衰弱等各种慢性疾病, 以及妇女月经不调 习惯性流产等有气血两虚见证者, 皆可加减运用 近年来, 对八珍汤临床应用的探索在逐步推进, 广泛用于失血贫血 [3] 症 心血管疾病 妇科疾病 创伤愈合以及肿瘤放化疗后不良反应控制 现代研究认为八珍汤能显著增强机体的免疫功能, 促进骨髓造血干祖细胞的增殖, 促

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1 案例报告 郑佳丽 一 所归纳出的问题如下 : 1 采用什么方法造模? 可否采用乙酰苯肼和环磷酰胺复合造模? 如何判断造模是否成功, 有没有辨证标准? 2 合理的实验室指标? 3 小鼠爪尾 r 值的测量好像很容易出现偏差, 具体操作方法是怎么样的? 4 乙酰苯肼的具体造模和处理方法 周期长短? 5 实验小鼠的品种 年龄 体重 雌雄? 6 如何进行科学的实验分组? 7 方剂选择? 个人认为案例报告有以上一些问题可以进行进一步的探索, 在经过仔细斟酌之后, 最终决定解决第七个问题, 即选用哪些有效的方剂进行实验 我们组的成员之前也聚在一起讨论过这个问题, 我们组最终确定了用当归补血汤和八珍汤这两个气血双补的方子进行疗效比较 但是我有个人的想法, 我发现案例报告中第三组同学选用八珍汤和四物汤进行疗效的比较, 于是我就在考虑是否可以再加一个四君子汤进去, 因为八珍汤可以看作由四物汤和四君子汤组合而成的方子, 具有气血双补的功效, 于是我就有这样一个想法 : 气血双补 单纯补血 单纯补气对于血虚证动物模型的具体疗效如何 想通过实验来验证 气能生血 这一中医理论 二 与该问题有关研究背景和进展 : 中医动物模型工作始自 60 年代初, 而血虚证动物模型则于 1977 年由上海中医研究所通过失血加限量营养方法首建 ;1981 年北京中医学院贲长恩建立乙酰基苯肼溶血性贫血血虚模型 ;1985 年中国中医研究院西苑医院王奎建立马利兰骨髓损伤血虚证动物模型 ;1987 年黄广平建立失血性贫血血虚证动物模型 ;1988 年中日友好医院临床医学研究所迟永春建立 X 线照射骨髓损伤血虚证模型 ;1990 年湖南医科大学雷厉建立苯中毒再生障碍性贫血血虚证模型 ; 同年吉林省中医中药研究院高洪波建立环磷酰胺 丝裂霉素 C 骨髓损伤血虚证模型 ;2001 年上海中医药大学的金若敏等创建了乙酰苯肼与环磷酰胺联合造模方法造成小鼠血虚模型 2001 年梁毅采用慢性放血结合饥饿 疲劳之法制作出复合血虚证小鼠模 [1] 型 虚则补之, 是虚证治疗的总则 中医根据血虚证的不同病因 病机 证型, 辩证施以补血法 常用方有四物汤 当归补血汤 八珍汤 归脾汤等 现代研究表明许多补血方药都通过增强免疫, 促进造血干祖细胞的增殖分化, 促进血细胞 [2] 的生成而发挥补血作用 实验研究较多的有四物汤 当归补血汤 八珍汤 八珍汤出自 瑞竹堂经验方, 由当归 川芎 熟地黄 白芍药 人参 甘草 茯苓 白术组成, 具有益气补血之功效 方中人参和熟地黄相配伍, 甘温益气补血 ; 当归协熟地黄补益阴血, 白术助人参益气补脾 ; 白芍药养血滋阴, 川芎行气活血, 使补而不滞, 合当归 熟地共显补血之效 ; 茯苓渗湿健脾, 炙甘草补中益气 数药合用共彰气血双补之功 主治气血两虚诸证, 以气短乏力 心悸失眠 头目眩晕 舌淡 脉细无力为证治要点 现代医学之产后虚弱 贫血 神经

2 衰弱等各种慢性疾病, 以及妇女月经不调 习惯性流产等有气血两虚见证者, 皆可加减运用 近年来, 对八珍汤临床应用的探索在逐步推进, 广泛用于失血贫血 [3] 症 心血管疾病 妇科疾病 创伤愈合以及肿瘤放化疗后不良反应控制 现代研究认为八珍汤能显著增强机体的免疫功能, 促进骨髓造血干祖细胞的增殖, 促进淋巴细胞活化及分泌 IL-2 等 实验证明, 该方及其制剂能增强血虚小鼠的细胞免疫 体液免疫和非特异性免疫作用, 防治实验性白细胞减少, 提高失血后小鼠的 Hb RBC 及红细胞 C3b 受体 (RBC.c3bR) 水平, 降低红细胞免疫复合物 (RBC.ICR) 水平, 改善气虚大鼠的血液流变学及细胞形态学异常, 改善贫血症状 研究认为八珍汤补血的作用与刺激脾淋巴细胞产生集落刺激因子 (CSFs) EPO 及 EPO 样生长因子的分泌 造血微环境的基质细胞分泌正性和负性造血生长因子等有关 研究显示八珍汤能促进环磷酞胺所致血虚模型小鼠骨髓细胞增殖, 经八珍汤诱导制备的巨噬细胞 脾细胞 肺条件培养液和骨骼肌条件培养液能促进血虚模型小鼠骨髓细胞增殖, 促进血虚模型小鼠骨髓基质细胞分泌肿瘤坏死因子 [2] 四物汤出自唐 蔺道人 仙授理伤续断秘方, 系从汉代 金匮要略 胶艾汤化裁而来, 由当归 川芎 白芍 熟地各等分组成 以其配伍关系研究, 四物汤具有滋养强壮 改善血液循环 镇痛 镇静 调经与增强产后子宫收缩的作用 从而改善因血虚而致的各种症状 而其近代药理学研究则表明, 四物汤具有补血 调节免疫 抗缺氧 抗自由基损伤 抗辐射损伤 调节子宫活动 降血脂 增强 [4] 心脏泵血功能 抗药物毒性及抗突变等作用 四君子汤源于宋代 太平惠民和剂局方, 由人参 白术 茯苓 甘草四药组成, 具有益气补中 健脾养胃的作用 作为调补正气的基础方, 临床运用范围 [5] 较广 四君子汤在临床上也是用于脾虚血亏之基本方剂 疗治茶谈 中载 四君子汤以颜面萎黄及唇色血少二证为目标 现代实验研究也证实了四君子汤的补气生血作用, 对大鼠灌服该方煎剂一周后, 可见动物红细胞生成功能增强, [6] 能量代谢明显升高 ; 此外, 该方还表现出明显的抗家免血小板聚集作用 根据传统中医理论, 血虚除补血外, 还需补气 因为气血相依相生, 血为气之母, 气为血之帅 指的就是血能帮助气的生成, 气能带动血液的循环 只有气血这两大循环系统调和通畅, 血虚才能有效改善 而气血的生成, 一是靠营养物质的摄入 ; 二是靠脾胃的运化功能 因此, 改善血虚, 不但要补充充足的营养物质, 还要健脾助运, 提高机体对营养物质的利用, 促进气血生化 因此, 气血双向调理是治疗血虚的第一步, 也是关键得一步 八珍汤是四君子汤和四物汤的复方 祖国医学认为 气为血帅, 血为气母, 精生血, 精血同源, 互相资生, 互为依存 四君子汤健脾益气 四物汤补血养血, 八珍汤汇两方之功, 奏两方之效 常用于病后失调 久病失治 失血过多等慢性消耗性疾病 [11] 三 提炼出论据和论证 : 八珍汤出自 瑞竹堂经验方, 由当归 川芎 熟地黄 白芍药 人参 甘草 茯苓 白术组成, 具有益气补血之功效 方中人参和熟地黄相配伍, 甘温益气补血 ; 当归协熟地黄补益阴血, 白术助人参益气补脾 ; 白芍药养血滋阴, 川芎行气活血, 使补而不滞, 合当归 熟地共显补血之效 ; 茯苓渗湿健脾, 炙甘草补中益气 数药合用共彰气血双补之功 主治气血两虚诸证, 以气短乏力 心悸失眠 头目眩晕 舌淡 脉细无力为证治要点 现代医学之产后虚弱 贫血 神经衰弱等各种慢性疾病, 以及妇女月经不调 习惯性流产等有气血两虚见证者, 皆

3 可加减运用 近年来, 对八珍汤临床应用的探索在逐步推进, 广泛用于失血贫血 [3] 症 心血管疾病 妇科疾病 创伤愈合以及肿瘤放化疗后不良反应控制 现代研究认为八珍汤能显著增强机体的免疫功能, 促进骨髓造血干祖细胞的增殖, 促进淋巴细胞活化及分泌 IL-2 等 实验证明, 该方及其制剂能增强血虚小鼠的细胞免疫 体液免疫和非特异性免疫作用, 防治实验性白细胞减少, 提高失血后小鼠的 Hb RBC 及红细胞 C3b 受体 (RBC.c3bR) 水平, 降低红细胞免疫复合物 (RBC.ICR) 水平, 改善气虚大鼠的血液流变学及细胞形态学异常, 改善贫血症状 [2] 四物汤出自唐 蔺道人 仙授理伤续断秘方, 系从汉代 金匮要略 胶艾汤化裁而来, 由当归 川芎 白芍 熟地各等分组成 以其配伍关系研究, 四物汤具有滋养强壮 改善血液循环 镇痛 镇静 调经与增强产后子宫收缩的作用 从而改善因血虚而致的各种症状 而其近代药理学研究则表明, 四物汤具有补血 调节免疫 抗缺氧 抗自由基损伤 抗辐射损伤 调节子宫活动 降血脂 增强 [4] 心脏泵血功能 抗药物毒性及抗突变等作用 四君子汤源于宋代 太平惠民和剂局方, 由人参 白术 茯苓 甘草四药组成, 具有益气补中 健脾养胃的作用 作为调补正气的基础方, 临床运用范围 [5] 较广 四君子汤在临床上也是用于脾虚血亏之基本方剂 疗治茶谈 中载 四君子汤以颜面萎黄及唇色血少二证为目标 现代实验研究也证实了四君子汤的补气生血作用, 对大鼠灌服该方煎剂一周后, 可见动物红细胞生成功能增强, [6] 能量代谢明显升高 ; 此外, 该方还表现出明显的抗家免血小板聚集作用 根据传统中医理论, 血虚除补血外, 还需补气 因为气血相依相生, 血为气之母, 气为血之帅 指的就是血能帮助气的生成, 气能带动血液的循环 只有气血这两大循环系统调和通畅, 血虚才能有效改善 而气血的生成, 一是靠营养物质的摄入 ; 二是靠脾胃的运化功能 因此, 改善血虚, 不但要补充充足的营养物质, 还要健脾助运, 提高机体对营养物质的利用, 促进气血生化 因此, 气血双向调理是治疗血虚的第一步, 也是关键得一步 八珍汤是四君子汤和四物汤的复方 祖国医学认为 气为血帅, 血为气母, 精生血, 精血同源, 互相资生, 互为依存 四君子汤健脾益气 四物汤补血养血, 八珍汤汇两方之功, 奏两方之效 常用于病后失调 久病失治 失血过多等慢性消耗性疾病 [11] 由上述可见, 八珍汤和四物汤都具体很好的补血作用, 是血虚证动物模型常用方 四君子汤在促进血液生成方面也有一定作用 从八珍汤的药物组成可以看出八珍汤由四物汤和四君子汤两个方子组成, 其中四物汤偏于补血, 四君子汤偏于补气, 于是我就想比较一下八珍汤 四物汤和四君子汤对血虚小鼠造血功能的改善作用孰优孰劣 想探索一下气血双补改善血虚小鼠造血功能和单纯补血或单纯补气的疗效比较 顺便验证一下 气能生血 这一中医理论 四 得出结论和假说 : 八珍汤和四物汤都具体很好的补血作用, 是血虚证动物模型常用方 四君子汤在促进血液生成方面也有一定作用 那么八珍汤 四物汤 四君子汤的疗效孰优孰劣? 气血双补 单纯补血 单纯补气对于血虚证动物模型的疗效比较 假说 : 八珍汤对由 APH 造成的血虚小鼠造血功能的改善作用优于四物汤和四君子汤, 气血双补改善血虚小鼠造血功能比单纯补血或单纯补气更有疗效 五 设计可行的实验方案小鼠乙酰苯肼血虚证造模及八珍汤及其所含方剂疗效比较

4 1 材料与方法 1.1 实验动物分组与处理 KM 小鼠 50 只, 雄性, 6~8 周, 体重 18~22g, 常规饲养 根据四诊 1d 的数据, 再对动物进行科学的分组 于造模前, 对各组小鼠进行血液学检查 对 50 只小鼠进行四诊, 根据四诊 1d 的数据, 对动物进行科学的分组, 使得组间的气血阴阳区别尽量降到最小, 对于有明显阴阳气血亏虚体质的小鼠予以剔除, 重新纳入平和体质小鼠进行试验, 从而分组 造模前, 各组小鼠进行血液学检查 小鼠尾静脉采血 50μ l, 经稀释后用血球分析仪测定白细胞 (WBC ) 数 红细胞 ( RBC ) 数 血红蛋白 (H b) 量 网织红细胞 ( RET) 数 血小板 ( PLT) 量和红细胞压积 (HCT) 等指标 这样实验前后有对比性, 而且通过检测同时可以发现哪只小鼠造模前本身就血虚或者有其他血液方面的问题, 可以及时进行剔除, 以保证 [7] 实验的准确性 随机分为 5 组 : (1) 正常组 :10 只小鼠, 分别在第 1 4 天注射与造模等量的生理盐水 ; 第 1~7 天每天 1 次灌胃自来水 0.5ml/ 只 (2) 模型组 :10 只小鼠, 第 1 天进行皮下注射 2% 乙酰苯肼 ( APH) 溶液 ml/ 10g, 第 4 天皮下注射 2% 乙酰苯肼 ( APH) 溶液 0.05 ml/ 10g, 共两次 ; 第 1~7 天每天 1 次灌胃自来水 0.5ml/ 只 (3) 治疗 1 组 ( 八珍汤组 ):10 只小鼠, 造模同模型组, 第 1~7 天, 每天 1 次灌胃八珍汤煎液 0.5ml/ 只 (4) 治疗 2 组 ( 四物汤组 ):10 只小鼠, 造模同模型组, 第 1~7 天, 每天 1 次灌胃四物汤煎液 0.5ml/ 只 (5) 治疗 3 组 ( 四君子汤组 ):10 只小鼠, 造模同模型组, 第 1~7 天, 每天 1 次灌胃四君子汤煎液 0.5ml/ 只 1.2 处方 制备与用量八珍汤 : 当归 10g, 川芎 5g, 白芍 8g, 甘草 5g, 熟地 15g, 人参 3g, 白术 10g, 茯苓 8g, 以上方药在水中浸泡 0. 5h 后, 加以为药材总体积 10 倍的水, 煮沸 1h, 滤出药液 ; 再加 5 倍体积水, 煮沸 0. 5h, 滤出药液, 两次药液合并, 水 [8] 浴蒸发至终浓度为 2g/ ml 的生药药液 四物汤 : 当归 10g, 川芎 5g, 白芍 8g, 熟地 15g, 以上方药在水中浸泡 0. 5h 后, 加以为药材总体积 10 倍的水, 煮沸 1h, 滤出药液 ; 再加 5 倍体积水, 煮沸 0. 5h, 滤出药液, 两次药液合并, 水浴蒸发至终浓度为 2g/ ml 的生药药液 四君子汤 : 甘草 5g, 人参 3g, 白术 10g, 茯苓 8g, 以上方药在水中浸泡 0. 5h 后, 加以为药材总体积 10 倍的水, 煮沸 1h, 滤出药液 ; 再加 5 倍体积水, 煮沸 0. 5h, 滤出药液, 两次药液合并, 水浴蒸发至终浓度为 2g/ ml 的生药药液 1.3 实验室指标 : (1) 四诊检测指标 : 体重 饮水 摄食 腋温 爪和尾显微数码拍照获取反映红色程度指标 r 值 晚间 35s 自主活动计数, 以及一般外观表现的观察 以上指标第 日各检测 1 次, 共 3 次 具体检测方法如下 : 体重电子天平测量 饮水摄食量每只日摄食量 = ( 上次加入的饲料量 - 剩余量 ) / ( 小鼠只数 * 间隔天数 ) 每只日饮水量 = ( 上次加入的饮水量 - 剩余量 ) / ( 小鼠只数 * 间隔天数 )

5 腋温左手抓住小鼠, 暴露腹部, 右手持温度计, 将温度计探头预热后插入小鼠左腋下, 以温度计上的数值上升到不再上升为止, 即可以读出相应的腋温数值 爪和尾显微放大拍照和图像处理获取 r 值第一步 : 将小鼠左后爪 ( 尾 ) 分别放在载物台上, 爪面向上, 使每只小鼠左后爪 ( 尾 ) 的方向一致, 调整显微镜的微调按钮, 使之放大倍数为 8 倍, 手动模式 ( M ), 曝光模式 : 尾 -M ( 1 /30,F4. 5), 爪 -M ( 1 /30, F4. 5 ),ISO:400 下拍摄 将拍摄后的照片输入电脑 第二步 : 采用 Photoshop7. 0 图像软件进行处理, 选取爪的掌部及尾部作为 RGB 色度的定量分析 作为国际标准色的定量,R 代表红色,G 代表绿色,B 代表蓝色, 得到原始爪尾 RGB 分量值 将 RGB 值带入公式 r= R /( R+ G + B ), 得出 r 值 能反映红色程度的深浅 小鼠晚间 35s 自主活动计数将数码相机固定在三脚架上, 位于观察笼正上方 打开相机电源至录像模式, 将鼠笼置于地面, 垂直于数码相机下方 将小鼠从饲养笼中转移到洁净透明的小鼠饲养笼内, 待小鼠适应新环境 10min 后, 用数码相机拍摄小鼠 35s 录像 输入电脑后, 可反复播放, 并逐一记录 35s 内不 [9] 同小鼠水平行走的格数 垂直探头次数 能反映晚间动物自主活动状况 (2) 外周血象的检测 : 于末次给药后 1h, 所有小鼠摘眼球取血数滴, 以备外周血检测 RBC WBC HGB PLT HCT RC (3) 对造血微环境影响的检测 : 小鼠处死后, 取其一侧股骨制成切片, 进行骨髓组织形态观察 计算造血组织 脂肪组织和血窦的容量百分率 ( Vol% ), 以及巨核细胞数 光镜形态观察, 各组骨髓组织容量百分含量变化 ( 造血组织 Vol% 血窦 Vol% 脂肪组织 Vol% 巨核细胞数) [10] (4) 血细胞再生功能检测 : 小鼠于末次灌胃给药前称重, 摘眼球取血后拉椎处死, 处死后分别取出胸腺和脾脏, 剥离干净后, 于扭力天平上称重 脏器指数 = 脾 ( 胸腺 ) 重量 (mg)/ 小鼠体重 (g) [11] (5) 血清总抗氧化能力测定 : 参照案例报告 (6) 肝脾外观及病理 (HE 染色 ): 参照案例报告 (7) 小肠病理 (HE 染色 ): 参照案例报告 (8) 肾脏 EPO 相对表达量 : 参照案例报告 个人认为, 此次试验的结果可能做出来不能很好地验证之前提出来的假说的原因有如下几点 :1 小鼠各组间气血阴阳不平衡, 因此很难再实验中比较出各方子的疗效 2 造模的试剂及具体计量 注射频率等没有统一的标准, 影响到各方子最终的疗效 3 药材的质量 煎煮的方法和时间 灌胃的频率等都有可能影响最终的实验结果 此外各汤药的最佳治疗计量没有明确的标准 4 抓鼠 灌胃的动作不规范 5 在测量各指标的过程中, 操作失误或者不严谨都会影响最终的实验结果 六 参考文献 [1] 计小清. 中医血虚证的实验研究进展 [J]. 辽宁中医杂志,2006,33(6): [2] 龚文君, 沃兴德. 血虚证的现代研究概述 [J]. 现代生物医学进展.2007,7(6): [3] 张聪. 八珍汤的临床应用 [J]. 黑龙江中医药.2012.(2): [4] 段恒. 四物汤的实验研究进展 [J]. 浙江中医杂志.2002: [5] 庞来祥. 四君子汤药理作用的研究进展 [J]. 中医药信息.1991,(1):23-26.

6 [6] 李行利. 四君子汤研究进展 [J]. 中成药.1992,14(7):41. [7] 周俊, 黄丽萍, 吴素芬, 熊玉洁, 李森. 三种血虚小鼠模型造模方法的比较研究, 时珍国医国药,2011,22(8): [8] 江南, 罗霞, 陈东辉等. 八珍汤对小鼠造血细胞因子影响的研究 [J], 四川大学学报,2003,40(1): [9] 卢文丽, 方肇勤, 潘志强等. 四种不同品系小鼠气虚血虚证候的比较与评价 [J], 辽宁中医杂志,2007,34(4): [10] 聂金娜, 蔡万德, 王迪. 八珍汤及其所含方剂对血虚小鼠造血功能的影响 [J], 长春中医药大学学报,2007,23(2): [11] 聂金娜. 八珍汤及其所含方剂对血虚小鼠影响的实验研究 [D], 长春 : 床春中医药大学,2007:10.

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