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永元
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1 生物信息学第九章 RNA 生物信息学 (Bioinformatics of RNA) 主讲 : 张志勇 (Zhiyong Zhang) zzyzhang@ustc.edu.cn 电话 :

2 中心法则 DNA:Deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸 ; RNA:RiboNucleic Acid, 核糖核酸 ; 2

Functional elements in the human genome 3.

7% Satellite DNA (centromeres, telomeres) 12% Introns 25% intergenic DNA 60-70% 86% no (known)

3 Functional elements in the human genome nt protein genes trna, rrna, Coding regions 0,5% (proteins) 1.7% Satellite DNA (centromeres, telomeres) 12% Introns 25% intergenic DNA 60-70% 86% no (known) function non-translated RNA genes: Xist, H19, His-1, bic, micrornas, etc. Regulatory elements: promoters, enhancers, etc. Transposable elements (LINEs, SINEs,...): 40-45% 3

4 本章内容提要 1. RNA 的结构层次 2. 主要 RNA 的结构与功能 3. mirna 及其靶基因预测 mirna 靶基因预测方法 mirna 数据资源 4. 长非编码 RNA(lncRNA) 5. RNA 二级和三级结构预测 2D Dot plot 最小自由能 - 动态规划算法 4

5 1. RNA 结构层次一级序列二级结构三级结构 RNA 的互补序列是形成二级结构的基础 5

6 同源 RNA 序列的协同变异 RNA 中互补碱基对形成的保守的二级结构往往比序列本身更重要 covariation 6

7 RNA 二级结构由自身序列折叠形成配对区和不配对区的多种组合模式, 构成不同的二级结构 : 配对的双链 RNA 螺旋, 发卡环, 突环, 内环, 多分支环互补配对 :C 与 G, 三对氢键相互作用, 最稳定 ;A 与 U, 二对氢键相互作用不稳定配对 :G 与 U, 一对氢键相互作用 7

8 RNA 二级结构类型 8

9 RNA 二级结构单元间的相互作用一般不易用二级结构预测工具发现假结 (pseudoknot) 相吻发卡 (kissing hairpin) 发卡 - 突环接触 (hairpin - bulge loop) 9

10 RNA 三级结构类似蛋白质, 单链 RNA 分子发挥生物学功能, 往往需要特异性的三级结构二级结构单元以氢键相互作用形成骨架 RNA 带电荷, 金属离子, 如 Mg 2+, 常常需要参与稳定二级结构及三级结构 Structure of a hammerhead ribozyme, a ribozyme that cuts RNA 10

11 2. RNA 的主要种类及功能种类功能信使 RNA mrna 蛋白质合成模板核糖体 RNA rrna 核糖体组分转运 RNA trna 转运氨基酸核内不均一 RNA HnRNA 成熟 mrna 前体核内小 RNA SnRNA 参与 HnRNA 剪切转运核仁小 RNA SnoRNA rrna 的加工修饰胞浆小 RNA scrna 组成蛋白质内质网定位合成的信号识别体小干扰 RNA sirna 通常为外源, 通过和相应蛋白结合形成 RISC, 降解互补的目标 mrna 微 RNA mirna 通常为内源, 通过和靶基因 mrna 配对引导 RISC 降解 mrna 或阻碍其翻译 11

12 mrna 的结构与功能 mrna 成熟过程内含子 (intron) 外显子 (exon) 核内不均一 RNA hnrna mrna 12

13 mrna 的一级结构特点 1. 大多数真核 mrna 的 5 末端均在转录后加上一个 7- 甲基鸟苷, 同时第一个核苷酸的 C 2 也是甲基化, 形成帽子结构 :m 7 GpppN m - 2. 大多数真核 mrna 的 3 末端有一个多聚腺苷酸 (polya) 结构, 称为多聚 A 尾 13

14 mrna 二级结构与功能 mrna 通常由于自身回折在若干局部产生双链, 形成二级结构 mrna 二级结构可能对翻译蛋白质的效率有很大影响有些基因利用 mrna 二级结构对转录或翻译进行调控 14

15 Riboswitch mrna 5 -UTR 中一类典型的结构元件它特异性结合小分子代谢物, 通过构象变化, 在转录水平和翻译水平调节表达大多数 riboswitch 可以分成 2 个结构域 : 适体结构域 (aptamer domain, AD) 和表达结构域 (expression domain, EPD) AD 是一个高度折叠的结构, 能选择性地结合于特定的代谢物 AD 结合代谢物后, 自身的构象发生变化, 信息传递至 EPD 后者形成选择性茎环结构 EPD 的构象变化使 mrna5 非编码区可以在 2 种结构状态下切换 :1 种适合基因表达,1 种不适合基因表达, 从而选择性地调控基因表达模式 15

16 Structure of the SAM-1 Riboswitch Aptamer Domain 16

17 rrna 的结构与功能 Central domain 3 major domain 大肠杆菌 16S rrna 的二级结构 5 domain 3 minor domain 17

18 rrna 的序列结构特点甲基化位置在核糖 2' - 羟基上, 真核生物 rrna 的甲基化程度比原核生物 rrna 甲基化程度高如哺乳动物中,18S 和 28S 的 rrna 约 2% 核苷酸甲基化 ; 单链 RNA 自折叠, 形成螺旋区和环区 ; 所有螺旋区碱基均保守 ; 所有来源的 rrna 均能形成 4 个结构域,(Ⅰ Ⅱ Ⅲ 和 Ⅳ), 每个结构域均含许多茎 ( 螺旋段 ) 和环, 它们通过相邻碱基对的相互反应彼此靠近 ; 18

19 30S 小亚基的三维结构 3 major domain Central domain 5 domain 19

20 50S 大亚基的三维结构 20

21 完整核糖体的三维结构 Venkatraman Ramakrishnan Thomas A. Steitz 2009 年诺贝尔化学奖 Ada E. Yonath 21

22 rrna 的结构与功能关系核糖体每个亚基均以 1 或 2 条高度折叠的 rrna 为骨架, 将几十种蛋白质紧密结合在一起,rRNA 大部分被包围在内核核糖体的活性中心全部由 RNA 构成 rrna 的 SD 互补序列提供对 mrna 中 SD 序列的识别 rrna 中的保守碱基形成核糖体解码的关键区域在序列上分散的功能位点, 在 3D 结构中相接近在核糖体合成蛋白质时,rRNA 发生显著构象变化, 导致 rrna 上功能位点的暴露, 从而执行相应功能 22

23 Spliceosome spliceosomal protein >50 spliceosomal RNA ~7 U1, U2, U4, U5, U6, U7, U12

24 Spliceosome

25 trna 的结构与功能 trna 的一级结构特点大多数由 75~77 个核苷酸组成,15~16 个为固定核苷酸, 不同种类 trna 中,61~62 个位点可变含稀有碱基较多 5 末端大多数为 G 3 末端为 CCA-OH O O O OH CH 3 HN 1 NH HN N HN CH 2 N N 7 O 5 R N I N O R CH 2 H N 2 N N R DHU ψ m G 25 N R

26 trna 的二级结构三叶草形氨基酸臂额外环 26

27 trna 的三级结构倒 L 形许多氢键由固定碱基形成多种 trna 形成相同的三级结构几乎所有碱基均定向排列形成堆叠 (stacking), 疏水面堆叠作用是稳定 trna 三级结构的主要因素 27

28 Ribozyme 核酶 (Ribozyme): 具有催化功能的 RNA 分子 Structure of a hammerhead ribozyme, a ribozyme that cuts RNA 28

29 snornas snornas: Small nucleolar RNAs 核仁小 RNA; 介导其他 RNA 分子的化学修饰, 例如甲基化 29

30 RNAi Science 周刊连续两年将小 RNA(small RNA) 评选为该年度全球科学十大进展, 而 2002 年更将其作为进展的第一位这表明 Small RNA 的研究已引起国际上的广泛关注, 也预示着这一领域将取得突破长期以来人们一直认为 RNA 分子的主要作用是与蛋白质合成有关, 无论是 mrna, rrna 还是 trna, 它们一起构成一套精密的机构将 DNA 中的基因信息传递到蛋白质但自上世纪九十年代以来对小片段 RNA 研究的一系列新发现, 使人们不得不重新认识 RNA 在生命活动中的重要作用其中最突出的例子是由研究基因沉默现象 (Gene Silencing) 而导致 RNA 干涉 (RNA Interference,RNAi) 的发现 30

外源 sirna 对 RNA 干涉机制的研究发现 :dsrna 一旦进入细胞内, 就会被一个称为 Dicer 的特定的酶切割成为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA(small interfering RNAs,siRNA) 片段,Dicer 酶属于 RNaseIII 家族中能特异识别双链 RNA 的成员, 它以 ATP 依赖的方式切割由外源导入或者由转基因

31 外源 sirna 对 RNA 干涉机制的研究发现 :dsrna 一旦进入细胞内, 就会被一个称为 Dicer 的特定的酶切割成为核苷酸长的小分子干扰 RNA(small interfering RNAs,siRNA) 片段,Dicer 酶属于 RNaseIII 家族中能特异识别双链 RNA 的成员, 它以 ATP 依赖的方式切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链 RNA 切割产生的 sirna 片段随后与一些酶结合成为诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex,risc) 激活的 RISC 通过碱基配对定位到与 sirna 同源的 mrna 转录本上, 并在距离 sirna 的 3 端一定位置上切割该 mrna, 使与此 mrna 相应的特定基因成为沉默状态 31

32 内源 mirna mirna 首次发现于 1993 年, 是在对秀丽新小杆线虫发育过程的研究中发现的, 命名为 Lin-4, 它通过与 Lin-14 的 3 UTR 相互作用, 调节线虫的发育随后, 在线虫果蝇 Hela 细胞斑马鱼人类拟南芥和水稻等多种真核模式生物中找到了上百个类似的小分子 RNA, 并将其称 mirna 一类广泛存在于真核生物中的内源性非编码小 RNA 分子 ( 约 22 个核苷酸 ), 32

33 mirna 的生物起源 mirna 基因成熟 mirna 和 mirna* 细胞转录 Dicer 酶剪切降解核初始 mirna 剪切转运蛋白成熟 mirna mirna* mirna 前体 ~70bp RNA 诱导沉默复合物 mirna 种子区与靶 mrna 完全互补则降解细胞质靶 mrma 3 端细胞 mirna 种子区与靶 mrna 不完全互补则抑制翻译 33

34 mirna 的作用机制转录后水平上通过调节靶基因行使功能 : 和其靶基因 3 非翻译区结合, 导致 RNA 诱导的沉默复合体 RISC 降解其靶 mrna 或阻碍其靶的翻译抑制或降解 : 取决于 mirna 与靶 mrna 的互补程度两者完全互补 : 降解两者不完全互补 : 抑制翻译 34

35 mirna 与疾病 mirna 在疾病的发生发展过程中起着巨大的作用, 其功能异常能够导致各种人类复杂疾病的发生 mirna 可能成为疾病诊断预后判断的生物学标记 (biomark), 并为更进一步理解复杂疾病的发病机理提供了新的手段 35

36 RNA 生物信息学非编码基因的预测非编码基因表达调控元件的预测非编码 RNA 靶元件的预测非编码 RNA 与其他生物大分子相互作用的预测 36

37 3. mirna 及其靶基因预测认识 mirna 的作用机制, 关键是认识 mirna 及其靶基因的相互作用第一个 mirna 及其靶基因于 1993 年通过经典遗传学方法鉴定, 然而直到 2001 年才相继有其他 mirna 的报道尽管缺乏敏感的 mirna 克隆方法和鉴定 mirna 靶基因的高通量实验方法, 但人们在研究过程中发现,miRNA 和靶基因的相互作用具有一定的规律性, 可以用生物信息学方法进行预测 37

38 mirna 的特点序列特点长度 19~24nt, 不编码蛋白质种子区域 : 通常指 mirna 5 端第二位到第八位的核苷酸序列成熟的 mirna 5 端为单一磷酸基团,3 端为羟基 mirna 倾向于成簇出现在染色体上, 通常定义 50kb 的距离为一簇在物种间高度保守表达特点 mirna 具有时序性以及组织特异性, 在特定的时间, 组织中才会表达调控特点 mirna 与其靶基因间是多对多的关系, 一个 mirna 可能调 38 控多个靶基因, 一个基因也可能受多个 mirna 调控

39 基于序列的 mirna 靶基因预测方法 mirna 靶基因预测遵循的基本原则 miranda TargetScan 机器学习方法 39

40 mirna 靶点类型 mirna 的靶点通常分为两类 : I. 5 端主导型 (5 -dominant) II. 3 端补充型 (3 -compensatory) 5 端主导型又分为 5 端主导的标准型 (canonical) 和种子型 (seed) 40

41 种子是指从 mirna 序列 5' 端第 1 个或第 2 个核苷酸起向 3' 末端延伸的连续 7 个核苷酸 5' 端标准主导型指 mirna 种子序列和 3' 端一些连续的碱基与靶基因完全互补 ;5' 端种子主导型指 mirna 种子序列和 3' 端有限的一些碱基和靶基因完全互补 ;3' 端互补型指 mirna 序列 3' 端碱基和靶基因发生不完全互补配对, 同时有个别配对向种子区延伸 41

42 mirna 靶基因预测遵循的原则和基本步骤遵循的原则 mirna 的种子区与 mrna 的 3 UTR 序列碱基互补靶点在多物种间的序列保守性 mirna 与 mrna 形成双链结构的热力学稳定性靶基因二级结构和靶点外的序列对靶基因预测的影响基本步骤 : 1. 在 3 UTR 上探寻和 mirna 种子区完全互补的序列 ; 2. 计算 mirna 和这些序列结合产生的自由能下降值, 对靶点进行筛选 ; 3. 对靶点进行物种间序列比对, 利用物种保守性进一步筛选 42

43 高等生物 mirna 靶基因预测软件 43

44 1>miRanda 第一个利用生物信息学方法开发的基于序列的 mirna 靶基因预测算法 44

45 miranda 算法的基本步骤对 mirna 和 mrna 的 3 UTR 序列进行碱基互补分析 ; miranda 采用一种类似于 Smith-Waterman 的算法来构建打分矩阵 ; mirna 与靶基因形成二聚体的热力学稳定性方面, miranda 利用 Vienna 软件包中的 RNAlib 计算 mirna 与 mrna 3 UTR 结合的自由能 ; miranda 要求靶点在多物种间保守, 即靶点在多物种 3 UTR 序列比对中相同位置具有相同的碱基 45

46 2>TargetScan TargetScan 主要考虑物种间保守的 mirna 靶基因, 并且在 TargetScan 中首次提出了种子匹配 (seed match) 的概念 46

47 TargetScan 算法的基本步骤在 TargetScan 算法中, 种子匹配被定义为 mirna 5 端的第 2~8 位碱基与 mrna 3 UTR 上的一段 7nt ( nucleotide ) 序列完全互补, mirna 上的这 7 个核苷酸被称为 mirna 种子区从种子区开始向 mirna 两侧寻找互补碱基, 允许 G-U 配对, 直到出现碱基错配为止在物种保守方面,TargetScan 算法发现随着物种数目的增多, 预测的靶基因数目逐渐减少, 但预测结果的准确率得到提高 47

48 3> 机器学习方法通过在少量实验证实的 mirna 靶基因集合内提取 mirna 与靶基因的结合特征, 并利用这些特征训练分类器来预测 mirna 的靶基因如 TargetBoost 和 mitarget 等 mirna 靶基因预测算法都是基于机器学习方法开发的, 这些算法从实验证实的 mirna 靶基因集出发, 评估 mirna 与靶基因结合的序列特征二聚体结构特征和热力学特征等参数, 最后对预测的靶基因进行打分 48

49 mrna 二级结构的影响在 mirna 与靶基因结合的过程中, mrna 的 3 UTR 二级结构起着重要作用 mirna 靶点几乎都落入 3 UTR 的二级结构不稳定区域内, 通过计算 mrna 的 3 UTR 二级结构被破坏形成或破坏碱基互补配对形成 mirnamrna 二聚体时获得或损失的自由能, 可以鉴别 mirna 靶基因 ; 通过实验发现, 提高靶点附近序列二级结构的稳定性大大降低了 mirna 对靶基因的作用 49

50 靶点周围序列的影响靶点外的序列也对 mirna 调节靶基因起到重要作用靶点后的一段序列对 mirna 与靶基因的识别起着重要的作用, 对该段序列突变后 mirna 对靶基因的调控作用明显减弱, 而将该段序列完全删除后 mirna 对靶基因的调控作用完全消失在 mirna 调控靶基因的过程中, 靶点外的其他序列甚至整个 3 UTR 序列都起到了关键作用, 这些序列可能是 RNA 结合蛋白的作用位点 50

51 基于表达信息或实验结果预测 mirna 靶基因最初, 研究人员认为 mirna 结合在 mrna 的 3 UTR 上抑制 mrna 翻译成蛋白质, 降低蛋白质丰度, 并不会影响到相应 mrna 的表达水平现在已经明确认为 : 在许多情况下,miRNA 还能直接对 mrna 的表达产生影响现已经开发了整合表达信息的 mirna 靶基因预测算法, 并证明了表达信息在 mirna 靶基因预测上的重要价值 51

52 Huang 等人利用在 88 个组织中同时检测了 mirna 和 mrna 表达的数据, 并结合贝叶斯方法开发了靶基因预测算法 GenMiR++, 得到了 104 个人类 mirna 的高精度靶基因, 并通过实验证实了预测的 let-7b 靶基因, 结果表明, 与基于序列的方法相比, 利用相同样本中同时检测 mirna 和 mrna 的表达谱可以更准确的预测 mirna 靶基因 (Huang, Using expression profiling data to identify human microrna targets. Nat. Methods.) 52

178 个人类 mirna 的宿主基因分析, 发现预测准确性优于现存的基于序列的预测方法,HOCTAR 减少了基于序列算法预测的靶基因数量 ( V. A.

53 Gennarino 等人通过研究 mirna 宿主基因 (host gene) 的表达情况, 开发了 mirna 靶基因预测算法 HOCTAR HOCTAR 是第一个利用 mirna 宿主基因表达与 mrna 表达信息进行 mirna 靶基因预测的算法, 它基于两者表达的逆相关 (inversely correlated) 特征对预测的 mirna 靶基因进行筛选通过对 178 个人类 mirna 的宿主基因分析, 发现预测准确性优于现存的基于序列的预测方法,HOCTAR 减少了基于序列算法预测的靶基因数量 ( V. A. Gennarino, MicroRNA target prediction by expression analysis of host genes. Genome Res.) 人民卫生出版社 8 年制及 7 年制临床医学等专业用生物信息学 53

54 整合已有知识预测 mirna 靶基因在当前的 mirna 靶基因预测研究中, 研究人员逐渐意识到单一依靠序列信息或表达信息已不能继续提高 mirna 靶基因预测效能整合功能信息蛋白质互作信息表达信息序列信息以及当前实验证实的 mirna 靶基因等已有资源预测 mirna 靶基因十分必要高通量的实验方法预测 mirna 靶基因也在不断的发展中, 这些研究将对最终揭示 mirna 功能和参与的生物学过程找出 mirna 诱导的疾病发生机制以及最终将 mirna 用于治疗癌症等相关疾病具有重要意义 54

55 mirna 数据资源 TarBase 数据库目前使用广泛的存储真实 mirna 与靶基因间关系的数据库数据库以 Excel 文件形式存储, 可供用户下载本地化使用 55

56 microrna 靶基因数据库 - TarBase 56

57 mirbase 数据库集 mirna 序列, 注释信息以及预测的靶基因数据为一体的数据库, 是目前存储 mirna 信息最主要的公共数据库之一主要采用 miranda 算法预测靶基因 57

58 microrna 靶基因数据库 -mirbase 58

59 mirgen 数据库整合了 mirna 靶基因数据 (Targets 库 ), 基因组注释信息 (Genomics 库 ) 以及位置关系 (Clusters 库 ) 的综合数据库靶基因库中, 采用四种常用的靶基因预测算法 DIANA-microT, miranda, PicTar, TargetScanS 对 mirna 的靶基因进行预测 v3/mirgen.html 59

60 microrna 靶基因数据库 - mirnamap 存储 mirna 及其靶基因信息包括四种类型的哺乳动物人类, 小鼠, 大鼠和犬 60

61 RNA22 数据库 RNA22 数据库主要为了算法 RNA22 而建立该算法不要求与物种间的保守性提出 mirna 靶位点可能存在于 5 UTR 已被实验证实与多数忽略或仅考虑少量 mirna 5 UTR 影响的算法相比具有其特定的生物学意义 61

62 microrna 综合数据库 - microrna.org 包含 mirna 靶基因以及表达谱数据 mirna 靶基因数据主要是利用 miranda 算法预测得来 mirna 表达谱数据来自一个针对人类主要器官和细胞系的小 RNA 库测序计划 62

63 microrna.org 查询功能已知 mirna 寻找其调控的靶基因选择导航条中的 mirna, 选择物种, 输入 mirna 的部分名称已知一个基因, 寻找它被哪些 mirna 调控及其位点选中导航条中的 Targeted mrna 然后输入基因名称, 从匹配的基因列表中选择感兴趣的基因 ( 具有同样名称的基因通常都是有相同 3 UTR) 已知一个或一个 mirna 集合, 寻找其在组织中的表达情况选择导航条中的 mirna, 输入全部或部分 microrna 名称, 在结果列表中选择 view expression profile, 将得到排在前 20 位的组织已知一个或多个组织, 寻找哪些 mirna 在其中表达选择导航条上的 mirna Expression 在结果中选择感兴趣的物种和组织, 将得到在这个组织中排名前 20 的的 mirna 63

64 4. 长非编码 RNA(lncRNA) 长非编码 RNA(lncRNA) 是一类转录本长度超过 200nt 的 RNA 分子, 没有长阅读框架但往往具有 mrna 结构特征 ( 帽式结构和 polya 尾巴 ) lncrna 在基因组中存在普遍的转录现象, 但它们并不编码蛋白, 较之编码蛋白质的基因, 往往表达水平比较低 lncrna 起初被认为是基因组转录的噪音, 不具有生物学功能然而, 近年来的研究表明,lncRNA 在多种层面上 ( 表观遗传调控转录调控以及转录后调控等 ) 调控基因的表达水平, 参与了 X 染色体沉默, 基因组印记以及染色质修饰, 转录激活, 转录干扰, 核内运输等多种重要的调控过程 lncrna 自身的表达水平也受到转录及转录后调控机制的严密调节. 许多 lncrna 都具有保守的二级结构, 剪切形式以及亚细胞定位, 这种保守性和特异性表明它们是具有功能的虽然近年来关于 lncrna 的研究进展迅猛, 但是绝大部分的 lncrna 的功能仍然是不清楚的 64

65 lncrna 的种类相对独立不与编码基因重叠的 RNA 如 Xist H19 HOTAIR 和 MALAT1 天然反义转录本如 Xist 和 Tsix 共同控制 X 染色体的失活假基因长的内含子区非编码 RNA 如 COLDAIR 与启动子联系的转录本或增强子 RNA 如 pasrnas 和 ernas 65

66 lncrna 的鉴定 : 数据整合对 lncrna 进行鉴定时, 采取的策略是收集不同类型的数据, 包括 polya RNA sequencing non-polya RNA sequencing 表观遗传信号值编码可能性保守性和 RNA 结构等, 并对其进行分析, 例如 CDS 的 RNA-seq polya 的表达值比较高, 而 ncrna 的 RNA-seq non-polya 表达值比较高. 通过对不同类型数据的整合, 还可以进一步得到不同类型基因元素的网络调控关系 66

67 lncrna 综合分析方法首先将基因组划分成小的单位 (bin), 根据 Gencode 的注释信息对每个 bin 进行注释后, 分别计算每个 bin 的特征值, 这些特征值包括序列保守性结构稳定性 RNA 表达值组蛋白修饰转录因子结合等, 进而利用机器学习的模型, 将 lncrna 与其他基因类别区分开, 并且对新的 lncrna 进行预测 67

68 lncrna 功能注释与预测由于 lncrna 的一级序列不保守二级结构也不稳定, 并且关于 lncrna 高通量的信息也十分有限, 因此对 lncrna 的功能注释和预测不是一件容易的工作, 对于生物信息学家来说仍然是一个挑战 68

69 lncrna 功能注释与预测方法基于共表达关系共表达网络, 即表达趋势一致的基因网络是对未知蛋白编码基因进行功能注释的方法之一同样 lncrna 与蛋白编码基因的双色共表达网络也是对 lncrna 进行功能注释的有效方法基于 mirna 调节 lncrna 是 mirna 的宿主之一 ;mirna 能以类似调节 mrna 的机制调节 lncrna 基于蛋白质结合如 lncrna 的转录过程受转录因子调控基于表观遗传修饰特征识别 lncrna 在各个生物过程中异常的表观遗传修饰 69

70 ncrna 数据库陈润生院士收集了在各种杂志上发表的网站上公布的所有被实验证实的 ncrna 基因, 发展了相应的软件及检索工具, 建成了 ncrna 数据库 70

71 5. RNA 二级和三级结构的预测 Cartoon depicting computer-assisted folding of an RNA structure. Prediction and design of DNA and RNA structures. New Biotechnology

72 目前已经获得大量的 RNA 的一级结构信息, 但是用实验的方法 (X 射线晶体衍射和核磁共振 ) 来确定生物分子的具体的三维空间结构花费高难度大, 而且并不是对所有分子都有效, 导致了已知的序列知识与结构知识之间形成了巨大的差距因此就有必要利用生物信息学的手段, 加之对已有生物分子结构和功能特性的认识, 通过计算机模拟和计算来预测出这些信息这样就可以用较低的成本和较快的时间获得具有一定可信度的结果生物信息研究者认为 :RNA 和蛋白质的三级结构很难通过一级序列直接得到, 预测二级结构是获取三级结构的必经之路预测 RNA 二级结构的本质, 就是找出一级序列的各个位点之间形成的配对关系 72

73 RNA 二级结构的预测方法同源比对方法统计学习方法热力学方法引入实验数据的二级结构预测 73

74 同源比对方法 RNA 的生物功能与其结构密切相关, 重要的 RNA 结构会在进化中体现出保守性在结构保守的位置, 配对碱基的序列突变会呈现出相关性, 如在不影响配对的情况下同时发生突变 ( 如 G-C 突变成 A-U 或 C-G) 因此, 通过从同源序列中寻找共突变的碱基对, 我们可以进行结构预测 74

75 统计学习方法已知结构的 RNA 越来越多如 RNA STRAND 收集了可信的 4666 个 RNA 序列和二级结构, 这些二级结构来自晶体衍射磁共振或 RNA 同源序列比对统计学习方法从已知的结构进行学习, 从而进行结构预测该方法统计不可避免会对训练数据集过学习, 即对训练数据集和相似数据集的预测效果超过普遍预测效果, 因此, 普遍情况下统计学习方法的准确率仍待确定 75

76 热力学方法从打分函数的不同上划分 : 1. 最大碱基配对数算法 2. 最小自由能算法从求解方法上划分 : 1. 点阵法 2. 动态规划法 76

77 预测方法一般不考虑假结最大碱基配对数算法和最小自由能算法, 只考虑碱基以嵌套模式配对情况, 都不能预测假结 77

78 二级结构预测 : Nested vs. Crossing 嵌套的交叉的 single sequence, nested single sequence, crossing Helical junction, nested Helical junction, crossing 78

79 假结 RNA 二级结构中茎区有时会形成一种特殊的位置关系, 称之为假结 (pseudoknot) 对于假结可以如下定义 : 在一段 RNA 序列中, 如果存在四个位点的碱基 i, i, j, j (i<i <j<j ) 满足 i 和 j 配对且 i 和 j 配对, 那么称碱基对 (i,j) 和 (i,j ) 形成了假结在序列长度小于 100 的简单的 RNA( 如 trna) 中, 一般不存在假结 ; 在较长较复杂的 RNA( 如 RNase) 中, 假结的个数也比较少, 一般只有一两个因此在早期的 RNA 二级结构预测研究中, 一般不考虑假结假结数量虽然少, 但通常在功能上起重要作用, 因此越来越多的研究者开始研究包含假结 RNA 的二级结构预测目前假结预测问题是 RNA 二级结构预测的难点和重点 79

80 2D Dot plot 80

81 环形图表示 RNA 二级结构中的碱基配对无线条交叉, 代表此结构中没有结 81

82 假节 : Crossing 82

83 2D Dot plot : Stem loop i j j+1 i-1 i i-1 No base pair i j+1 j j 83

84 2D Dot plot : Interior loop i k l j No base pair i k i j l k l j 84

85 2D Dot plot : Multi-branch loop i k l n m j No base pair i k l n i j k m l n m j 85

86 最小自由能方法最大碱基配对数方法所假设前提过于简单, 预测准确性较低最小自由能方法 : 尤其适用于小分子 RNA 采用动态规划算法, 计算对象不再是碱基配对数, 而是更为复杂的自由能参数根据碱基组成不同, 由实验方法测定 RNA 基本结构单元的自由能, 建立自由能参数表假设 RNA 基本结构单元的自由能具有相对独立性和可叠加性 86

87 87

88 E(i,i+1),E(i,i+2),E(i,i+3) = 0, i=1, L-3 5 For i=1,,l-n+1 j=i+n-1 88

89 最小自由能 - 动态规划算法 i k j Eij= minimum energy of segments r i r i+1 r j-1 r j Eik Ek+1j i k+1 Minimum energies of segments of length j-i+1 j 89

90 预测假结的动态规划算法 Rivas 和 Eddy 提出了可以预测假结的动态规划算法除了凸环内环等模体的影响, 递归关系中还加入了假结的自由能, 因此在时间和空间上都有消耗由于一个假结需要用四个参数来描述, 所以动态规划的递归关系中假结一项需要四层循环来寻找最优, 而计算动态规划表还需要两层循环, 故该算法的时间花费是 O(n 6 ), 空间花费是 O(n 4 ) 90

91 引入实验数据的二级结构预测除了晶体衍射和核磁共振, 化学标记 (chemical mapping) 也是重要的检测 RNA 二级结构的实验手段实验数据可用作限制条件, 对热力学模型或是概率模型进行修正最直接的做法是根据实验数据确定出一些配对的碱基或是单链碱基, 将它们硬性限制住, 再用最小自由能算法预测结构另一种方法是将 SHAPE 实验数据作为非硬性限制条件加入到自由能的计算式中, 预测最小自由能结构利用这种方法, 并结合进化信息, 已成功预测出 HIV-1 的基因组结构 91

92 预测工具 2D structure: the nested set of Watson-Crick base pairs, excluding pseudoknots Secondary structure: all Watson-Crick base pairs, including pseudoknots 92

93 预测工具简介 Mfold: 最早将核酸结构作为热力学系统模型的算法 : 正确结构为吉布斯自由能的最低或次优结构 ; 自由能参数来自实验数据 ; MPGAfold: 自由能参数, 遗传算法, 可预测假结 ; Kinefold: 自由能参数, 折叠动力学随机模拟, 可预测假结 ; RNAalifold: 最小自由能, 协同变异信息 NUPACK: 配分函数, 可预测假结多条链 93

94 预测工具简介 ( 续 ) UNAfold: Mfold 升级版, 配分函数提供详细的杂交配对折叠分析 ; Pfold : 随机上下文无关文法 ( SCFG, stochastic context-free grammars), 从已知的 RNA 结构数据库得到产生规则和进化速率, 使用明确的系统发育模型评估预测概率 ; PETfold:Pfold+ 折叠热力学 94

95 RNA 二级结构数据库 95

96 RNA 二级结构预测算法的发展方向假结的预测 ; 最小自由能模型与比较分析方法的结合 ; 与多序列比对和构建进化树等问题的结合 ; 不稳定因素的处理 : 对于一个给定的序列, 存在两种以上可能的结构这时结构预测模型本身就失去了意义, 因为序列和二级结构之间不再是一一映射关系 96

97 MC-fold/SYM-fold 97

98 序列二级结构三级结构 MC-fold SYM-fold: reconstruct the 3D structure based on a database of nucleotide cyclic motifs (NCM) 98

99 NCM Database 分为两大类 : 单链和双链单链是指不超过 6 个核苷酸的 loops, 而双链是指不超过 8 个核苷酸的碱基对单链 NCM 有 4 种类型, 共 5440 个 loops:64 3- loops, loops, loops, and loops 双链 NCM 有 15 种类型, 共个统计 RNA 结构数据库, 得到 NCM 的可能三级结构 99

100 MC-fold 输入输出二级结构的 dotbracket 表示方式二级结构的能量 100

101 MC-fold/SYM-fold 流程图 101

102 MC-fold/SYM-fold 成功例子 102

103 3dRNA 肖奕教授华中科技大学 103

104 3dRNA 流程定义 smallest secondary elements (SSE); 将 SSEs 拼装成 hairpins 和 duplexes; 进一步预测更复杂的 RNA 三级结构 104

105 SSE Database SSEs are defined as base pair, hairpin loop, internal loop, bulge loop, pseudoknot loop and junction, etc SSEs are similar even if their sequences are different and from different structural families 统计现有 RNA 结构数据, 构建 SSE database 105

106 从 SSEs 到 hairpin 根据二级结构信息划分 SSEs 106

107 到更复杂的 RNA 三级结构 107

108 在线工具 108

109 3dRNA 成功例子 109

110 Towards 3D 结构预测目前 RNA 三级结构预测的方法还不够成熟对于短 RNA 片段能够得出较好的结果, 对于较长的 RNA 三级结构仍相对困难目前测定的 RNA 三级结构少, 不能提供足够的实验信息预测算法中并没有考虑 RNA 所处的环境等因素, 现有的预测算法预测的自由能最低的二级结构不一定是天然态的二级结构可能的解决途径 : availability of high-resolution RNA structures derive fragment libraries that can be used as building blocks to construct a 3D model 110

未命名-1

未命名-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ss a c y e vg 13 14 15 16 17 18 19 H 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 发现生命的螺旋克里克在提出中心法则时曾指出遗传信息是沿ＤＮＡ - ＲＮＡ - 蛋白质的方向流动的遗传信息不可能从ＲＮＡ回到ＤＮ