主要用途 FF 微孔板使用固定在微孔板上的 95 个不同的生化试验来对广泛的真菌 ( 包含丝状真菌及酵母 ) 提供表型概况并进行鉴定 Biolog 鉴定系统中的软件 (Microlog TM 3) 通过读取 FF 微孔板上所表现出的表型图谱来对真菌进行鉴定 FF 鉴定板适合鉴定新鲜的培养物, 对于在

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黍董
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1 FF MicroPlate TM 使用说明书售后服务专线 : 电话 : 传真 : Biolog FF MicroPlate 使用说明书 1 / 9

2 主要用途 FF 微孔板使用固定在微孔板上的 95 个不同的生化试验来对广泛的真菌 ( 包含丝状真菌及酵母 ) 提供表型概况并进行鉴定 Biolog 鉴定系统中的软件 (Microlog TM 3) 通过读取 FF 微孔板上所表现出的表型图谱来对真菌进行鉴定 FF 鉴定板适合鉴定新鲜的培养物, 对于在斜面培养基上长久保存或经过多次转代的培养物, 常会使表型恶化, 或会失去该菌株的生理代谢特征概述 Biolog FF 微孔板通过微生物对微孔板中的不同碳源的利用及氧化情况进行测试, 测试使得有特征代谢的孔变成紫色或者浊度发生改变, 从而使微生物在测试板上显示出代谢指纹图谱 1,2 所有必要的营养物质以及生化试剂都被预先填充干化在 96 个孔中利用碘硝基四唑紫 (Iodonitrotetrazolium Violet) 作为颜色指示剂显示利用特定碳源发生氧化反应时线粒体的活性试验的操作过程非常简单在平板上按照常规方法划线分离需要鉴定的微生物, 然后将分离的到的纯种用棉签挑到一种特殊的凝胶接种液 (FF-IF) 3,4 中, 配成指定细胞浓度的菌悬液将菌悬液按每孔 100µl 的量加到 FF 板, 菌悬液通常包含孢子和菌丝片断当培养时, 就会利用到孔中的碳源, 会发生下列某一个或两个变化 :1, 线粒体活性增加, 形成微红 - 橙色颜色, 在 490nm 处的光密度增加 2, 细胞生长, 浊度增加, 同时在 490nm 和 750nm 处的光密度增加 A1 孔不含碳源, 同时作为色度和浊度的参照孔鉴定板一般孵育 1-4 天利用 MicroStation 读数仪在 490nm 和 750nm 定量检测每孔的色度和浊度反应 Biolog Microlog TM 软件通过 FF 板上显颜色及浊度变化所产生的指纹图谱自动与数据库比对, 寻找符合条件的结果如果找到匹配的, 所分离出来的微生物得到鉴定 Biolog FF MicroPlate 使用说明书 2 / 9

3 注意事项为获取准确且可重复的结果, 请务必遵循下列建议 : 纯培养是一切鉴定的前提, 使用专用培养基进行活化培养非常重要, 同一菌株可能会由于接种前在不同的培养基上生长而在鉴定时产生不同的代谢特征无菌操作, 避免污染影响结果应尽量使用一次性玻璃器皿来处理所有细胞悬液和其他溶液已经清洗过的玻璃器皿可能含有微量的皂剂或洗涤剂, 会影响到结果在使用前将 FF 微孔板及 FF-IF 接种液预热到室温一些菌种对冷冲击非常敏感准确校正浊度仪, 使菌悬液浓度位于指定的浓度范围请参考接种液制备这一部分内容 FF 鉴定板上包被的化学物质对温度和光敏感 FF 微孔板请置于 2-8 冰箱, 避光保存如孔颜色为深褐色表示鉴定板碳源已变质一些孔本身就是黄色或浅红色, 这是正常的请一定采取安全的方式来处理所有真菌尽量在无菌间操作, 避免污染尤其是要避免空气中的孢子 ( 分生孢子 ) 产生交叉污染避免对仪器或人为的污染推荐使用 II 级生物安全柜干净无菌的可替换鉴定板盖有助于减少对 MicroStation 读数仪的污染风险检查 FF 鉴定板 : 请勿使用过期的 FF 鉴定板要将其带着外包装放于 2-8 冰箱, 避光保存试剂及耗材 FF MicroPlates FF 微孔板 : Catalog No Biolog FF MicroPlates (10/box). 2% ME Agar 2% 麦芽提取物琼脂培养基 : 2% Malt Extract Agar (20 g Malt Extract dehydrated medium, Oxoid Catalog #LP0039B; 18 g Bacteriological Grade Agar; 1 L distilled water) 5 ;2% 麦芽汁培养基 (20g 麦芽汁干粉培养基,Oxoid 货号 #LP0039B;18g 细菌级琼脂 ;1L 无菌水 ). FF-IF FF 接种液 : Biolog Catalog #72106) 3,4. LongSwabs TM 无菌一次性接种棉签 : Sterile 7-inch disposable cotton-tipped swabs (Biolog Catalog # ). Streakerz TM 木质无菌一次性接种棒 : Catalog No Sterile disposable wooden agar Biolog FF MicroPlate 使用说明书 3 / 9

4 plate streakers (10x100); Catalog No.3026 (50x20). Transfer Pipets 无菌一次性移液管 : Catalog No Sterile disposable 9 inch transfer pipets. Reservoirs 无菌一次性 V 型加样槽 : Catalog No Sterile disposable reservoirs. Multichannel Pipettes 多道移液器 : Catalog No channel electronic pipettor. Pipet Tips 无菌移液器吸头 : Catalog No Sterile racked pipet tips for Ovation multichannel pipettor; Catalog No Matrix multichannel pipettor tips. MicroPlate Lid 鉴定板盖 : Gamma irradiated MicroPlate lids (Biolog Catalog #30201). Turbidimeter 浊度计 : Catalog No volt model, Catalog No volt model, Catalog No volt model. Turbidity Standards 标准比浊管 : FF (Biolog Catalog #3426). Incubator 培养箱 :26. Incubation container: 可密封的塑料盒或塑料袋, 以便保湿操作规程使用 FF- IF 接种液前先反复颠倒或轻轻震荡使里面的胶质混匀做实验前, 先将 FF 鉴定板和 FF-IF 接种液恢复至室温 25 度第一步 : 在 Biolog 推荐的培养基上培养微生物使用 ME 培养基分离纯的培养物培养温度通常是第二步 : 样品准备丝状真菌在 2%ME 琼脂培养基上培养 ( 该培养基利于产孢子 ) 将接种好的平板放到环境光下或近紫外光下培养, 直到产孢, 在 26 下一般需要 5-10 天许多真菌环境光照下即可产生大量的分生孢子 ( 无性孢子 ) 而一些植物病原真菌如镰刀霉需要在紫外光下培养以提高产孢酵母在 2%ME 琼脂上培养基上,26 培养 24-48h Biolog FF MicroPlate 使用说明书 4 / 9

5 第三步 : 接种准备在浊度仪上调节特定范围的浊度首先用 FF-IF 接种液调至 100%, 然后利用 FF 标准比浊管显示标准浊度, 应是 75%T, 在不同的浊度仪上读数可能有些许变化进行读数校正时不要随意转动接种液的玻璃管, 因管壁的透光度不均匀, 转动会发生变化, 空白校正时在什么位置, 接种时尽量也放在同样的位置使用未接种的含有接种液的干净接种管 ( 擦去管壁污垢及指纹 ) 将浊度仪透光度指针调至 100% 由于每只管子在光学性能上并不完全相同, 所以应该分别针对每只接种液来调空白在 Ⅱ 级生物安全柜中制备菌悬液并接种首先将棉棒在干净的接种液中浸润, 用其在平板表面滚动粘取孢子, 然后用沾有孢子的棉签上下反复涂抹接种液上部干燥的管壁, 使孢子分散, 然后利用接种液冲下做成均一孢子悬液轻缓的使菌悬液完全混匀, 避免产生气泡干扰吸光度的读数如果还有未打散的菌块, 将接种液静置几分钟, 使之沉淀下去准确调整菌悬液的菌体浓度到 75%T, 上下偏差 2% 如浓度太高可以加入一些新的接种液, 如浓度太低则继续加入更多孢子制备好菌悬液后, 菌悬液倒入 v 型槽, 然后迅速接到板上接菌悬液的过程不超过 10min( 超过 10min, 一些菌会因失去氮源丧失代谢活力 ) 第四步 : 接种至鉴定板迅速将配制好的菌悬液倒入 V 型槽中 ( 不要将沉淀倒入 ), 并用移液器将菌悬液接种至 FF 板上 ( 每孔 100μl) 接种完后, 盖上微孔板盖子, 接种液会很快变成软凝胶第五步 : 培养鉴定板将鉴定板置于 26 培养箱中培养将板放入密闭的盒子或袋子内, 不需要在其中放置任何增湿的成分, 因为随着菌丝的生长这样很容易使鉴定板的外部被污染 26 培养鉴定板 1-4 天 ( 对于耐高渗透压和生长非常缓慢的真菌则需要培养 10 天 ) Biolog FF MicroPlate 使用说明书 5 / 9

6 表 1:FF 鉴定板操作流程 : 培养基 2%ME( 麦芽汁培养基 ) 湿法制备菌丝体酵母 ( 菌丝状 ) 微生物类型丝状真菌酵母培养基 2%ME 2%ME 温度气体状况空气空气培养时间 5-10 天 2 天接种液 FF-IF FF-IF 浊度管 FF FF 接种浊度 75%T 75%T 接种量 (ul/ 孔 ) 培养时间 (H) 24,48,72,96 24,48,72,96 结果培养完毕后请使用 Microlog TM 3 软件进行结果获取, 请参见软件说明书 FF 板盖上的冷凝水会对读数结果产生影响如果板盖上有冷凝水, 请在 Ⅱ 级生物安全柜内用一块新的干净的板盖替换将板子放入 MicroStation 读数仪, 读数仪会读取 490nm( 测定微红 - 橙色颜色 ) 和 750nm( 测定浊度 ) 波长的数据对于一些菌会在碳源缺失时芽孢 (spore) 或分生孢子 (conidia) 的萌发会使 A1 对照孔产生颜色 Microlog 鉴定软件可以容许这种假阳性大多数菌可以产生清晰可辨的阳性颜色反应但某些阳性反应仅仅产生浅的微红 - 橙色对于 FF 鉴定板, 培养 1 天后, 只有当相似度指数 (Similarity Index) 大于 0.9; 培养 2 天, SIM 值大于 0.7; 培养 3 天,SIM 大于 0.65; 培养 4 天,SIM 值大于 0.6 的情况下鉴定结果才能被接受食品 (Food) 和空气 (Air) 数据库包括了所有常见食品和空气中真菌, 里面有酵母, 曲霉, 青霉以及其他属每天读板直到获得鉴定结果, 一般需要 4 天一旦获得了鉴定结果, 就不需要再读板一些耐高渗透压和一些生长非常缓慢的真菌需要更多的时间培养和读数, 可能还要 7 天通过比较数据库中真菌图片库提供的孢子 (Microscopic) 和菌落 (Macroscopic) 形态, 确认所鉴定的真菌菌株利用 First Choice ( 第一选择 ) 的图片与所鉴定的真菌的孢子和 Biolog FF MicroPlate 使用说明书 6 / 9

7 菌落形态比较, 看是否相符如不符, 则比较第二第三选择提供的图片, 进行确认如果 4 天后仍得不到鉴定结果, 选取前三位的菌利用其图片库提供的孢子和菌落形态与所鉴定菌进行对比确认选择正确的数据库来鉴定真菌非常重要如果分离的真菌来自空气样品, 则选 Air Database, 同样地, 如果来自于食品样品, 则选择 Food Database 如果真菌已经鉴定到某种属, 则选特定属数据库, 其数据库包含的真菌更集中, 包含 Air 和 Food 数据库中没有的菌株酵母细胞悬液包含酵母的活体细胞,24 小时便可产生有用的图谱与之相比, 丝状真菌的悬液是芽孢 (Spore) 或分生孢子 (Conidia) 悬液, 它必须萌发生长后才能产生图谱孢子萌发所需时间不一致,24h 产生的图谱也有很多种, 故真菌在 24h 时图谱的可信度也会下降 FF 板鉴定流程 : 24h 开始读, 每天读板直到得到鉴定结果 : 每天读板有鉴定结果确认菌落 (macro)/ 孢子 ( micro) 图片 ( 前三个菌株 ) 无鉴定结果继续培养 96 小时后读板有鉴定结果确认菌落 (macro)/ 孢子 ( micro) 图片 ( 前三个菌株 ) 无鉴定结果继续调查 : 检查菌落 (macro)/ 孢子 ( micro) 图片 ( 前三个菌株 ) 注意 : 耐高渗透压, 耐干躁和其他生长非常缓慢的真菌可能需要 7 天才显示阳性结果问题解答如 1-9 列全是阳性, 请确认 : 用非污染的纯菌非真菌菌株可能使孔全部呈阳性反应制作菌悬液时, 确保不要将平板培养基 ( 含氮源 ) 也挑进接种液中菌悬液浓度不要过量, 检查并校正浊度仪 A1 孔作为对照孔, 加液时不要少加, 应与其它孔一致如 1-9 列全是阴性, 请确认 : 确保该菌株适于用 FF 鉴定板来鉴定 ( 产孢真菌, 食品或空气中的酵母 ) Biolog FF MicroPlate 使用说明书 7 / 9

8 需要新鲜培养的酵母菌, 使用推荐的 ME 培养基接种液和鉴定板使用前恢复到室温, 正确制备菌悬液, 有合适的 ph 值和盐度, 不含防腐剂接种液浓度要达到特定的浊度, 检查并校正浊度仪在 26 下进行培养 A1 孔作为对照, 不要将菌悬液加的过多, 与其它孔保持一致局限性 FF 鉴定板仅适用于新鲜培养分离纯化的产孢真菌 FF 板通常只能鉴定包含在当前数据库中的菌株非典型菌株通常只会报告 No Identification 而培养 4 天后 SIM 低于 0.6 的都将报告为 No Identification 一些保存较久的真菌经多次传代培养后也可能会发生代谢特征的改变, 报告为 No Identification 质控菌种 (Biolog Catalog No.8046). 1 Galactomyces geotrichum (Geotrichum candidum) ATCC 白地霉 2 Aspergillus niger ATCC 黑曲霉 3 Cladosporium cladosporiodes DAOM 枝孢样枝孢酶 4 Penicillium chrysogenum ATCC 产黄青霉如果鉴定结果不符合, 重新看一下操作流程, 并检查菌株是否纯引文 1 Bochner, BR Sleuthing out Bacterial Identities. Nature 339: Bochner, BR Breathprints at the Microbial Level. ASM News 55: Biolog, Inc., US Patent # 5,627, Prepare FF-IF as follows. Bring distilled water to a boil. Add Phytagel at 2.5 g/l (Sigma Chemical, cat # P8169) and Tween 40 at 0.3 g/l (Sigma Chemical, cat # P1504) and stir without further heatingfor about 10 minutes until all components are dissolved and the solution becomes clear. Dispense 16 ml into capped, disposable borosilicate tubes (20 x 150 mm) and sterilize by autoclaving. 5 Biolog recommends using these components when making 2%ME Agar to ensure consistent results. Biolog FF MicroPlate 使用说明书 8 / 9

9 FF MicroPlate TM 测试布局 A1 Water 水 A2 Tween 80 吐温 80 A3 N-Acetyl-D-Galact osamine N- 乙酰基 D- 半乳糖胺 A4 N-Acetyl-ß-D-Gluc osamine N- 乙酰基 -ß-D- 葡萄糖胺 A5 N-Acetyl-ß-D-Man nosamine N- 乙酰胺 -ß-D- 甘露糖胺 A6 Adonitol 核糖醇 A7 Amygdalin 杏苷 A8 D-Arabinose D- 阿拉伯糖 A9 L-Arabinose L- 阿拉伯糖 A10 D-Arabitol D- 阿拉伯醇 A11 Arbutin 熊果苷 A12 D-Cellobiose D- 纤维二糖 B1 a-cyclodextrin a- 环式糊精 B2 ß-Cyclodextrin ß- 环式糊精 B3 Dextrin 糊精 B4 i-erythritol 赤藻糖醇 B5 D-Fructose D 果糖 B6 L-Fucose L- 海藻糖 B7 D-Galactose D- 半乳糖 B8 D-Galacturonic D- 半乳糖醛酸 B9 Gentiobiose 龙胆二糖 B10 D-Gluconic D- 葡萄糖酸 B11 D-Glucosamine D- 葡萄糖胺 B12 a-d-glucose a-d- 葡萄糖 C1 a-d-glucose-1 -Phosphate a-d- 葡萄糖 -1- 磷本盐 C2 Glucuronamide 葡萄醛酰胺 C3 D-Glucuronic D- 葡萄醛酸 C4 Glycerol 丙三醇 C5 Glycogen 肝糖 C6 m-inositol m 纤维醇 C7 2-Keto-D-Gluconic 2- 酮 -D- 葡萄糖酸 C8 a-d-lactose a-d- 乳糖 C9 Lactulose 乳果糖 C10 Maltitol 麦芽糖醇 C11 Maltose 麦芽糖 C12 Maltotriose 麦芽三糖 D1 D-Mannitol D- 甘露醇 D2 D-Mannose D 苷露糖 D3 D-Melezitose D- 松三糖 D4 D-Melibiose D- 蜜二糖 D5 a-methyl-d-galact oside a- 甲基 -D- 半乳糖苷 D6 ß-Methyl-D- Galactoside ß- 甲基 -D- 半乳糖苷 D7 a-methyl-d-glucos ide a- 甲基 -D- 葡萄糖苷 D8 ß-Methyl-D-Glucos ide ß- 甲基 -D- 葡萄糖苷 D9 Palatinose 6-O-D- 吡喃葡萄糖酰 -D- 呋喃果糖 D10 D-Psicose D- 阿洛酮糖 D11 D-Raffinose D- 蜜三糖 D12 L-Rhamnose L- 鼠李糖 E1 D-Ribose D- 核糖 E2 Salicin 水杨苷 E3 Sedoheptulosan 景天庚醛聚糖 E4 D-Sorbitol D- 山梨醇 E5 L-Sorbose L- 山梨糖 E6 Stachyose 水苏糖 E7 Sucrose 蔗糖 E8 D-Tagatose D- 塔格糖 E9 D-Trehalose K- 海藻糖 E10 Turanose 松二糖 E11 Xylitol 木糖醇 E12 D-Xylose D- 木糖 F1 y-aminobutyric y- 氨基丁酸 F2 Bromosuccinic 溴代琥珀酸 F3 Fumaric 反丁烯二酸 F4 ß-Hydroxybutyric ß- 羟基丁酸 F5 y- Hydroxybutyric y- 羟基丁酸 F6 p-hydroxy-phenyla cetic P- 羟苯乙酸 F7 a-ketoglutaric a- 酮戊二酸 F8 D-Lactic Methyl Ester D- 乳酸甲基酯 F9 L-Lactic L- 乳酸 F10 D-Malic D- 苹果酸 F11 L-Malic 苹果酸 F12 Quinic 奎尼酸 G1 D-Saccharic D- 葡萄糖二酸 G2 Sebacic 癸二酸 G3 Succinamic 琥珀酸 G4 Succinic 琥珀酸 G5 Succinic Mono-Methyl Ester 琥珀酸甲基酯 G6 N-Acetyl-L-Glutam ic 甲基酰 -L- 谷氨酸 G7 L-Alaninamide L- 丙胺酸酰胺 G8 L-Alanine L- 丙胺酸 G9 L-Alanyl-Glycine L- 丙胺酰氨基乙酸 G10 L-Asparagine L- 天冬酰胺 G11 L-Aspartic L- 天冬氨酸 G12 L-Glutamic L- 谷氨酸 H1 Gycyl-L-Glutamic 甘氨酰 -L- 谷氨酸 H2 L-Ornithine 鸟氨酸 H3 L-Phenylalanine L- 苯基柄氨酸 H4 L-Proline 脯氨酸 H5 L-Pyroglutamic 焦谷氨酸 H6 L-Serine L- 丝氨酸 H7 L-Threonine L- 苏胺酸 H8 2-Aminoethanol 2- 氨基乙醇 H9 Putrescine 腐苷 H10 Adenosine 腺苷 H11 Uridine 尿苷 H12 Adenosine-5 -Mon ophosphate 腺苷 -5 一磷酸盐 Biolog FF MicroPlate 使用说明书 9 / 9

558 微生物学通报 2009, Vol.36, No.4, (Pharmaceutical and personal care products, PPCPs),,, (Pharmaceutical active compounds, PhACs) [1,2], PPCPs PPCPs, [3]

558 微生物学通报 2009, Vol.36, No.4, (Pharmaceutical and personal care products, PPCPs),,, (Pharmaceutical active compounds, PhACs) [1,2], PPCPs PPCPs, [3] 微生物学通报 APR 20, 2009, 36(4): 557~562 Microbiology tongbao@im.ac.cn 2009 by Institute of Microbiology, CAS 研究报告卡马西平降解菌的筛选及降解特性研究 * 崔长征胡洪营于亚琦于茵 ( 100084) 摘要 : 药品和个人护理品类污染物日益成为新兴污染物研究的重点, 药品卡马西平因具有多种药效被广泛使用,