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堕邵
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1 畜牧兽医学报家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养陈秀荔赵永贞靳亚平张彦明西北农林科技大学农业部家畜生殖内分泌与胚胎工程重点开放实验室杨凌摘要本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞腺上皮细胞和基质细胞和平滑肌细胞并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞分别在添加胎牛血清牛胰岛素雌二醇!" 孕酮 #" 的 $%!%& 培养液和 ' 的饱和湿度条件下培养用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞且种细胞纯度都达左右基质细胞出现蜕膜化子宫平滑肌细胞的纯度为左右而且出现横纹状的生长本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养在含牛胰岛素! "#" 的 $%!%& 培养液和 ' 饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长关键词子宫内膜细胞平滑肌细胞免疫组织化学免疫荧光蜕膜化中图分类号文献标识码文章编号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收稿日期 (( 基金项目国家自然科学基金资助项目 "" 作者简介陈秀荔 ( 女内蒙古赤峰市人博士生主要从事家畜生殖内分泌与生殖免疫研究!()*+,-.*/*+ 通讯作者张彦明 ( 男陕西南郑人博士生导师主要从事分子病原学与免疫学研究!()*0,)1)*/)-/+

2 期陈秀荔等家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养 " 9,/+-+- )*+!--9:*) +-9, /+-+-*/,*9+,-*9:1*//: */)*0)9* 子宫内膜作为性激素作用的靶器官在生殖生理研究中占有重要的地位对子宫内膜细胞进行体外培养为研究细胞的生长分化和代谢以及性激素作用的机理提供了理想的实验模型着床期子宫内膜在胚泡黏附后发生蜕膜化反应子宫内膜基质细胞逐渐转化为蜕膜基质细胞影响滋养层细胞的侵入一方面蜕膜组织中细胞外基质处于不断更新代谢的动态平衡中另一方面蜕膜组织能够产生多种细胞因子生长因子以及金属蛋白酶调节滋养层细胞的多种基因表达因此体外研究基质细胞的蜕膜 " 化现象对进一步研究胚胎植入机理十分必要子宫平滑肌细胞的体外培养为研究子宫内以及其他组织器官的血管的形成以及体外构建血管模型提供了依据目前对子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离方法主要有两种一种是滤网法另一种是离心法本实验室曾应用滤网法分离子宫内膜细胞但其操作繁琐因此本研究对子宫内膜细胞的体外培养加以改进采用离心法获得细胞后再经过差速贴壁法获得纯化的子宫内膜细胞探讨更为简单有效的纯化方法为进一步的体外研究激素及生长因子对子宫内膜细胞和平滑肌细胞增殖的影响提供依据同时为体外模拟正常子宫模型的建立奠定基础材料与方法, 试验动物试验用母兔来自军事医学科学院实验动物中心临床检查健康性成熟, 主要试剂孕马血清促性腺激素 #%8 北京奶牛中心人绒毛膜促性腺激素,8 北京奶牛中心 $%!% 培养基 8*;*+ 公司胎牛血清百灵克公司孕酮 # " *) 雌二醇! *) 牛胰岛素 *):,!8#:-) 鼠抗人的角蛋白 19-:9* 北京中杉公司多克隆抗体波形蛋白 <*-9* 北京中杉多克隆抗体平滑肌肌动蛋白 ()+9* 北京中杉多克隆抗体 -+,9*) 公司分析纯 # 免疫组化试剂盒及 $ 显色液以及相应的罗丹明荧光二抗北京中杉公司, 方法子宫内膜细胞的分离雌性大耳白兔性成熟体质量为肌肉注射 6= 的 #%8 超排处理 ", 后耳缘静脉注射 6= 的,8 于第天空气栓塞处死超排处理兔无菌条件下取出子宫用含双抗的 # 冲洗子宫至白色纵向剪开子宫刮取子宫内膜用的胰蛋白酶室温消化 * 用吸管反复吹打几次将其收集到盛有培养液含血清的离心管中吹打均匀采取以下的几种方法进行分离纯化一种是滤网法用目不锈钢网筛过滤收集滤液 :* 离心 * 得基质细胞用完全培养基冲洗滤网上的细胞得到的液体进行离心 :* 离心 * 得上皮细胞另一种分离纯化的方法是差速离心法将消化获得的子宫内膜细胞 :* 离心 * 弃去上清然后再加入完全培养液将其重悬再经过 :* 离心 * 取其上的悬液接种于培养瓶中得基质细胞取下悬液接种于培养瓶中得上皮细胞因为这样获得的细胞不是很纯笔者尝试用反复差速贴壁法对种细胞进行纯化从而获得纯度较高的子宫内膜细胞方法如下将接种的种细胞放置于 ' 的孵箱内培养, 后吸取培养液于离心管中离心下层贴壁的为基质细胞因其属于成纤维样细胞所以易于贴壁再重复以上操作次每次计数未贴壁的细胞数量再离心收集未贴壁的细胞重新接种到瓶中进行培养得到上皮细胞子宫平滑肌细胞的分离在以往报道的基础上加以改进将刮去子宫内膜的子宫用 # 冲洗几次每次冲洗的液体收集到离心管中内含基质细胞和上皮细胞用差速离心法和差速贴壁法分离纯化种细胞将冲洗过的子宫用眼科剪修剪边缘再将剩余部分剪成的小块加入适量的胰蛋白酶室温消化 * 用目不锈钢网筛过滤将滤液收集至离心管中再向离心管中加入等量含血清的完全培养基终止消化滤网上面的组织刮下来继续用胰蛋白酶消化直至消化完全为止 :* 离心 * 收集细胞子宫内膜细胞和平滑肌细胞的体外培养

3 "" 畜牧兽医学报卷将分离纯化的子宫内膜细胞和平滑肌细胞吹打均匀后以 > 接种到的培养瓶中设立对照组一种培养液为含有! " # " 牛胰岛素的 $%!% 另一种为含有 # " "! 牛胰岛素的 $%!% 将其培养瓶置于 ' 的培养箱内培养后更换相应的培养液每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况 " 细胞爬片用胰蛋白酶和!$ 消化长成单层的子宫内膜细胞然后用含血清的培养基终止消化 :* 离心 * 重悬细胞并计数以 " 接种到 " 孔培养板内置盖玻片上静置 * 添加足量的培养液置于 ' 饱和湿度的培养箱中培养约, 后细胞已经铺满瓶底左右细胞密度适中细胞间存在一定的空隙适宜做免疫组化和免疫荧光试验细胞免疫组织化学染色用 # 洗细胞爬片次再用 " 的多聚甲醛室温固定 * 以链膜上皮细胞较基质细胞难贴壁培养 ", 后发现贴壁伸展成小圆形基质细胞培养, 观察发现其长成小星星形的细胞两种细胞在 ", 基本长成单层细胞纯度达上皮细胞呈铺路石状基质细胞多呈多角形而在添加牛胰岛素 # " "! 的 $%!%& 培养液中培养的上皮细胞和基质细胞较前一种培养液中生长的细胞状况差平滑肌细胞贴壁较快, 后将观察到伸展的长梭形细胞 ", 后可见到形成横纹状的细胞单层有时可见峰谷样的结构如图所示霉素生物素蛋白 ( 过氧化物酶 9:-79)**(7-:.( *-# 进行免疫组织化学染色鉴定种细胞的抗体鉴定上皮细胞的抗体为小鼠抗人的细胞角蛋白 19-:9*& 稀释鉴定基质细胞的抗体为小鼠抗人的波形蛋白 <*-9*& 稀释鉴定平滑肌细胞的抗体为小鼠抗人的 ( 肌动蛋白 ()+9* 以 # 为阴性对照 "' 过夜加生物素标记的 # 试剂盒二抗工作液进行染色最后 $ 显色再用苏木素复染凡细胞质染成棕黄色的为阳性未呈棕黄色的为阴性每张爬片取个不同的视野计数阳性细胞统计阳性细胞率细胞免疫荧光染色将 " 孔培养板中长成单层的细胞用 " 的多聚甲醛室温固定 * 进行免疫荧光染色用中叙述的种细胞的抗图培养 -.! 的单层子宫内膜上皮细胞倒置相差显微镜 / 01-"#$#!$$$ +!$&!* &!# %!*/ 体染色 # 代替一抗作阴性对照用罗丹明以 & 稀释北京中杉公司标记细胞的胞质 ( -+,9 以 & 稀释标记胞核细胞质呈红色的为阳性结果细胞质不着色的是阴性结果统计细胞质和细胞核的数量计算细胞的纯度结果与分析, 子宫内膜细胞的生长情况在添加牛胰岛素! "# " 的 $%!%& 培养液和的饱和湿度条件下培养子宫内图培养! 的单层子宫内膜基质细胞倒置相差显微镜 / 01-"#$#!$$!*&! # %!*/, 细胞爬片的免疫组化染色分别对种细胞进行免疫组化染色上皮细胞阳性胞质呈棕褐色图 " 阳性率达基质细胞 <*-9* 阳性胞质呈棕褐色而且还见到膨大的蜕膜化的基质细胞图阳性率达平滑肌细胞 ()+9* 阳性胞质呈棕褐色出现横纹

4 期陈秀荔等家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养 " 细胞的纯度为如图所示图培养! 的单层子宫平滑肌细胞倒置相差显微镜 / 01-"#$#!#$$!*&! # %!*/ 图平滑肌细胞阳性胞质呈棕褐色胞核呈蓝色 / 01- #$$ %*$ 1+ #$1$#/ 图上皮细胞 ") 阳性胞质呈棕褐色胞核呈蓝色 / 01-!$$")%*$ 1+ #$1$#/ 图. 基质细胞阳性胞质呈棕黄色胞核呈蓝色 / 01-.$$ %*$ 1+ #$1$#/ 状的生长方式图细胞阳性率达, 细胞爬片的免疫荧光分别对种细胞进行免疫荧光染色罗丹明染胞质呈红色 -+,9 染胞核呈蓝色通过统计胞质和胞核的数量计算细胞的纯度发现上皮细胞的纯度为基质细胞的纯度为平滑肌讨论子宫内膜细胞的分离与培养方法各异子宫内膜在体内受雌激素孕激素等的共同作用在体子宫内膜细胞分离培养后失去这些激素的作用而表现出生长缓慢等特征而且大量的研究证明性腺激素对上皮细胞和基质细胞的作用是不可忽视的笔者通过差速离心法和反复差速贴壁法成功地在体外分离和培养了子宫内膜细胞并且通过滤网法获得平滑肌细胞种细胞的形态比较均一笔者分别用不同浓度的 # " 和! 培养上皮细胞和基质细胞结果发现在高浓度! 情况下种细胞的增殖能力强这也符合在体的激素浓度变化笔者还观察了在此培养条件下培养了代以后的上皮细胞研究它的生长情况结果发现上皮细胞形态正常增殖能力很强并且通过免疫荧光的方法鉴定细胞的纯度每种细胞的纯度达到左右而且本研究在细胞培养基中加入一定浓度的雌激素和孕激素探索子宫内膜细胞体外生长的条件为以后的研究提供支持子宫内膜基质细胞发生蜕膜化是指成纤维样的基质细胞在形态和功能上向蜕膜细胞转变的过程蜕膜细胞在胚胎着床和发育等方面起重要的作 " 用 - 等报道的蜕膜细胞对来自于滋养层细胞的旁分泌的信号的反应证明了蜕膜细胞对胚胎植入的重要意义妊娠早期类固醇激素!!9:- 和 # " #:-9-:- 通过控制子宫上皮细胞和基质细胞的增殖和分化作用来调节一系列复杂的胚胎与母体子宫间的相互作用它们间的协同

5 " 畜牧兽医学报卷 $8<*-9*()+9* 免疫荧光染色罗丹明染胞质阳性胞质呈红色!-+,9 非特异性染核细胞核呈蓝色的重叠图 $! 的重叠图 68 的重叠图 $8<*-9*()+9**//:-+-99)**,)*-9)**:9,-+197)97*( 9*-+197)9,-:-!-+,9(7-+**+*919)**:/+-*/+-*,-;/- %-:-7*+9/:-)%-:-7*+9/:-$)!6%-:-7*+9/:-8) 图子宫内膜第代上皮细胞基质细胞和平滑肌细胞免疫荧光染色 01,#&$#!#$1&!1!$$!#$$ 作用保持子宫内膜的蜕膜化程度促进胚胎的植入已经证实类固醇激素可通过调节基因来控制这些作用本研究在前期研究的基础上进一步调整激素浓度观察基质细胞的变化结果发现基质细胞在受到合适的激素的刺激下由以前梭形分化能力差多能性的间充质细胞向两个方向分化其中约一半的细胞增大变成大而圆的蜕膜细胞另一半分化为小而圆的颗粒细胞这和以前的报道相一致体外研究子宫内膜细胞的蜕膜化的调节机制可以了解体内激素的调节水平有助于正确地了解子宫内膜的容受性及其与胚胎间的作用机理子宫平滑肌层含有大量的血管如果平滑肌层细胞过度生长势必造成血管壁的增厚管腔堵塞体外培养平滑肌细胞有利于研究子宫和其他富含血管器官的血管形成机制子宫平滑肌细胞也表达金属蛋白酶 %%#( 及其抑制剂 6%#( 而雌激

6 期陈秀荔等家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养 " 素和孕激素对 %%# 的表达有调控作用它们之间的不协调表达会造成子宫肌瘤本试验以兔子宫组织为材料通过滤网法分离得到纯度较高的平滑肌细胞所培养的细胞呈横纹状生长部分区域可见典型的峰 ( 谷样 ()+9* 免疫组织化学染色阳性纯度较高该方法的建立为进一步研究平滑肌的功能代谢以及病理变化提供了新的试验模型为研究子宫方面的生理变化和疾病的发生提供资料参考文献 8*/*+-!/+*)9*--9:*) /+9**9,- 79(-*+-:)5/ -7: =7)9-7*5$67)9)9*9:7,;)9*-:-9*)9* ),)-+,:*) 7)+-9)9*-+,)*9*+-*-+- '')'55- +* #9" *,-:5$)1 /)+199:7,;)9*( )*5-*- *" ")79 ))-!.7:-*-( --::*;/+-*+)+*-+*)9:*.-9)7:9-*( )-)9,-*:9*/-*,*;*9:*:-)9-9-9:/( )9*55!+:*"" #*-::!%**+*-*)*"9:)(-7*9,-*( ) *9-:)+9* /)9--9:-:-7*--* :),/)--9:*/5* -7: " 8?:)*)#"!9);*,-9,/)--9:*) +- +/9/:-5/ -7: 陈秀荔靳亚平利光辉等孕早期家兔子宫内膜细胞的分离培养与形态观察 5 西北农林科技大学学报自然科学版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陈秀荔靳亚平张彦明分离培养兔子宫内膜细胞的鉴定及性激素对子宫内膜间质细胞形态的影响 5 畜牧兽医学报 )4)$ %-% 3" -:*7)( 9)9*++/9/:-;)9+19)/9-:*---9:*/ **+-5* -7: -): %))# *-,*9:1-+*/) +-) :-*-55-7:6/ %),);--,):8 ))9, # 0) < %-9,:*)9*-9,-*) )9,/( +-+-)'7:*-:)9*))15%-9, % 9:*.-9)7:9-*)-,/) -*1)*):*( /9)-9/::9,581-+ ;9-96( -9""

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期 陈 秀 荔 等 家 兔 子 宫 内 膜 细 胞 和 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 培 养 " 9,/+-+- )*+!--9:*) +-9, /+-+-*/,*9+,-*9:1*//: */)*0)9* 子 宫 内 膜 作 为 性 激 素 作 用 的 靶 器 官 在 生 殖 生

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