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罕瑞
5 years ago
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1 甲型流感病毒抗原快速快速检测试剂盒 ( 免疫渗滤法 ) 介绍 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co.,LTD. 1

2 流感病毒病原学属正粘病毒科是有包膜的单链负义 RNA 病毒, 电镜下 80~120nm 120nm, 呈球形椭圆形或丝状, 根据核蛋白 (NP NP) 的差异, 区分为 A B C 三种 2

3 流感爆发历史 1917 年年欧洲爆发西班牙流感 ( 病毒类型 H1N1) 疫症, 导致 2,000 万人死亡 ( 第一次世界大战的死亡人数只是 850 万人 ), 是历史上最严重的流感疫症 1957 年年 1957 年 2 月在中国贵州爆发 ( 病毒可能是在 1956 年从苏联传来 ), 其後散播至世界各地全球受影响的人数占总人口的 10% 至 30%, 但死亡率较 1919 年的疫症为低, 约为总人口的 0.25% 年年流感从香港开始, 全球的死亡人数达 70 万人, 其中美国就占 3 万多人 1976 年新泽西一名青年染上猪流感, 引致恐慌会爆发新疫症, 于是大规模推行疫苗注射 1986 年年世界不同地区发生数宗人类染上猪流感的病案 1997 年香港发生禽流感, 原本只影响鸡只的病毒亦令人类患病香港政府下令层宰 150 万只鸡受影响的人数为 18 人, 其中 6 人死亡

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5 流感病毒快速检测的意义开展初筛实验, 降低核酸确证的实验量, 提高防治效率 ; 及时筛查, 及时用药 ( 达菲 ), 降低重症率, 及死亡率 ; 监控感染人群, 防止继续传播而导致的大规模爆发 5

6 快速检测试剂必备条件高灵敏度确保绝大多数的阳性病例可以被检测出, 避免假阴带来的患者流出高特异性确保不造成大量假阳性, 造成不必要的抗病毒药物滥用以及恐慌操作便捷性不需要专业的实验设备以及实验人员, 可以现场操作快速性如何才能放心使用甲流快速试剂? 结果可以迅速给出, 有利于后续行动的开展 6

7 现有的流感实验室检测方法检测方法优点缺点时间快速结果病毒分离金标准 ; 病毒分型 ; 耐药性检测周期长 (3-7d), 对人员和实验条件要求高 3-10 天否血清学检测检测中和抗体滴度鉴定 HA 亚型无法诊断病毒感染感染后 2-4 周否免疫荧光灵敏度较高专业人员以及实验设备 2-4 小时否核酸检测灵敏度高, 可以区分亚型成本高对技术和设备要求高不易推广普及 2-4 小时否快速抗原检测现场检测, 反馈快速检测 NP 蛋白, 无法分型分钟是 7

8 免疫层析法原理样品加入后, 会溶解胶体金, 若样本中有流感抗原, 则抗原与胶体金标记抗体结合形成 Ag-Ab- 金复合物, 液体继续涌动, 在检测线处与包被的抗体结合, 形成 Ab-Ag-Ab- 金结构, 固定在膜上形成可见条带 8

9 免疫渗滤法原理渗滤法平台 : 基于酶联免疫反应原理, 利用微孔滤膜作为固相载体建立的一种快速诊断技术平台, 所有加入的液体由于吸收垫而自上向下流过 9

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11 使用 65 例甲型流感样本 ( 包括 H3N2 H1N1 等亚型 ) 对三种胶体金试剂进行评估, 结果显示胶体金试剂对甲型流感病毒的敏感性较低, 美国 CDC 评价其临床诊断价值有限 11

12 FLUA Ag 快速检测试剂快速检测试剂 ( 免疫渗滤法 ) 12

13 万泰 FLUA Ag 快速检测试剂 ( 免疫渗滤法 ) 以双抗体夹心法 : 包被原料以及酶标原料均采用特异性针对甲型流感病毒核蛋白 (FluA NP) 的单克隆抗体酶标抗体包被抗体单抗筛选及配对 : 13

14 万泰 FLUA Ag 快速检测试剂 ( 免疫渗滤法 ) 优化设计的病毒裂解系统 : 1 病毒裂解, 丧失感染能力 2HA 解离, 增加有效检测浓度 3 病毒裂解, 释放 NP 14

15 万泰 FLUA Ag 快速检测试剂 ( 免疫渗滤法 ) 万泰 FLU A Ag 快速检测试剂可以检测出包括 H7N9,H1N1,H2N2,H3N2,H5N1, 等各种甲流, 可作为初筛试剂检测为阳性再用核酸检测亚型同时对初筛阳性患者采取防止措施! 降低重症率及死亡率 15

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17 科技部筛选出的三家厂商试剂性能对比以上病毒样本都是实验室培养的甲型流感病毒样本从试剂比较结果来看, 北京万泰试剂灵敏度最高, 北京阿斯克莱生产的试剂可检测出以上样品, 万孚试剂灵敏度偏弱 17

18 快速试剂对比病毒亚型说明病毒滴度万泰 FluA Dot FDA 批准 BD SDA 批准 1 SDA 批准 2 1HA CA/04 H1N1 新 H1N1 甲流 0.1HA HA / HA +/ HA ST/520 H1N3 季节性流感 0.1HA HA / HA +/ 检测培养病毒的检测能力显示万泰产品具有最高检测灵敏度 18

19 快速试剂对比万泰 FluA Dot ELISA 与 Quidel 对比 19 甲型流感病毒 TCID (log 10)/ml Quidel Quick Vue A+B 检测下限 (log 10 TCID 50 ) Flu A Dot ELISA 相对灵敏度 b Dk/Vietnam/283/ Dk/Vietnam/NXX/ Ck/Malang/BBVET 4/ Indonesia/5/ Bar-headed Gs/Qinghai// MDk/Jiangxi/2295/ DK/Shantou/4231/ Little Egret/Hong Kong/718/ Japanese White Eye/HK/1038/ Ck/Guangxi/2439/ Gs/Yunnan/5539/ Ck/Hong Kong/YU22/ 平均检测下限

20 快速试剂对比万泰 FluA Dot ELISA 与 Quidel 对比选取 15 株代表性 H5 流感活病毒培养液, 经 10 倍系列稀释后平行比较检测, 结果表明万泰 FluA Dot 试剂剂盒对 15 株病毒的分析灵敏度较 Quidel 公司 Flu A 试剂高出约 1-2 个数量级 ( 见下图 ) 20

21 快速试剂对比万泰 FluA Dot ELISA 与 BD 对比随机选取 3 株 Flu A 病毒尿囊液系列稀释后进行平行比较, 结果表明, 北京万泰甲流试剂盒分析灵敏度高出 BD Directigen EZ 试剂盒 5~125 倍 ( 下表 ) 21

22 厦门检验检疫局的检测厦门检验检疫局比较万泰公司和美国 BinaxNOW 公司杭州创新试剂盒 3 家试剂 22 万泰试剂对普通季节性流感和甲型 H1N1 流感的检出率远远高于另外两家试剂.

23 性能评价 I. 对病毒标本的检测情况 II. III. 临床考核数据单位试用结果 23

24 I. 病毒标本检测对培养病毒的检测情况 : (NIDVD 和香港大学联合检测 ) 对 112 株不同种类的甲型流感病毒培养液的分析灵敏度 0.01 HA( 见左图 );HA 为血凝素单位 24 Flu A-Ag 渗滤法试剂可检测甲型流感的各个亚型

25 交叉病原体检验百日咳杆菌白色念珠菌白喉杆菌流感嗜血杆菌阴性阴性阴性阴性检验 30 株乙型流感病毒无非特异性反应嗜肺军团菌阴性结核分枝杆菌阴性 25 肺炎支原体奈瑟菌肺炎链球菌 EV 病毒腺病毒冠状病毒呼吸道合胞病毒麻疹病毒副流感病毒阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性 Flu A-Ag Dot- ELISA 试剂盒与常见呼吸道疾病病原体无交叉反应

26 II. 临床考核方案为了在有效指导对于快速筛查试剂的使用, 对于快速筛查试剂进行系统的评价收集发热门诊 ( 体温 >38 ) 流感样症状患者标本, 进行考核现场采用 2 种快速筛查方法进行检测 1. 北京万泰生物药业股份有限公司生产的甲型流感病毒抗原 (Flu A-Ag) 诊断试剂盒 ( 免疫渗滤法 ) 2. 杭州创新的甲型流感快速检测试剂盒 ( 有文号 ) 作为参比试剂对于所有样本进行核酸检测 26

27 西京医院总共采集了 807 份样本, 同时采用北京万泰的试剂和参比试剂试剂进行检测, 结果如下 : 鼻咽拭子样本参比试剂阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 ) 北京万泰阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 ) 可见不同检测原理的快速筛查方法具有较大的差异 27

28 西京医院对于所有样本进行核酸检测后统计 2 种快速筛查方法的灵敏度和特异性, 结果如下 : 北京万泰 RT-PCR 鼻咽拭子样本合计 ( 份 ) 阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 ) 北京万泰灵敏度 :91.38% 特异性 :99.65% 参比试剂 RT-PCR 鼻咽拭子样本合计 ( 份 ) 阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 ) 参比试剂灵敏度 :44.40% 特异性 :97.57% 28

29 北京 CDC 总共选择了 100 份咽拭子标本进行同步检测结果如下 : 咽拭子样本参比试剂阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 ) 北京万泰阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 )

30 北京 CDC 北京万泰咽拭子样本 RT-PCR 合计 ( 份 ) 阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 阳性 ( 份 ) 灵敏度 =84% 阴性 ( 份 ) 特异性 =100% 合计 ( 份 ) 咽拭子样本 RT-PCR 阳性 ( 份 ) 阴性 ( 份 ) 合计 ( 份 ) 参比试剂阳性 ( 份 ) 灵敏度 =12% 阴性 ( 份 ) 特异性 =100% 合计 ( 份 )

31 Ⅲ. 单位试用结果不同快速检测试剂具有较大差异, 免疫渗滤法具有更好的灵敏度 ; 北京万泰的甲流快速试剂对于甲型流感病毒的检测灵敏度超过 91.38% 以上, 鼻咽拭子比咽拭子灵敏度高北京万泰的甲流快速试剂特异性超过 99% 以上 31

32 操作注意事项该试剂为抗原检测试剂, 不用来检查抗体 ; 并且检测样本不可为血清标本最好为新鲜标本, 如果保存标本, 应当为 -80 冻存, 未反复冻融,-20 度保存的标本可能会出现漏检尽量建议采集鼻咽拭子, 有利于灵敏度的提高, 并且有利于医护人员的保护操作中的反应时间应当略微控制 32

33 鼻咽拭子 / 咽拭子检测差别大 - 因素分析鼻咽拭子采集示意图病毒感染宿主细胞的受体分布情况决定病毒的存在及富集部位受体分布情况决定病毒的存在及富集部位流感病毒侵入呼吸道黏膜柱状上皮细胞, 与细胞膜上的唾液酸受体结合, 并在细胞内增值引起细胞变性坏死脱落黏膜充血水肿等因此, 鼻咽部的柱状上皮细胞内含的病毒滴度相对较高, 采集该部位的样本利于病毒的检出 33

因素分析标本类型 : 鼻咽拭子咽拭子鼻咽抽提物等病毒含量比较 1 Gavin P, et al. Clin. Appl. Immunol. Rev. 2003.

34 因素分析标本类型 : 鼻咽拭子咽拭子鼻咽抽提物等病毒含量比较 1 Gavin P, et al. Clin. Appl. Immunol. Rev Covalciuc K, et al. J Clin. Microbiol Schultze D, et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 鼻咽抽提物鼻咽拭子咽拭子

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材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人