中 国 畜 牧 兽 医 卷 随着现代养猪业的发展 不少养猪企业为了追求更高的经济效益 仔猪断奶日龄提前的现象越来越普遍 目前 许多猪场仔猪的断奶日龄已经由传统的断奶日龄 日龄 日龄 逐渐提前至 日龄 部分猪场甚至采取了早期断奶 日龄断奶 和超早期断奶 日龄断奶 虽然断奶日龄的提前有利于提高母猪的繁殖

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1 中国畜牧兽医! " # 不同断奶日龄对仔猪脾脏生长相关基因表达的影响 杨晶晶 李 源 李留安 金天明 焦小丽 天津农学院动物科学与动物医学学院 天津 南京农业大学 畜牧学博士后科研流动站 南京 % 摘 要 为研究不同断奶日龄对仔猪脾脏中生长激素受体 )84&&)()((4)<# 胰岛素样生长因子 **()84&4)< 和胰岛素样生长因子 受体 **()84&4))((4)<# 基因表达的影响 试验选取体重相近 健康的杜 长 大仔猪 头 随机分为 组 和 日龄断奶组 每个试验组 个重复 每个重复 头仔猪 至 日龄时全部宰杀取样 用 #!"# 方法检测脾脏中上述基因的相对表达水平 结果表明 和 日龄断奶组仔猪脾脏 <# # 的相对表达量显著高于 日龄断奶组 不同断奶日龄组仔猪脾脏中的 <# 的相对表达量均无显著性变化 日龄断奶组仔猪脾脏中 <# # 的相对表达量显著高于 日龄断奶组 结果提示 不同断奶日龄对仔猪脾脏相关生长基因表达影响的模式不同 不同断奶日龄脾脏 <# # 的表达可能受脾脏自身局部 < 的调控 关键词 断奶日龄 仔猪 脾脏 基因表达 生长激素受体 胰岛素样生长因子 胰岛素样生长因子 受体中图分类号 - 文献标识码 文章编号 '!'& '#"!/#8!-*!!'4 < ' '' * (*- *##!"# '-#!/!' (*!*#!*!!*--#!/!-% "#)()4474&(((4()(48(()(*4()84&((()( *((*(4*)378(&4&(*4&7*(48()((*(4()')( )&(**(48()()*75(4) 7(8( )(&)&)(*4**(4()4(*7&(78()(*& 4()(47(*((*(8()()(&()(*45(()()84&&) ()((4)<#**()84&4) <**()84&4))((4) <##*((8()(()(37#!"#&()(*4&8(4&44&()(*45(( )(<# #7(8()84*7&&()4& 4&47(8() &()(*45(()(< # *((4()(48(()84()((&()(*45(( )(<# #7(8()84*7&&()4&4&4 7(8() &()(*44(4&44&(4()8(( )(*4()84&((()(*(()(()(4&(()(*((<# #()(48(()8()(3*7((4(374&(*(((*)(*4 < %-!8((*(4*((((()(<#<<# 收稿日期 基金项目 天津市自然科学基金项目 "" 天津市高校 中青年骨干创新人才培养计划 资助项目 津教委人 号 天津市 创新型人才培养工程第二层次人选资助项目 天津市高校 兽医生物技术 市级创新团队资助项目 % 作者简介 杨晶晶 %% 女 河南卫辉人 硕士 研究方向 动物生长和应激调控 /*7 通信作者 李留安 副教授 硕士生导师 研究方向 畜禽营养生理生化 /***

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 随着现代养猪业的发展 不少养猪企业为了追求更高的经济效益 仔猪断奶日龄提前的现象越来越普遍 目前 许多猪场仔猪的断奶日龄已经由传统的断奶日龄 日龄 日龄 逐渐提前至 日龄 部分猪场甚至采取了早期断奶 日龄断奶 和超早期断奶 日龄断奶 虽然断奶日龄的提前有利于提高母猪的繁殖率 年产仔率 降低仔猪的生产成本等 但早期断奶仔猪由于消化道及免疫系统发育等均未成熟 同时又要经历环境 营养和心理等多方面应激源的刺激 常常出现采食量下降 生长滞后 攻击性增强 抵抗力下降 腹泻甚至死亡 等现象 目前国内外关于断奶应激对仔猪影响的研究很多 如不同断奶日龄对仔猪大脑皮质 海 马 下丘脑 杏仁核 肝脏等功能的影响 但目前关于断奶应激对仔猪脾脏生长的影响及不同断奶日龄对仔猪脾脏生长相关基因表达影响的研究鲜有报道 脾脏不仅是机体重要的免疫器官 还具有滤血 造血和储血等功能 其正常发育 成熟才能使动物发挥相应的生理功能 对维持仔猪健康具有重要的调节作用 因此 本试验以杜 长 大仔猪为试验动物 用相对定量反转录多聚酶链式反应 #!"# 方法检测不同断奶日龄对仔猪脾脏中生长激素受体 )84&&)()((4)<# 胰岛素 样生长因子 **()84&4)< 和胰岛素样生长因子 受体 **()84& 4))((4)<# 基因的表达情况 为揭示断奶日龄对仔猪脾脏生长乃至免疫功能的影响提供理论参考 材料与方法. 试验动物及分组从窝杜 长 大仔猪中随机选取出生日龄相近 体重相似的健康仔猪 头 公猪 头 母猪 头 作为本研究的试验动物 试验分为 个处理 依次为 日龄断奶组 日龄断奶组 日龄断奶组和 日龄断奶组 每个处理 个重复 每个重复 头仔猪 各处理仔猪都从预先确定的窝仔猪中随机选取. 试验日粮与饲养管理试验仔猪按常规程序进行管理和免疫 所有试验仔猪从日龄开始诱食 各处理组均按二阶段饲喂相同日粮 日龄期间采食日粮 % 日龄期间采食日粮 日粮组成及营养水平见表 试验期间仔猪自由采食 饮水 保温及光照等操作依据猪场制度进行 表 仔猪的日粮组成及营养水平 风干基础 #)!(!!#!'))73 原料 日粮 日粮 营养水平 日粮 日粮 )((4 (4 (4 4)(4*(5(* (4 (4 膨化大豆 /4)(73( % 消化能 ;/ % 玉米 ") 粗蛋白质 "! 乳清粉 &(78() 钙 " % % 鱼粉 &(* 总磷! % 大豆油 73(* = % 有效磷! % 小麦麸 &(43) 钠 磷酸氢钙 "! 赖氨酸 '7 % 石粉 '(4( 蛋氨酸 胱氨酸 ;(4"7 % 预混料!)( 苏氨酸 &) %% 合计 4* 预混料为每千克饲粮提供 铁 铜 锰 锌 钴 硒 碘 维生素 维生素 维生素 / 维生素 维生素 维生素 烟酸 计算值 &()()5(4&(*8()(4( " ;. " ( DDD/DDD "*4(5*(. 样品采集 至 日龄试验结束前 & 禁食 试验结束后宰杀仔猪 采集脾脏组织 置于 ' 离心管中 放 入液氮速冻后转到 = > 冰箱保存. 主要试剂 )* 试剂盒购自 3 公司 反转录酶

3 期 杨晶晶等 不同断奶日龄对仔猪脾脏生长相关基因表达的影响 ;;'D 购自!)( 公司 ' 聚合酶!# 酶抑制剂 随机引物均购自 *)3 公司./8)/ 方法检测 3/8 和 8/ (/" 表达 总 # 提取 脾脏中总 # 用 )* 试剂盒提取 用紫外分光光度计测定样品中 # 浓度 # 样品经琼脂糖凝胶电泳 / 染色后用凝胶成像系统分析 反转录 用随机引物对样品的 # 进行反转录 获得 ' 反转录体系先加入 总 #' 随机引物 *''! *' 加 补至 ' > 变性 立即置冰上冷却 再加 ' # 酶抑制剂 '';;'D 反转录酶 ' '#() 补充 /!" 水至 ' > % > #!"# 产物于 = > 保存备用!"# 引物 根据 <( 提供的相关 序列设计猪 <#< 和 <# 引物 引物序列见表 引物由上海捷瑞生物工程公司合成 表 引物序列 #( 基因 引物序列 <( 登录号 产物大小 3 <((!)()((( <((!)4*(4& ) "<<""<""<< % #"<<<<"<"<""< % <<<<<"<"" % #""<<<""""<.& <<<"<<"<<< ; #"<"""<<"<.&% """"<<<<< #"<<<""<<"!"# 扩增!"# 反应体系 '' 聚合酶!"# () 含 *' )"* *' "* *' *'/ <*7()* 稳定剂 '*'!*' 目的引物 *' 内标引物 补足体系!"# 扩增条件 % > 预变性 % > 变性 > 退火 > 延伸 > 延伸 在 个循环时 <! 和目的基因的!"# 产物均在线性扩增范围 用 和 # 样品分别取代 进行对照 以检验是否有外源和基因组 污染 电泳及灰度分析 取 %'!"# 产物在含 <*D(8 型核酸染色剂的琼脂糖凝胶上电 泳 通过凝胶成像分析系统分析各条带的灰度值 根据目的基因与 <! 条带的灰度比 确定目的基因 # 的相对表达量. 统计分析数据用! 软件进行统计分析 用单因子方差分析 (7D' 进行多重比较 结果用平均值 C 标准误表示 为差异显著性判断标准 结果与分析./" 样品质量结果样品 # 结果见图 由图 可知 灰度比约为 条带清晰 无拖尾现象和其他杂带 表明 # 样品质量可靠 图 猪脾脏总 /" 电泳图.!*!!'!#/"#'!(!'

4 *( 中!国!畜!牧!兽!医!F!! 不 同 断 奶 日 龄 仔 猪 脾 脏 中.! 基 因 GH4 表达的比较 由图 可 知! %) 和 % 日 龄 断 奶 组 仔 猪 脾 脏 D)7 基因 C5D= 的 相 对 表 达 量 无 显 著 差 异 " # &' &#!而 %) 和 % 日龄断奶 组仔猪 脾 脏 D)7 基 因 C5D= 的相对表达量显著高于 * 日龄断奶组" & )* 卷! &' &#'!F &! 不同断奶日 龄 仔 猪 脾 脏 中 ;.7V # 基 因 GH4 表达的比较 由图 * 可 知!不 同 断 奶 日 龄 组 仔 猪 脾 脏 中 的 FD8! % 基因 C5D= 的 相 对 表 达 量 均 无 显 著 性 变 化 " #&' &#' 5P!345 产物部分琼脂糖电泳图&右图!脾脏中 目 的 基 因 C5D= 的 相 对 表 达 水 平' ( Y! D= 分 子 质 量 标 ' 左图! 准& %)! %)( %( 和 * 日龄断奶组样品条带' 肩标不同字母表示差异显著 " &&' &#&肩标相同字母表示差异 不显著 " #&' &#'下同! 5< H S5P!345 I & 5! P8W< #-# H X- C5D= -< -'( Y! ' XI X8 XI X D= YH. & %! )! P8 #<8# <8# ## %)! %! H-"*"HU # HXV H -XX #I<! < S - 8 U'M HC #V! SH I V 8" I< C H- H" - " &&' &#&\8 V 8 8 HC < XI< C H--# H" - " #&' &#' P8 HCH Q #V < X图!! 不同断奶日龄仔猪脾脏中.! 基因 GH4 的相对表达量的比较 GH4 / 3 > E 5 5 M!!G 5 P./ 33.! F / 图 &! 不同断奶日龄仔猪脾脏中;.7V # 基因 GH4 的相对表达量的比较 M F &!G 5 P. 3 3 ;. 7V # GH4 / 3 > E 5 5 / /!F %! 不同断奶日龄仔猪脾脏中;.7 <# 基因 GH4 表达的比较 由图 ) 可知! * 日龄断奶组仔猪脾脏中FD8! %7 基因 C5D= 的相对表达量显著高于 日龄断奶组 " &&' &#!其余各日龄断 奶 组仔 猪脾 脏中 FD8! %7 基因 C5D= 的相对表达量无显著差异" #&' &#'

5 期 杨晶晶等 不同断奶日龄对仔猪脾脏生长相关基因表达的影响 图 不同断奶日龄仔猪脾脏中 %8 基因 (/" 的相对表达量的比较./#!!'%8 (/"!' '-## 讨 论生长激素 < 处于生长轴的中心 对动物的生长发育 生殖泌乳 免疫等有重要作用 < 和 < 在生长发育调节过程中有主导地位 必须与其相应受体结合才能产生生物学效应 研究显示 <# 和 < 在不同组织中表达量不同 在肝脏中的表达量最高 <# 在脾脏 胸腺等组织中的表 % 达量较低 ())4 等研究发现 在脾脏 胸腺及淋巴结中均有 基因 # 表达 刘莉等研究指出 复方中药制剂可以明显提高仔猪的 < 水平 以及提高仔猪脾脏 % 基因 # 的表达量 提示仔猪脾脏 % 基因 # 的表达可能受到外源刺激的影响 新生仔猪免疫功能低下 出生后主要从初乳中获得被动免疫能力 获得的被动免疫水平会先升高 后下降 同时 仔猪的自身免疫功能在不断增强 断奶应激作为一种生理性 心理性应激源会直接影响仔猪的生长发育 脾脏作为一种免疫调节器官 其生长发育及成熟状况对仔猪的免疫功能有重要影响 研究发现 断奶应激对仔猪细胞的基本功 能 免疫功能 脾脏细胞的抗氧化功能等方面均有影响 本试验对不同断奶日龄仔猪脾脏中 <# # 的相对表达量进行检测 结果显示 和 日龄断奶组仔猪脾脏 % 基因 # 的相对表达量显著高于 日龄断奶组 推测早期断奶应激能够刺激仔猪脾脏 % 基因 # 的表达.& 基因在各脏器中均广泛表达 但在肝脏 肌肉 脾脏 大肠 卵巢等重要组织中的表达量明显高 于其他组织 且大部分器官组织都能够分泌 < 脏器和组织可以通过自分泌或旁分泌方式 分泌 < 进而发挥生物学效应 石子刚研究结果表明 脾脏的发育可能主要受其局部产生的 < 的调节 本试验结果显示 不同断奶日龄组仔猪脾脏.& 基因 # 的相对表达量无显著差异 仔猪脾脏中 % 基因的表达变化并没有引起.& 基因 # 表达的变化 推测脾脏 < 的表达可能受脾脏自身局部 < 的调控 本研究结果提示 不同断奶日龄对仔猪脾脏生长相关基因表达影响的模式不同 不同断奶日龄脾脏.& 基因 # 的表达可能受脾脏自身局部 < 的调控 参考文献 '(54(;4(;"&(5*(7)("(4**4)()*7 8(*(4)(*4*8()( 4)4'#()(!.*.*!* 周世良 浅谈断奶日龄对母猪和仔猪生产性能的影响 中国猪业 % 张影超 王希彪 崔世泉 等 肠上皮紧密连接蛋白 # 的表达与仔猪断奶腹泻关系的研究 中国畜牧兽医 % 滕 勇 早期断奶仔猪营养研究进展 中国畜牧兽医 % 冷 静 朱仁俊 不同日龄断奶应激对仔猪血液生化和免疫指标的影响 安徽农业科学!*(4#4(3(*!() ;(4*/(4 ()*78(**44&(()( *)4 ()*)4)((4) 3(4&7)74()(&7)(( #

6 中 国 畜 牧 兽 医 卷 4&()4*)4(&*(4 % 4/!(&&()();(4**(( )(4**4(4*(4454( 3(&5)*)*()()(4)(&)( 4)()(*4(((()(4&(3) *%% ;4()#'7()"&(4((4*/(4 8(44)&((()() *4*(5(***()84&4) < < )*! *#* %% % ;4&(8' /3()))(4<#(*4 )4)84& &)()((4)((()( * %%%%%% ;()4 ";)(* <4 ((()( )84&&)(<)((4)<3) 4(*4*()44("* *# *%%% ())4")4()"*4&8745 4(374&()84&&)()((4)' *#*"! 刘 莉 郝福星 冒海银 四君子汤对仔猪胸腺及脾脏生长激素受体 # 表达的影响 动物医学进展 %%.&'''(4*4&7)(*4 37()*78(4&(*5()*(((*(4* *(*(4! 冷 静 朱仁俊 不同日龄断奶应激对仔猪血液生化和免疫指标的影响 安徽农业科学 李留安 王凤云 杨晶晶 等 断奶日龄对仔猪脾脏 胸腺和胰腺抗氧化功能的影响 动物营养学报 王 锐 赵 跃 张永云 等 猪胰岛素样生长因子 的克隆及生物信息学分析 西南农业学报 % 石子刚 生长轴激素在猪脾脏中表达及其发育性变化 南京 南京农业大学 责任编辑 晋大鹏

7 北京大学学报 医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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