的关节软骨和滑膜中各种蛋白酶表达增高所引起的关节软骨基质胶原纤维网和蛋白多糖的降解 是导致关节软骨退 变的主要原因之一 在 -( 的发展病程中 各种细胞因子相互协同 相互调节 最终主要刺激基质金属蛋白酶 '#0 ' #!# 3 的合成与分泌 促进 3 的表达增高 从而促进软骨的降解 其中白细胞介素 &# 4&51& 和肿瘤坏死因子 &#'#&.& 是参与 -( 病理过程最主要的细胞因子 6%( 是一个多功能细胞因子 ') 等将 6%( 与 (-( 患者滑膜细胞共孵育后 发

6 复旦学报 医学版 年 月 现培养液中 3& 和 (. % 等细胞因子显著增 高 3! 等研究表明 6%( 能特异性抑制软骨形成 从而阻碍软骨的内源性修复 既然在 -( 骨关节软骨基质退变降解过程中 3 细胞因子和趋化因子等共同参与了关节软骨降解的演变过程 上述诸因素通过协同作用或相互调节促使或加速 3 在 -( 软骨降解中的产生 那么 6%( 及其受体 是否也是参与的因素之一 本研究的结果显示 在 -( 大鼠模型造模后第 和 周 大鼠膝关节都有不同程度的 -( 表现 虽然实验组动物滑膜组织中 6%( 及其受体 的 '.( 和蛋白表达水平在造模后第 周与假手术组及正常对照组比较 差异无统计学意义 但在造模后的第 周及第 周均高于假手术组及正常对照组 该结果与实验组动物造模后不同时程的骨关节损伤情况一致 即随造模后时程的延长 滑膜增生加重 从软骨的表达情况来看 组动物 6%( 及 的 '.( 和蛋白表达水平均较低 仅在造模后第 周 实验组 6%( 及 的 '.( 和蛋白表达高于假手术组及正常对照组 第 及 周与假手术组及正常对照组比较 差异无统计学意义 我们认为 实验组动物造模后第 周时软骨 6%( 及 的 '.( 和蛋白表达水平与软骨的实际情况相符 因为任何物质的合成均与细胞活动能力有关 实验组动物造模后第 周时软骨面糜烂 部分出现溃疡 软骨下骨质裸露 说明软骨受损严重 甚至大量死亡 以致于影响到.( 和蛋白的合成 鉴于 6%( 具有促进炎性细胞因子 趋化因 子分泌以及细胞增生等生物学效应 因此 我们认为实验组动物关节滑膜组织中 6%( 及其受体 的 '.( 和蛋白表达的增加可能是 -( 疾病启动因素之一 当同属细胞诱导因子的 6%( 与其受体 表达增加及相互作用后 有可能诱导滑膜炎性介质或炎性细胞因子大量生成 进而促进 3 合成与分泌 从而导致软骨降解 此外 实验组动物造模后第 周时滑膜组织与软骨的受损也间接地反映了关节滑膜组织中 6%( 及其受体 的 '.( 和蛋白表达增加可能是 -( 疾病启动因素 因为滑膜组织在造模后第 周主要表现为增生而非崩溃 软骨则表现为糜烂和溃疡 需要说明的是本研究仅对关节滑膜及软骨中 6%( 及其受体 的 '.( 和蛋白表达与 -( 疾病初步探讨 尚有许多问题有待解决 例如 为何动物 (1 术后滑膜与软骨内 6%( 及其受体 的 '.( 和蛋白表达会增加 6%( 其受体水平增加后促进软骨降解究竟与哪些物质有关联 或者通过其他哪种途径促进 -( 发展等 参 考 文 献 5 1!$!#$!$"# #$# " ("$,# $ $!# $ * 3 /, 6%( 2 #"#$ #' # ' #$#2 4!!# )( 41 $,$' 6%( " # '" ' ## #4 6%(!#$2 $#$ (. " 刘建湘 杜靖远 杨述华 大鼠实验性骨关节炎模型的建立及病理特征 华中科技大学学报 医学版 ((($ #!'# #$ #'## #$ '"$' # $""$ ) #$ ###! 4 &1 3 1.%$## #' # #$# )" 4 &1 3 1.%#$! #2 )# $! #$!' # # #$# ( 2" 1("" # #$# ( 2" " -# 5''# # #$# ( 2"!#&3 # 1)!''# #4 #$!#$!$" # #$# ').4)' ( '# 5' # 6%( ###$ '''# ( 2, % 3! 2" 4 16%( #$#" ' # 1 " 收稿日期 编辑 王蔚

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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