74 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.30No.1Jan.,2016 来自上海市食品药品检验所积累样品, 部分为对照药材粉末 试剂 : 包括水合氯醛 ( 分析纯 ) 无水乙醇 ( 分析

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1 73 DOI: /j x 偏光显微镜在中药显微鉴定中的应用 汪滢 1, 郑希望 1, 田文帅 1, 崔亚君 1, 苗水 2 2, 季申 1. 上海中医药大学 ( 上海 ) 2. 上海市食品药品检验所 ( 上海 ) 方药研究 摘要 目的 : 系统研究偏光显微镜在中药鉴定中的应用 方法 : 利用正常光和偏光显微镜对比研究不同性质的植物细胞壁及细胞内含物 部分动物药和矿物药的偏光现象, 采用数码实时景深扩展成像技术拍摄, 比较目标显微组织在正常光下和偏光下的差异 结果 : 在正常光下目标显微组织与周围组织在颜色和亮度方面并无差异, 在偏光下部分目标显微组织呈现特异色彩而周围组织为黑暗, 部分目标显微组织与周围组织均为黑暗 结论 : 偏光显微镜可以快速检测出中药材粉末或中成药中具有偏光现象的显微组织特征, 如木质化导管 纤维 石细胞 腺毛 淀粉粒 草酸钙结晶 特定结构钟乳体 分泌组织 动物药 矿物药 关键词 偏光显微镜 ; 数码显微鉴定 ; 中药显微鉴定 中药显微鉴定是利用显微镜观察植 ( 动 ) 物药材内部的细胞 组织构造及细胞内含物, 明确其显微特征, 从而达到鉴别目的的一种鉴定方法, 是中药四大传统鉴定方法之一 [1], 具有简便 经济, 并适用于破碎 粉末中药的特点 1977 年版 中国药典 首次规定了药材显微鉴定 [2], 之后显微鉴定被广泛应用于药材和中成药的鉴定,2010 年版 中国药典 收载的显微鉴别更是达到 2140 项 [3] 然而随着显微鉴定被广泛列入中药材 中成药的鉴别项下, 显微鉴定又需要操作者具备丰富的理论知识和实践经验, 使得显微鉴定成为检验人员的负担 近年来, 偏振光显微镜 ( 即偏光显微镜 ) 利用其观察特定目标显微组织快速准确的特点而得到关注, 被越来越多地应用到中药显微鉴定中, 可明显提高显微鉴别的效率和准确率 Nikoneclipse80i 显微镜目镜下方有一个可拆卸偏振片, 取出偏振片时显微镜为正常光显微镜, 将偏振片插回目镜下方即为偏光显微镜 本研究选取了 50 余种具有代表性的中药材和对照药材粉末进行了系统研究, 在 Nikoneclipse80i 显微镜正常光和偏光状态下对比观察不同性质的植物细胞壁及细胞内含物 部分动 [ 基金项目 ] 国家重大新药创制专项研究项目 (2009ZX ) [ 作者简介 ] 汪滢, 女, 在读硕士生, 主要从事中药真实性与质量控制研究 [ 通讯作者 ] 崔亚君, 副教授, 硕士生导师 ; E mail:janney808@sina.com 季申, 主任药师, 硕士生导师 ;E mail:jishen2013@163.com 物药和矿物药的显微组织特征, 采用 Nikon DIGITALSIGHTDS Ri1 数码成像系统拍摄, 以期为偏光显微镜在中药显微鉴定中的应用提供依据 1 仪器与试药 1.1 仪器 Nikon eclipse80i 显微镜 Nikon DIGITALSIGHTDS Ri1 数码成像系统 偏振片, 均为日本株式会社尼康产品 1.2 药材与试剂药材 : 草 牛膝 红花 金礞石 罗勒子 南葶苈子 麻黄 荜澄茄 薄荷 珍珠 白薇 车前草 川木通 川牛膝 大血藤 颠茄草 粉萆 干姜 化橘红 马钱子 胖大海 枇杷叶 全蝎 桑叶 砂仁 商陆 石斛 天冬 天花粉 天麻 香橼 雄黄 益智 芫花 朱砂 葛根 粉葛, 为上海市食品药品检验所积累检品, 均经本研究通讯作者崔亚君鉴定 ; 铁皮石斛 ( 批号 : ) 蒙古黄芪 ( 批号 : ) 甘草 ( 批号 : ) 山药 ( 批号 : ) 川贝母 ( 批号 : ) 浙贝母 ( 批号 : ) 对照药材, 均购自中国食品药品检定研究院 ; 掌叶大黄 ( 批号 : ) 白术 ( 批号 : ) 穿心莲 ( 批号 : ) 山茱萸 ( 批号 : SZY ) 诃子 ( 批号 : ) 唐古特大黄 ( 批号 : ) 川木香 ( 批号 : ) 桔梗 ( 批号 : ) 木香 ( 批号 : ) 苍术 ( 批号 : ) 西洋参 ( 批号 : ) 对照药材, 均购自中国药品生物制品检定所 文中所用到药材粉末部分

2 74 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.30No.1Jan.,2016 来自上海市食品药品检验所积累样品, 部分为对照药材粉末 试剂 : 包括水合氯醛 ( 分析纯 ) 无水乙醇 ( 分析纯 ) 等 2 方法 2.1 不同性质植物细胞壁偏光现象的观察传统显微鉴定的研究中, 判断植物细胞壁性质是利用显微化学反应将目标组织染色进行 由于染色操作复杂, 一次染色只能观察一种类型细胞壁, 染色法基本只用于教学和科研, 不适用于日常检验 目前日常检验的方法是将药材粉末制成水合氯醛透化片, 在显微镜正常光下寻找目标组织, 再利用数码成像系统拍摄 新的偏光显微技术方法也是将药材粉末制成水合氯醛透化片, 不同之处是在显微镜偏光下观察, 再利用数码成像系统拍摄 水合氯醛透化片制片方法 : 取挖耳勺 1 勺药材粉末置于载玻片一端, 滴加 2~3 滴水合氯醛试液, 将载玻片载药材粉末一端置于酒精灯内焰处受热至微沸, 立刻移至室温处, 待沸腾现象消失继续受热, 反复微沸 3 次, 即透化完全, 冷却, 盖盖玻片, 制片完成 植物细胞壁的性质包括木质化 木栓化 角质化细胞壁及纤维素细胞壁 以下药材粉末制成水合氯醛透化片后分别在正常光和偏光下对不同性质植物细胞壁进行对比观察 木质化细胞壁分别选择黄芪 甘草 浙贝母 干姜 川木通 川牛膝 大血藤 天花粉 化橘红 白薇 桔梗的导管, 黄芪 甘草 干姜 川木通 川牛膝 白薇 苍术 枇杷叶的纤维, 黄芪 诃子 天冬 大血藤 川木通 马钱子 天花粉 白薇 苍术的石细胞, 唐古特大黄 掌叶大黄的非木质化导管, 诃子 车前草 薄荷的腺毛, 诃子 马钱子 车前草 芫花 穿心莲 化橘红 桑叶的非腺毛作为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后分别在显微镜的正常光和偏光下观察 木栓化或角质化细胞壁选择甘草 唐古特大黄 掌叶大黄 麻黄 川木通 川牛膝 大血藤 苍术 桔梗木栓细胞或角质层为观察对象, 按上述方法进行观察 纤维素细胞壁选择麻黄 干姜 川牛膝 天麻 化橘红 苍术 枇杷叶 桔梗的纤维素薄壁细胞壁为观察对象, 按上述方法进行观察 2.2 植物细胞内含物偏光现象的观察 淀粉粒观察淀粉粒的制片方法与其他组织不同, 是将药材粉末制成水装片进行观察 水装片制作方法 : 取挖耳勺 1 勺药材粉末置于载玻片一端, 滴加 2~3 滴蒸馏水, 盖盖玻片, 制片完成 选择浙贝母 川贝母 黄芪 唐古特大黄 掌叶大黄 干 姜 天花粉 白薇 粉萆 淀粉粒为观察对象, 将各药材粉末制成水装片后分别在显微镜的正常光和偏光下观察 草酸钙结晶选择 草 红花 唐古特大黄 掌叶大黄 白薇 枇杷叶 颠茄草 桑叶草酸钙簇晶, 山药 天冬 天麻 苍术 粉萆 商陆草酸钙针晶, 甘草 麻黄 川牛膝 大血藤 化橘红 白薇 枇杷叶草酸钙方晶, 牛膝 麻黄 山茱萸 川牛膝 颠茄草草酸钙砂晶为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后进行观察 钟乳体选择穿心莲 桑叶钟乳体为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后进行观察 分泌组织选择诃子 干姜 益智的油细胞和西洋参的树脂道作为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后进行观察 菊糖结晶选择桔梗 木香 苍术 白术菊糖结晶为观察对象, 取各药材粉末分别加 70% 乙醇浸泡 24h, 取浸泡后粉末制成水装片后进行观察 黏液细胞选择罗勒子 南葶苈子 胖大海 石斛 铁皮石斛黏液细胞为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后进行观察 硅质块选择石斛 铁皮石斛 益智 砂仁硅质块为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后分别在显微镜的正常光和偏光下观察 2.3 动物药偏光现象的观察动物毛发是由角蛋白组成, 不同动物的毛发角蛋白性质和排列方式不同, 因此在偏光下皮肤干涉色 髓腔指数和髓腔内部构造不同, 显示不同色彩和亮度, 利用此性质可对涉及毛发的动物类中药进行鉴别 动物骨 齿的磨片在偏光下有强烈的颜色和条纹对比 [4], 可利用偏光显微镜对动物骨 齿进行鉴别 选择正品一等海珠和全蝎刚毛为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后分别在显微镜的正常光和偏光下观察 2.4 矿物药偏光现象的观察自然界的绝大部分矿物是由结晶质组成 [5], 有明显偏光现象, 不同晶形的矿物在偏光下有不同形状和色彩, 因此可利用偏光显微镜对矿物药进行鉴别 选择金礞石 朱砂 雄黄为观察对象, 将各药材粉末制成水合氯醛透化片后分别在显微镜的正常光和偏光下观察 3 结果与讨论 偏光显微镜用于检测具有双折性的物质, 它与正常光显微镜不同之处在于其光源前有偏振片 ( 起偏振器 ), 使进入显微镜的光线为偏振光, 镜筒中装有另一偏振片 ( 检偏振器, 一个偏振方向与起偏振

3 75 器垂直的起偏振器 ); 偏光显微镜的载物台可以旋转, 当载物台上放入单折射的物质时, 无论如何旋转载物台, 由于两个偏振光是垂直的, 显微镜里看不到光线, 而放入双折射性物质时, 由于光线通过这类物质时发生偏转, 因此旋转载物台便能检测到这种物体 [1] ; 显微观察时有偏光现象的显微特征在暗视野下犹如黑夜里的星星, 可以被快速准确观察到, 因此可以提高显微鉴别的效率和准确率 本研究系统对比观察研究了 50 余种植物药不同性质的细胞壁及细胞内含物 动物药和矿物药在正常光和偏光显微镜下的偏光现象, 结果见表 1 和图 1 结果提示, 木质化细胞壁如木质化的导管 纤维 石细胞具有强烈偏光现象, 偏光镜下具有特殊的彩色光泽, 亮度与木化程度成正比 ; 木栓化或角质化细胞壁及纤维素细胞壁, 在暗视野中无偏光现象, 但在起偏振器和检偏振器非正交状态下有微弱偏光现象 细小淀粉粒在普通显微镜下与细小的油滴或糊粉粒等不易区别, 特别是在大处方中成药显微鉴定时即使用碘试液染色后观察也易受其他有色显微组织碎片的干扰, 而在偏光显微镜下淀粉粒清晰可见, 脐点处呈十字交叉形, 染色后偏光现象依然存在, 但加热糊化后偏光现象消失, 检查淀 表 1 不同植物组织及细胞内含物与对照药粉末偏光现象 粉粒时可利用该性质在暗视野下排除其他不具有偏光现象易混物质的干扰, 在大处方中成药的显微鉴定时, 利用淀粉粒偏光现象不需染色即可快速发现细小的或散在植物组织中的少量淀粉粒 草酸钙结晶在偏光下均具有明显的偏光现象 碳酸钙结晶因晶体排列不同出现不同的偏光现象, 晶型排列整齐的碳酸钙结晶无偏光现象或仅有微弱偏光现象, 晶型排列没有次序的碳酸钙结晶则会呈现出不同鲜艳色彩 [6], 如图 1 中穿心莲 1 钟乳体有明显偏光现象, 而穿心莲 2 钟乳体则偏光现象不明显, 只有微弱的偏光现象 分泌组织 ( 脂肪油 挥发油 树脂 ) 菊糖结晶 黏液细胞 硅质块无偏光现象或仅有弱偏光现象 动物毛发 齿骨具有明显的偏光现象 矿物药因其大多为结晶矿物, 具有明显偏光现 [7] 象, 温海成利用偏光显微镜对硅化合物类 钙化合物类 铁 砷化合物类 钠盐类 汞化合物类等 34 种常用矿物药进行了显微鉴定 本研究中朱砂极细粉在正常光下显鲜红色或暗红色, 在中成药制剂中极易与其中的成分混淆, 但偏光下呈鲜红色并带光泽, 易于检出 雄黄粉末在正常光显微镜下呈橙黄色, 无光泽, 在中成药制剂中易与树脂道或其他黄色物质混淆, 偏光下断面显彩色光泽, 易于检出 分类目标显微组织名称观察药材偏光现象 木质化导管 黄芪, 甘草, 浙贝母, 干姜, 川木通, 川牛膝, 大血藤, 天花粉, 化橘红, 白薇, 桔梗 有 木质化纤维 黄芪, 甘草, 干姜, 川木通, 川牛膝, 白薇, 苍术, 枇杷叶 有 木质化石细胞 黄芪, 诃子, 天冬, 大血藤, 川木通, 马钱子, 天花粉, 白薇, 苍术 有 植物细胞壁 非木质化导管 唐古特大黄, 掌叶大黄 无 腺毛 诃子, 车前草, 薄荷 有 非腺毛 诃子, 马钱子, 车前草, 芫花, 穿心莲, 化橘红, 桑叶 无 木栓化或角质化 甘草, 唐古特大黄, 掌叶大黄, 麻黄, 川木通, 川牛膝, 大血藤, 苍术, 桔梗 弱 纤维素化 麻黄, 干姜, 川牛膝, 天麻, 化橘红, 苍术, 枇杷叶, 桔梗 弱 淀粉粒 浙贝母, 川贝母, 黄芪, 唐古特大黄, 掌叶大黄, 干姜, 天花粉, 白薇, 粉萆 有 草酸钙簇晶 草, 红花, 唐古特大黄, 掌叶大黄, 白薇, 枇杷叶, 颠茄草, 桑叶 有 草酸钙针晶 山药, 天冬, 天麻, 苍术, 粉萆, 商陆 有 草酸钙方晶 甘草, 麻黄, 川牛膝, 大血藤, 化橘红, 白薇, 枇杷叶, 葛根, 粉葛 有 草酸钙砂晶 牛膝, 麻黄, 山茱萸, 川牛膝, 颠茄草 有 细胞内含物 钟乳体 穿心莲, 桑叶 与结晶结构有关 分泌组织 诃子, 西洋参, 干姜, 益智 有 菊糖结晶 桔梗, 木香, 川木香, 苍术, 白术 无 橙皮苷结晶 薄荷, 香橼, 荜澄茄 弱 黏液细胞 罗勒子, 南葶苈子, 胖大海, 石斛, 铁皮石斛 弱 硅质块 石斛, 铁皮石斛, 益智, 砂仁 弱 动物药 动物药 珍珠, 全蝎刚毛 有 矿物药 矿物药 金礞石, 朱砂, 雄黄 有

4 76 ACTAUNI VERSI TATI STRADI TI ONI SMEDI CALI SSI NENSI SPHARMACOLOGI AEQUESHANGHAIVol 30No 1J a n 2016 正常光 偏光 正常光 甘草 缘纹 甘草 晶鞘纤 孔导管 维和方晶 偏光 浙贝母 诃子 石细胞 淀粉粒 草 草酸 大黄 钙簇晶 草酸钙簇晶 山药 牛膝 草酸钙针晶 草酸钙砂晶 葛根 诃子 非腺毛 草酸钙方晶 罗勒子 一等海珠 黏液细胞 朱砂 雄黄 穿心莲 1 穿心莲 2 钟乳体 钟乳体 图 1 不同植物组织及细胞内含物与对照药粉末正常光与偏光对比 随着生活水平的提高 中药不仅在治病方面发 挥了独特的功效 而且在药膳食疗中得到了广泛应 用 8 但中药成分复杂 9 来源广泛 如何鉴别真 伪至关重要 偏光显微镜仪器价格低廉 10 在中药

5 材和中成药检测中可快速找到有偏光的显微组织, 特别是将偏光显微技术引入大处方中成药的显微鉴定中能快速排除无偏光现象干扰物, 准确找到有偏光现象的目标物 今后, 如能扩大偏光显微镜在中药材 中成药显微鉴别中应用的普及率, 将给检验工作带来极大的便利 参考文献 : [1] 李萍, 钱忠直. 中华人民共和国药典中药材显微鉴别彩色图鉴 [M]. 北京 : 人民卫生出版社 :2009:13. [2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 ( 一部 )[S]. 北京 : 中国医药科技出版社,1977. [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 ( 一部 )[S]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010. [4] 李永岚, 王维民. 毛发中角蛋白偏光显微镜观察及其在法医学上的意义 [J]. 贵州医药,1983(3):7 10. [5] 李家实. 中药鉴定学 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社, :640. [6] 胡浩彬, 雷霁远. 偏光显微镜在中药鉴定中的应用 [J]. 南京中医药大学学报,2007,23(4): [7] 温海成.34 种矿物药的鉴定研究 [D]. 辽宁 : 辽宁中医药大学,2008. [8] 王利思, 徐红, 王铮涛. 扩增阻滞突变系统研究进展及其在中药鉴定中的应用 [J]. 上海中医药大学学报,2010,24(3): [9] 魏珊珊, 杨敏, 崔亚君. 甘草药材 HPLC 指纹图谱研究 [J]. 上海中医药大学学报,2014,28(2): [10]LiangZT, JiangZH, LeungKSY, etal. Distinguishingthe medicinalherboldenlandiadifusaformsimilarspeciesofthesame genususingfluorescenemicroscopy[j].microscrestech,2006, 69(4): 编辑 : 沈蕾收稿日期 : ApplicationofPolarizingMicroscopeintheMicroscopical IdentificationofTCM WANGYing 1,ZHENGXi wang 1,TIANWen shuai 1, CUIYa jun 1,MIAOShui 2,JIShen 2 ABSTRACT 1.ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai, ShanghaiInstituteforFoodandFrugControl,Shanghai, Objective: TostudytheapplicationofpolarizingmicroscopeintheidentificationofTCM systematicaly. Methods:Wetrytostudythediferentpolarizationphenomenaofdiferentplanttisue,celinclusion,animalmedicine, mineralmedicineinnormallightandpolarizedlight,meanwhilewetrytotakepicturesandfindthediferencesoftargettisue undernormallightandpolarizedlightbyusingthedigitalreal timedepthoffieldexpansiontechniqueto.results:under normallight,microstructureofthetargetandthesuroundingtisuedidnotdiferincolorandbrightnes,howeverunder polarizedlight,sometargettisuepresentedspecialcolor,butitssuroundingtisuewasdark,whereassomeothertargettisue anditssuroundingtisuewerebothdark.conclusion:polarizingmicroscopewasabletoidentifythetisuethatpresents polarizationphenomenainchinesemedicinepowderorchinesepatentmedicinequicklysuchaswoodycatheters,fibers,stone cels,glandularhairs,starchgrains,calciumoxalatecrystals,aparticularstructureclock,milkbody,secretorytisue,animal medicineandmineraldrugs. KEYWORDS polarizingmicroscope;digitalmicroscopicidentification;microscopicidentificationoftcm

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Ñ Ö Ö Ö Ö Ö Ñ Ö Ö Ö Ö Ö Ö Ñ Ö Ö Ù Ñ Ö Ö Ñ Ö Ö Ö Ö Ö Ö 中国药典 年版药用辅料标准起草工作交流会 月 日于西宁召开 国家药典委员会于 年 月 日组织承担药用辅料标准起草任务的 个药品检验所在青海省西宁市召开辅料 标准起草工作交流会 国家局药品注册司派员参加了会议 青海省食品药品监督管理局魏富财副局长到会致欢迎词 中国药 品生物制品检定所和上海市食品药品检验所就药用辅料标准起草工作进行了大会经验交流

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