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毖郝
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1 摘浙江省南美白对虾苗种五种流行病病原检测与分析郑晓叶 1, 许俊榆 2, 郑天伦 1, 朱凝瑜 1, 曹飞飞 (1. 浙江省水产技术推广总站, 浙江杭州 ; 2. 浙江科技学院生物与化学工程学院 / 轻工学院, 浙江杭州 ) 要 : 为了解浙江省南美白对虾主产区苗种主要病原的携带情况, 对杭州宁波嘉兴和绍兴 4 个地区的苗种场开展了病原检测 129 批次样品的检测结果显示 : 有 4 种病原检出阳性, 阳性检出率分别为南美白对虾白斑综合症病毒 (WSSV)1.55% 传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)20.93% 虾肝肠胞虫 (EHP) 31.78% 虾血细胞虹彩病毒 (SHIV)37.21%, 而桃拉综合症病毒 (TSV) 未有阳性检出结果表明,SHIV EHP IHHNV 是浙江省对虾苗种携带的主要病原, 需要重点加以防范从整体分布看, 宁波市南美白对虾苗中携带的病原种类最多, 且携带率较高, 提示宁波市需要加强防控从苗种来源看, 来自福建省虾苗的 IHHNV 携带率最高, 为 38.10%; 来自海南省和广东省虾苗中存在 WSSV 感染, 检出率分别为 2.17% 和 2.27%; 来自广东省虾苗的 EHP 和 SHIV 携带率最高, 分别为 43.48% 和 41.30% 由于浙江省南美白对虾苗种主要依靠外地输入, 而这些输出地区的苗种病原感染率较高, 因此浙江省需要加强从这些地区引入苗种的检疫工作关键词 : 南美白对虾 ; 虾苗 ; 对虾白斑综合症病毒 ; 传染性皮下及造血组织坏死病毒 ; 虾肝肠胞虫 ; 虾血细胞虹彩病毒 ; 桃拉综合症病毒 ; 浙江省中图分类号 :S851.3 文献标识码 :A 文章编号 : X(2018) DOI: /j.issn X Detection and Analysis on Five Kinds of Pathogens in White Shrimp(Penaeus Vannamei)in Zhejiang Province Zheng Xiaoye 1,Xu Junyu 2,Zheng Tianlun 1,Zhu Ningyu 1,Cao Feifei 1 (1. Zhejiang Fisheries Technical Extension Station,Hangzhou,Zhejiang ,China; 2. College of Biological and Chemical Engineering/College of Light Industy, Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou,Zhejiang ,China) Abstract:In order to recognize the main pathogens carried by white shrimp(penaeus vannamei)in Zhejiang Province,a total of 129 samples were collected from shrimp seed hatcheries in 4 cities of Hangzhou,Ningbo, Jiaxing and Shaoxin and used for pathogen detection. According to the results,four kinds of pathogens were detected, including white spot syndrome virus(wssv),infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus(ihhnv), enterocytozoom hepatopenaei(ehp)and shrimp hemocyte iridescent virus(shiv). The results showed that the positive rate of WSSV was 1.55%,while the rates of IHHNV,EHP and SHIV were 20.93%,31.78% and 37.21%, respectively. However,Tauras syndrome virus(tsv)was not detected from samples in the present research. SHIV EHP and IHHNV were the main pathogens carried by shrimp seedlings in Zhejiang Province,which needed more attention. In terms of regional distribution,the samples collected from Ningbo City carried the most species of pathogens and the carrying rate was relatively high,indicating prevention and control should be strengthened by Ningbo Authorities. In terms of shrimp seed sources,the highest carrying rate(38.10%)of IHHNV was found in shrimp 1 基金项目 : 浙江省水产新品种选育重大科技专项 (2016C ); 浙江省水生动物疫病防控项目 (SY201710) 通信作者 : 郑天伦 17

2 larvae from Fujian Province,WSSV infection was observed in shrimp larvae from Hainan Province and Guangdong Province,the detection rates were 2.17% and 2.27%,respectively. And the highest carrying rates of EHP and SHIV were both observed in shrimp larvae from Guangdong Province,which were 43.48% and 41.30%,respectively. Since the white prawn seedlings of Zhejiang Province are mainly imported from other provinces,where the infection rate is relatively high,hence the inspection and quarantine work towards such seedlings should be strengthened by Zhejiang Province. Key words:penaeus vannamei;shrimp seedling;white spot syndrome virus of shrimp;infectious subcutaneous and hematopoietic necrosis virus;shrimp liver enterobacteria;shrimp blood cell iridescent virus;taura syndrome virus; Zhejiang Province 南美白对虾 (Penaeus vannamei) 因生长迅速抗病力强成为全球主要的对虾养殖品种之一 [1] 近年来, 我国在南美白对虾海水养殖成功后, 又进行了苗种淡化培育, 并在越来越多淡水地区养殖成功, 由此带来了较大的经济效益 [2] 但随着对虾养殖规模的不断扩大及不同来源苗种的引进, 对虾疾病问题日益复杂, 病害频发给对虾养殖业带来了严重经济损失及时准确地诊断疾病, 尽快采取有效应对措施是保证对虾健康和生态养殖的关键 [3] ; 加强检测, 筛选出健康优良的虾苗, 则是养殖成功的重要手段白斑综合征 (White spot disease,wsd), 桃拉综合征 (Taurasyndrome,TS), 传染性皮下及造血器官坏死病 (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis,ihhn) 被世界动物卫生组织 (OIE) 划为必须通报的甲壳类动物疫病, 其中 WSD( 病原为 White spot syndrome virus, WSSV) 被我国列入一类动物疫病名录,TS( 病原为 Tauras syndrome yirus,tsv) 和 IHHN( 病原为 Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,ihhnv) 被我国列入二类动物疫病名录 [4] 虾肝肠包虫 (Enterocytozoom hepatopenaei,ehp) 自 2013 年在我国沿海对虾养殖主产区被发现后, 检出率有增高趋势, 具有较高的流行风险, 是导致南美白对虾生长缓慢的主要病原之一 [5] 对虾血细胞虹彩病毒 (Shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV) 是近年来在南美白对虾发病样品中检测到的一种新病原, 易造成虾空肠空胃体色变淡肝胰腺组织松散, 可使部分感染虾出现软壳和体表发红 [6-7], 因其能够感染克氏原螯虾澳洲淡水龙虾等, 且具有传染性, 成为对虾养殖业的新威胁本研究通过采样检测 IHHNV WSSV EHP TSV 和 SHIV 5 种病原, 了解浙江省南美白对虾主养区苗种的病原携带情况, 从而为浙江省虾病防控健康养殖提供参考, 为制定合理的保健预防对策提供依据 1 材料与方法 1.1 材料检测用虾苗 2017 年 3 7 月, 采集杭州绍兴宁波嘉兴 4 个市 62 家淡化苗种场及养殖场, 共 129 批次的虾苗样品同一时间同一苗种场采集单一来源苗种 150 尾作为 1 份样品, 称之为 1 批次主要试剂 DNA 提取试剂盒 ( 天根 DP304-03),Qiagen Rneasy MiNi Kit(50) 试剂盒 (QIAGEN, 德国 74014),Prime Script II 1st Strand cdna Synthesis Kit 试剂盒 (TAKARA 6210A),2 GoldStar MasterMix(Dye)( 康为世纪 CW0682L) 1.2 方法样品采集与处理样品采集按照水生动物产地检疫采样技术规范 (SC/T ) 进行将采集的活虾苗样品, 浸泡固定于 3 倍体积的 95% 酒精中, 然后置于低温冰盒中, 及时送实验室检测样品大小为 0.5~1 cm, 用 50 ml 离心管浸泡保存如不能立即检测, 就将样品暂存于 80 冰箱中提取核酸前用液氮研磨组织, 将均质后的组织分别用于 DNA 和 RNA 提取 18

1.2.2 DNA 提取取 30 mg 虾苗组织匀浆置于 1.5 ml 离心管中, 参照 DNA 提取试剂盒说明书进行 DNA 提取, 将提取的 DNA 保存于 20 冰箱 1.2.3 RNA 提取与反转录取 30 mg 虾苗组织匀浆置于 1.

3 1.2.2 DNA 提取取 30 mg 虾苗组织匀浆置于 1.5 ml 离心管中, 参照 DNA 提取试剂盒说明书进行 DNA 提取, 将提取的 DNA 保存于 20 冰箱 RNA 提取与反转录取 30 mg 虾苗组织匀浆置于 1.5 ml 无 RNA 酶的离心管中, 参照 Rneasy MiNi Kit(50) 试剂盒说明书提取 RNA, 并将提取的 RNA 迅速进行反转录反转录采用 Prime Script II 1st Strand cdna Synthesis Kit 试剂盒将反应混合液 65 保温 5 min 后, 置于冰上迅速冷却 ; 将反转录反应液缓慢混合均匀后, 置于 PCR 仪上 42 1 h,75 15 min,4 终止将反转录产物保存于 20 冰箱 PCR 产物送测序, 与 NCBI 上的序列进行比对, 确定是否真的携带病原表 1 5 种南美白对虾病原引物引物名称引物序列 (5 3 ) 目的片段大小 /bp 参考文献 WSSV_F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG WSSV_R1 TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACG WSSV_F2 GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA WSSV_R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 941 [8] IHHNV_389F CGGAACACAACCCGACTTTA IHHNV_389R GGCCAAGACCAAAATACGAA 389 [9] TSV_231F AAGTAGACAGCCGCGCTT TSV_231R TCAATGAGAGCTTGGTCC 231 [10] SHIV_1F GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT SHIV_1R TCGTTTCGGTACGAAGATGTA 457 SHIV_2F CGGGAAACGATTCGTATTGGG SHIV_2R TTGCTTGATCGGCATCCTTGA 129 [7] EHP-SWP_1F TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT EHP-SWP_1R CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC 514 EHP-SWP_2F TTGGCGGCACAATTCTCAAACA EHP-SWP_2R GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA 148 [11] PCR 检测以提取的 DNA 或反转录得到的 cdna 为模板, 分别进行 IHHNV [8] WSSV [9] TSV [10] EHP [11] 和 SHIV [7] 的特异性 PCR 检测, 并设置阳性对照阴性对照和空白对照 PCR 反应体系为 50 μl:2 Gold Star Master Mix(Dye) 25 μl Forward Primer(10 µmol/l)2 μl Reverse Primer(10 µmol/l)2 μl Template DNA <0.5 μg, 加 ddh 2 O 至总体积 50 μl 检测 5 种病原的引物和参考方法见表 1 反应结束后, 取反应产物 5 μl, 用 1 TAE 配置的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 并在凝胶成像系统中观察并拍照 ( 图 1); 比对阳性对照条带位置, 判断是否为阳性若为阳性, 则将图 1 虾苗样品 PCR 检测结果电泳图 2 结果 2.1 总体检测情况 2017 年从浙江省 4 个市共采样 129 批次南美白对虾虾苗样品, 经检测分析发现 : 携带 SHIV 的 48 批, 携带 EHP 的 41 批次, 批阳性检出率较高, 分别为 37.21% 和 31.78%; 携带 IHHNV 的 27 批次, 批阳性检出率为 20.93%; 携带 WSSV 的 2 批次, 批阳性检出率为 1.55%; 未检出 TSV 2.2 不同采样地区检测情况分别从杭州市绍兴市嘉兴市和宁波市采集和 43 批次虾苗样品除 TSV 未检出外, 其余 4 种病原均有检出 ( 图 2):WSSV 19

4 仅在宁波市苗种场样品中检出, 批阳性检出率为 4.65%;IHHNV 在宁波市的批阳性检出率最高, 为 48.84%;EHP 和 SHIV 在各地均有检测出, 其中宁波市的 EHP 和 SHIV 批阳性检出率均最高, 分别为 37.21% 和 55.81% 2.4 不同来源虾苗检测情况采集的虾苗样品主要来自广东海南和福建等地, 分别为和 21 批次不同来源虾苗的阳性检出情况如图 4 所示 :WSSV 在来自广东省和海南省的虾苗中有检出, 但批阳性检出率较低 ; IHHNV 在来自福建省和广东省的虾苗中检出率较高, 分别为 38.10% 和 32.61%;EHP 和 SHIV 检出率普遍较高, 其中广东省虾苗中 EHP 和 SHIV 阳性检出率最高, 分别为 43.48% 和 41.30% 图 2 不同采样地区批病原阳性检出率 2.3 不同苗种类型检测情况可追溯到苗种类型的虾苗共 103 批次, 其中一代苗 76 批次二代苗 12 批次普通苗 15 批次不同类型苗种病原携带情况如图 3 所示 : 一代苗样品中, 检出 3 种病原,EHP 的批阳性检出率最高, 为 35.53%; 二代苗样品中, 除 TSV 未检出外, 其他 4 种病原均有检出,SHIV 的批阳性检出率最高, 为 66.67%; 普通苗中, 检出 3 种病原, 且批阳性检出率普遍较高, 其中 IHHNV 最高, 为 86.67% 图 3 不同类型南美白对虾苗种批病原阳性检出率图 4 不同来源苗种的批病原阳性检出率 3 讨论随着集约化养殖模式的发展, 南美白对虾面临的病毒病威胁越来越严重多数病毒病具有传播速度快发病率高致死率高等特点, 给虾养殖造成了严重经济损失 [12] 本研究检测了南美白对虾苗种中 IHHNV WSSV EHP TSV 和 SHIV 5 种病原的携带情况, 在所有 129 批次虾苗样品中未检出 TSV, 这与王筱珊 [12] Yu 等施慧等 [15] [13] 林开等 [14] 的调查结果基本一致他们从 2009 年开始在全国很多地区进行检测, 都未检测到 TSV 中国水生动物卫生状况报告 [16-17] 显示,2015 年的 TSV 检出率为 0.3%(1/379),2016 年未有阳性样品检出, 表明 TSV 在很多地区已得到了很好地控制, 也提示病毒病可以通过有效防控, 使感染率维持在一个较低水平调查结果显示,129 批次样品虾苗中,WSSV 的批阳性检出率为 1.15%, 且只在宁波市被检出, 20

5 说明浙江省通过加大对该病的防控力度, 取得了较好效果自 2012 年 WSSV 感染高峰期过后 [18], WSSV 对对虾的危害程度有所减弱, 但由于传播迅速致死率高, 其依然是危害南美白对虾健康的重要病原 IHHNV 是导致对虾生长缓慢的主要病原之一, 并且能够垂直传播 IHHNV 1981 年首次在美国夏威夷地区的细角滨对虾中被发现, 当时造成的死亡率高达 90% 以上 [19] 此次调查发现, IHHNV 的批阳性检出率为 20.93%, 且随采样地区的不同, 变化也很大, 如宁波市的 IHHNV 阳性检出率高达 48.84%, 而嘉兴市的未检出此外, 随苗种类型和来源的不同,IHHNV 感染率波动也很大, 普通苗阳性检出率最高达 86.67%, 来自福建省广东省的苗种阳性检出率也超过了 30% 查阅往年 IHHNV 传播情况可知, 该检测结果与年的 IHHNV 感染率 [20] 相近 2015 年江苏省 IHHNV 感染率达到了 39.48% [12] ;2016 年的国家水生动物疫病监测情况显示, 全国 8 省 ( 直辖市 ) 检出 IHHNV 阳性样品, 平均样品阳性检出率为 22.2%, 而 2015 年有 6 省 ( 直辖市 ) 检出 IHHNV 阳性样品, 平均阳性检出率为 21.6% [16-17] 由此可知, IHHNV 的传播性较强, 需加大对 IHHNV 的预防力度南美白对虾感染 EHP 后生长缓慢或停滞 [21-22], 从而影响南美白对虾的产量此次调查中的 EHP 阳性检出率高达 31.78%, 且不同种类来源采样地区的阳性率变化不大自 2009 年开始,EHP 在东南亚地区多数国家的养殖对虾中被发现 [23], 虽然其不会造成对虾的大量死亡, 但会导致感染对虾生长缓慢或生长停滞, 如果大规模扩散, 必定造成对虾养殖业的巨大经济损失 [24-25], 因此仍需得到重视自 2013 年以来, 我国沿海对虾养殖主产区先后发现 EHP 流行, 且检出率较高 2015 年辽宁省检出率高达 34.6% [26], 粤西地区检出率为 41.38% [24] ; 黄海水产研究所 OIE 参考实验室在我国沿海多省份进行的对虾流行病调查显示,2015 年 EHP 阳性率为 35.6%,2016 年为 30.9%,EHP 阳性样品主要是南美白对虾 [16-17], 与本次调查结果基本一致虾血细胞虹彩病毒 (SHIV) 是 2014 年在我国浙江省一批严重发病死亡的对虾样品中分离鉴定出的新虹彩病毒, 可感染南美白对虾罗氏沼虾, 导致的死亡率高, 是对虾养殖业的新威胁 [6] 此次调查采用灵敏度较高的套式 PCR 检测 [7], 在 129 批次样品中发现 SHIV 阳性检出率高达 37.21%, 且在不同采样地区苗种类型和来源下,SHIV 检出率均较高, 尤其在宁波市,SHIV 批阳性检出率高达 55.81%, 因而需要尽快制定防控措施, 加以防范 4 结论对浙江省 4 个地区 129 批次对虾苗种样品的检测结果表明,SHIV EHP IHHNV 的批阳性检出率较高, 是浙江省对虾苗种携带的主要病原, 需要重点加以防范从苗种类型看, 一代苗携带的病原种类最少, 且携带率较低从苗种来源看, 来自福建省广东省海南省的虾苗均有病原检出, 其中来自福建省虾苗的 IHHNV 携带率最高, 来自广东省虾苗的 EHP 和 SHIV 携带率最高由于浙江省的南美白对虾苗种主要依靠外地输入, 因此必须加强引入苗种的检疫工作, 尤其是来自福建省和广东省的虾苗参考文献 : [1] 王美雪, 郭冉, 夏辉, 等. 七种不同结构糖源对凡纳滨对虾三大营养物质代谢的影响 [J]. 水产学报, 2016,40(4): [2] 侯路红. 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV) 病毒样颗粒的研究 [D]. 厦门 : 厦门大学, [3] 夏小明. 对虾 WSSV 和 IHHNV 病毒重组酶聚合酶扩增 (RPA) 快速检测方法的研究 [D]. 上海 : 上海海洋大学,2015. [4] 农业部渔业渔政管理局. 全国水产技术推广总站. 水生动物防疫工作实用手册 [M]. 北京 : 中国农业出版社, 2015 [5] 许杰, 邓威, 李军, 等. 虾肝肠胞虫 (EHP) 流行病学与检测技术研究进展 [J]. 中国动物检疫,2018,35 (2):64-68 [6] QIU L,CHEN M M,WANG R Y,et al.complete genome sequence of shrimp hemocyte iridescent virus SHIV)isolated from white leg shrimp,litopenaeus 21

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