實驗一、革蘭氏染色

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迈倪
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食品微生物學與實驗課程講義授課老師 : 殷儷容教授聯絡電話 :(07)3617141 轉

1 食品微生物學與實驗課程講義授課老師 : 殷儷容教授聯絡電話 :(07) 轉 ljyin@mail.nkmu.edu.tw 第 1 頁, 共 17 頁

2 105 學年度第 1 學期實驗課程週次日期實驗名稱一 9/13 課程講解開學打掃二 9/20 固液體培養基等實驗材料製備三 9/27 菌株活化轉接保存 ( 冷凍管斜面 ) 四 10/4 細菌生長影響因子 - 培養基之營養源 & ph 值 & 培養溫度五 10/11 業師 : 食品與生技產業發展趨勢 : 介紹公司發展趨勢六 10/18 業師 : 功能性產品市場趨勢 : 篩選可分解 skim milk casein 之菌株七 10/25 連續稀釋與微生物菌數計數法 ( 塗抹混稀 ) 八 11/1 操作考 ( 連續稀釋 ) 九 11/8 期中考週十 11/15 期中筆試十一 11/22 濾膜法十二 11/29 業師 : 功能性酵素於食品產業之應用 : 將 keratinase 實際水解羽毛十三 12/6 業師 : 功能性酵素特性與生產製程 : 測定微生物生產之 Keratinase activity 十四 12/13 自製優酪乳與菌數檢測 ( 滴定法 ) 十五 12/20 自製優酪乳儲藏試驗 ( 劃線單離 ) 學生實驗報告十六 12/27 學生實驗報告十七 1/3 期末筆試十八 1/10 期末考週協同授課業師 : 金衣生命科學股份有限公司 - 戴學明協理第 2 頁, 共 17 頁

3 實驗一 (W2,9/20) 固液體培養基等實驗材料製備一實驗目的 : 能了解培養基的種類與用途及其配製方法培養基即指可使微生物生長的液體半固體或固體的營養物質營養肉羹 (Nutrient Broth, 簡稱 NB), 適用於細菌液體培養營養瓊脂 (Nutrient Agar, 簡稱 NA), 適用於細菌固體培養使用高溫高壓殺菌法使之達到無菌狀況三藥品與器材 : 高壓滅菌釜水浴槽螺旋試管三角瓶蒸餾水培養皿酒精燈打火機 NA (NB+agar) NB 無菌操作檯量筒 75% 酒精試管架四操作步驟 : 1. Nutrient Broth (NB): 分裝 5 ml 於試管中廠牌 :Difco Beef Extract 3.0 g Peptone 5.0 g Distilled water 1 L Suspend 8 g of the powder in 1 L of distilled water. Sterilize by autoclaving at 15 lbs pressure (121 ) for Nutrient Agar (NA): 倒皿 20~25 ml NB + 1.5% agar sterilization pour plate 3. NA slant: NA agar 分裝 4 ml 於試管中 sterilization 傾斜凝固 4 o C 冰箱存放 4. 75% Alcohol soln:789 ml 95% Alcohol soln +211 ml distilled water. 五參考資料 : 吳全耀等 (2003), 普通微生物學實驗 ( 第一版 ), 台北 : 九州圖書 (pp ) 組別配製藥品配藥順序第一組 : NA(slant)*75 支 ; 每支 4 ml 4 第二組 MRSA * 60 片 ; 每片 25 ml 1 第三組 NA * 3; 每瓶 500 ml 第四組 NA * 3; 每瓶 500 ml 2 第五組 Drop method 稀釋液 * 100 支 ; 每支 4.5 ml 第六組 Drop method 稀釋液 * 100 支 ; 每支 4.5 ml 5 (1) 2% tryptone +0.5% NaCl * 30 支 ; 每支 5 ml 第七組 (2)NB + 0.5% NaCl * 30 支 ; 每支 5 ml 6 (3)2% peptone + 0.5% NaCl*30 支 ; 每支 5 ml ph6.4 TSB * 100 支 ; 每支 5 ml 第八組 ph9.0 TSB * 50 支 ; 每支 5 ml 3 ph4.0 TSB * 50 支 ; 每支 5 ml 第九組稀釋液 * 100 支, 每支 4.5 ml 7 第十組 NB * 150 支 ; 每支 5 ml 8 第 3 頁, 共 17 頁

4 一實驗目的 : 實驗二 (W3,9/27) 菌株活化轉接保存 ( 冷凍管斜面 ) 學習利用冷凍保存管, 將菌作長期儲存活化轉接菌株保存管, 以確認保存無誤利用回復試驗確定菌株可冷凍保存三藥品與器材 : 打火機 250 ml flasks 滅菌 tips (1 ml) pipette (1 ml) 簽字筆衛生紙試管架震盪器酒精噴槍 50 ml beaker ph meter 接種環培養液市售樣品酒精燈菌種冷凍保存管四操作步驟 : 標準菌株 :B. subtilis 菌種保存 : 1. 冷凍珠珠 : 先將管內之甘油全部吸出, 再取標準菌液 1 ml 注入保存管內, 充分震盪一分鐘後, 使菌液充分吸附, 再全部吸出標示日期菌名及組別並置入保存盒, 於 -80 o C 保存 2. 甘油保存 : 直接取標準菌液 0.5 ml 注入已滅菌甘油保存管內, 充分震盪一分鐘後, 使菌液充分混合標示日期菌名及組別並置入保存盒, 於 -80 o C 保存 3. 斜面保存 : 接種環燒紅後勾取 1 loop 菌液, 以 Z 字型輕畫到斜面培養基,37 o C 培養, 於 4 o C 冰箱保存 2 週菌株保存回復試驗 ( 活化菌株 ): 1. 冷凍珠珠 : 珠珠活化於 broth 培養 24 hr 觀察菌液是否混濁 2. 甘油保存 : 手握住甘油保存管, 以手溫融化甘油甘油完全溶化後, 取 0.1 ml 保存液接種於 broth 培養 24 hr 觀察菌液是否混濁菌株轉接 (Broth): 1. 取一新鮮 Broth 備用, 燒紅接種環勾取 1 loop 菌液, 至新鮮 broth 於 37 o C 培養, 震盪混合五各組分配 : 1. 珠珠保存 / 活化 : 每組一管 2. 斜面保存 : 每人一管 3. 菌株轉接 (Broth): 每人一管六參考資料 : 吳全耀等 (2003), 普通微生物學實驗 ( 第一版 ), 台北 : 九州圖書 (pp ) 七結果與討論 : 1. 請說明菌株之活化保存及轉接過程中之注意事項? 第 4 頁, 共 17 頁

5 實驗三 (W4,10/4) 細菌生長影響因子 - 培養基之營養源 & ph 值 & 培養溫度一實驗目的 : 利用培養基之營養源 & ph 值 & 培養溫度值的不同來比較細菌生長情形培養液之氮或碳源不同或 ph 值及培養溫度, 對 E. coli 與 B. subtilis 生長之影響, 藉由生長曲線判別菌體生長條件溫度影響微生物生長過程與其體內的化學反應的速率有關, 不同的微生物有其不同最適宜的繁殖溫度, 在其最適的溫度時, 生長較快, 其酵素活動也較旺, 因此其菌數亦繁殖較多, 當微生物於非最適溫度時, 則酵素將降低反應速率, 促使微生物繁殖減慢, 故利用於不同溫度時, 觀察微生物繁殖最多的情形, 即是此微生物的最適溫度微生物大部分酵素皆有最適的酸鹼值 (optimum ph values) 在此值的上或下都將影響酵素的反應速率而使微生物生長受到限制當培養基裡氫離子 (H + ) 濃度改變, 很多酵素三度結構可離子化的穩定基將受影響, 劇烈的改變 ph 值為造成酵素變性之原因, 進而影響到微生物的生長三藥品與器材 : 分光光度計酒精燈打火機微量分注器滅菌 Tips Tips 回收桶震盪器培養箱酒精噴槍紙巾拭鏡紙蒸餾水試管架標準菌株 : Escherichia coli, Bacillus subtilis 不同培養基 :NB peptone tryptone TSB 四操作步驟 : 1. 分光光度計開機暖機 15 分鐘, 校正並設定波長為 660 nm 2. 使用蒸餾水進行歸零 3. 將各組指定之新鮮培養基測定 ph 值及置入分光光度計中測定吸光值 (blank 組 ) 4. 取標準菌株 200 μl 接種至新鮮 5 ml broth 中 5. 試管震盪後放入分光光度計測定吸光值 6. 各組放入指定溫度之培養箱中培養 7. 間隔一定時間取出測定吸光值及 ph 值間隔時間 :0 (10:00) 30 (10:30) 60 (11:00) 90 (11:30) 120 (12:00) 180 (13:00) 240 (14:00) 300 (15:00) 8. 觀察吸光值及變化情形並記錄作圖五各組分配 : 組別標準菌株培養基 (5 ml) 分光 1-1,1-2 E. coli B. subtilis 2% tryptone + 0.5% NaCl 2-1,2-2 E. coli B. subtilis NB + 0.5% NaCl 3-1,3-2 E. coli B. subtilis 2% peptone + 0.5% NaCl 4-1,4-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 6.4,45 o C 5-1,5-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 6.4,37 o C 試管型第 5 頁, 共 17 頁

6 6-1,6-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 6.4,25 o C 7-1,7-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 4,37 o C 8-1,8-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 9,37 o C 9-1,9-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 4,45 o C 10-1,10-2 E. coli B. subtilis TSB,pH 9,45 o C 試管型六參考資料 : 吳全耀等 (2003), 普通微生物學實驗 ( 第一版 ), 台北 : 九州圖書 (pp ) 七結果與討論 : 吸光值變化菌種培養基 Blank 0 2% tryptone % NaCl NB + 0.5% NaCl 2% peptone + 0.5% NaCl E. coli TSB,pH 6.4,45 o C TSB,pH 6.4,37 o C TSB,pH 6.4,25 o C TSB,pH 4,37 o C TSB,pH 9,37 o C TSB,pH 4,45 o C TSB,pH 9,45 o C 2% tryptone + 0.5% NaCl NB + 0.5% NaCl 2% peptone + 0.5% NaCl B. subtilis TSB,pH 6.4,45 o C TSB,pH 6.4,37 o C TSB,pH 6.4,25 o C TSB,pH 4,37 o C TSB,pH 9,37 o C TSB,pH 4,45 o C TSB,pH 9,45 o C 第 6 頁, 共 17 頁

7 ph 值變化菌種培養基 Blank 0 2% tryptone % NaCl NB + 0.5% NaCl 2% peptone + 0.5% NaCl E. coli TSB,pH 6.4,45 o C TSB,pH 6.4,37 o C TSB,pH 6.4,25 o C TSB,pH 4,37 o C TSB,pH 9,37 o C TSB,pH 4,45 o C TSB,pH 9,45 o C 2% tryptone + 0.5% NaCl NB + 0.5% NaCl 2% peptone + 0.5% NaCl B. subtilis TSB,pH 6.4,45 o C TSB,pH 6.4,37 o C TSB,pH 6.4,25 o C TSB,pH 4,37 o C TSB,pH 9,37 o C TSB,pH 4,45 o C TSB,pH 9,45 o C 問題 : 1. 接 200 μl 的菌液到 5 ml 的培養基中, 其接菌量為多少? 2. 比較不同培養基對於二株標準菌生長之影響? 3. 比較不同 ph 值之 TSB 對於二株標準菌生長之關係? 4. 比較 E. coli 和 B. subtilis 在 25 o C 37 o C 45 o C 培養下, 何者生長比較快? 5. 請問 E. coli 和 B. subtilis 何者對生長環境有較佳的耐受性? 請說明解釋 6.TSB 和 NB 之組成份? 第 7 頁, 共 17 頁

8 一實驗目的 : 實驗四 (W6,10/18) 業師授課 - 功能性產品市場趨勢 - 篩選可分解酪蛋白之菌株學習利用選擇性平板培養基, 判斷菌株是否可以分解脫脂乳粉或酪蛋白蛋白質被分解的過程, 稱為蛋白質水解, 參與水解反應的酵素稱為蛋白質水解酵素 (protease) 將脫脂乳粉混入洋菜中, 測定微生物產生酪蛋白水解酵素的能力, 測定酪蛋白被水解而使菌體周圍由乳白色變成透明圈三藥品與器材 : 標準菌株 : E: 大腸桿菌 Escherichia coli B: 枯草桿菌 Bacillus subtilis S: 嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermopilus (Negative control) 實驗培養基 : (1)skim milk agar:1% skim milk + NA (2)skim milk + casein agar:1% skim milk + 1% casein + NA (3)casein agar:1% casein + NA 四操作步驟 : 點試驗 : 每人取一片經畫線單離培養之 agar 以 tip 尖端輕沾取單一菌落之標準菌株再點於實驗培養基 agar 片上 37 o C 培養 24 hr 挖洞試驗 : 每人取一管經培養後之 broth 以 1000 μl tip 頭插入 plate agar 內挖洞注入 100 μl 菌液 37 o C 培養 24 hr 蛋白質水解試驗判斷 : 觀察菌落生成周圍, 有透明圈 - 代表可水解蛋白質五各組分配 : 每組三株標準菌, 每人一片, 每片三株各點兩點組別培養基種類試驗方法組別培養基種類試驗方法一 skim milk agar 六 skim milk agar 挖洞試驗二三 skim milk + casein agar 點試驗七八 skim milk + casein agar 四五 casein agar 九十 casein agar 六參考資料 : 菌液直接滴入 C. Suganthi, A. Mageswari, S. Karthikeyan, M. Anbalagan, A. Sivakumar, K.M. Gothandam Screening and optimization of protease production from a halotolerant Bacillus licheniformis isolated from saltern sediments. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 11(1): 七結果與討論 : 洞內第 8 頁, 共 17 頁

9 在實驗平板培養基上, 進行測量透明圈的直徑大小, 並記錄第 9 頁, 共 17 頁

10 實驗五 (W7,10/25) 連續稀釋與微生物菌數計數法 ( 塗抹混稀 ) 一實驗目的 : 為了能將水空氣土壤及食物等樣品裡存有的菌數算出一般我們以每培養皿中含有 25~250 個菌落為最適宜而為了達到最適宜的標準, 則採樣回來的樣品需要經過適當的稀釋及估計好氣性菌落數的計數是用於指示在某一產品或樣品中所含有好氣性微生物的多少總菌落的計算法, 一般普遍使用的有二種方法 :(1) 塗抹法,(2) 混稀法使用非選擇性培養基裡豐富的營養供細菌生長, 利用稀釋的方法將樣品中細菌的數目減少到每 1 ml 中含有 25~250 個菌數下, 再將此菌液與培養基均勻混合或塗抹在 agar 表面, 利用洋菜可固化的特性將本已分散的細菌在營養的提供下, 使細菌生長而形成菌落三藥品與器材 : 三角瓶 (500 ml) 無菌操作台橡皮筋恆溫培養箱簽字筆 Tips 稀釋液含 TSA agar (250 ml) 無菌培養皿酒精燈酒精噴槍打火機震盪器棉手套 Pipette (1mL) 水浴槽 (70 o C) Tip 回收桶試管架四操作步驟 : (1) 樣品 10 倍連續稀釋 : 取 0.5 ml 樣品 ml 稀釋液 (0.85% NaCl) 混合均勻 ( 振盪 ) 共 8 管混稀法 (Pouring plate method) 1. 將凝固的 agar 放入 70 o C 水浴槽溶解備用 2. 取次方稀釋倍數之 1 ml 稀釋液至 plates 正中央將 agar 倒入 plate 裡, 搖動均勻凝固後培養 24 小時 /37 計數 ( 隔天中午前觀察 ) 塗抹法 (Spreading method) 1. 取次方稀釋倍數之 0.1 ml 稀釋液將稀釋液均勻塗抹至 agar plate 上 ( 需做二重複 ) 稀釋液乾燥後倒置 37 o C 培養計數 ( 隔天中午前觀察 ) 五各組分配 : 1. 稀釋液 : 每組八管 2.NA medium: 每組共 250 ml 混稀每人做一片, 其餘 pour plates 3.NA plate: 每組六片, 共 60 片每人塗抹一片六參考資料 : 吳全耀等 (2003), 普通微生物學實驗 ( 第一版 ), 台北 : 九州圖書 (pp. 124) 七結果與討論 : 1. 本次實驗菌濃度總菌數為多少? ( 請分別列出混稀法與塗抹法的計算式 ) 2. 請分別說明使用混稀法塗抹法時應注意的事項有哪些? 3. 請比較混合稀釋法塗抹法的優缺點為何? 4. 單位 CFU 全名為何? 第 10 頁, 共 17 頁

11 實驗六 (W12,11/22) 濾膜法一實驗目的 : 使用 0.45 μm 濾膜與抽氣過濾裝置, 攔截水質之菌落, 於 agar plate 上觀察過濾法屬於一種直接攔截的方式, 將滯留於濾膜上的水溶液及細菌, 經抽氣使產生負壓力, 讓水溶液經孔洞流下, 由於菌體大於孔洞, 被阻擋於濾膜上方, 再把具有細菌體的膜放置在培養基的表面, 適當培養後, 就可在膜上觀察菌落 (Colony) 三藥品與器材 : 75% 酒精酒精燈打火機簽字筆培養箱稀釋液平板培養基 (NA) 1. 稀釋瓶 : 一般使用 100 ml 的耐高溫滅菌之硼矽玻璃螺蓋製品 ( 內裝 90 ml 無菌稀釋液 ) 2. 過濾裝置 : 能耐高溫高壓滅菌的不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗, 鎖定裝置固定於底部 3. 容器 : 容量 500 ml 以上可滅菌之硼矽玻璃瓶或無菌有蓋容器 4. 抽氣幫浦 : 水壓式或吸氣式, 壓力差最好在 138 至 207 kpa 者 5. 鑷子 : 前端圓滑, 內側無波紋 6. 樣品瓶 : 以滅菌後之 50 ml 離心管進行取樣四操作步驟 : 1. 各組於指定位置以無菌容器盛裝水樣品 ( 水樣品取樣量需約 50 ml) 2. 水樣品於無菌操作臺取出適量進行連續稀釋, 並塗抹二重複 3. 同時樣品須測定 ph 值 ( 過濾前後都需測定 ) 4. 抽氣幫浦裝置架設好 5. 將薄膜過濾器固定在支架上 6. 水樣品通過濾膜, 進行抽氣過濾, 並收集濾液 7. 膜片正面放入 plate 中, 以 37 o C 培養 24 hr 後觀察 8. 收集到的濾液進行塗抹二重複, 以 37 o C 培養 24 hr 後觀察五各組分配 : 組別取樣地點組別取樣地點 1 厚生樓 3F 女廁 6 厚生樓 3F 飲水機 2 厚生樓 3F 男廁 7 厚生樓 2F 飲水機 3 厚生樓 3F 男廁 8 厚生樓 2F 飲水機 4 厚生樓 3F 女廁 9 厚生樓 7F 女廁 5 厚生樓 3F 飲水機 10 厚生樓 7F 女廁六參考資料 : 吳全耀等 (2003), 普通微生物學實驗 ( 第一版 ), 台北 : 九州圖書 (pp ) 第 11 頁, 共 17 頁

12 七結果與討論 : 1. 各組生菌數與 ph 值之比較組別採樣地點樣品 ph value 過濾前後樣品原液菌數 ( 二重複 ) 濾膜菌數濾液菌數 ( 二重複 ) 組別採樣地點樣品 ph value 過濾前後樣品原液菌數 ( 二重複 ) 濾膜菌數濾液菌數 ( 二重複 ) 2. 計算菌濃度與總菌數問題 : 1. 為何飲用水及一般水質測定之菌數量有所不同? 2. 使用濾膜法的優缺點為何? 3. 使用濾膜法而不使用混稀塗抹法的原因? 4. 比較塗抹法與濾膜法之菌數? 5. 試比較哪一組實驗結果較合理哪一組較不合理? 第 12 頁, 共 17 頁

13 實驗七 (W12,11/29) 業師授課 - 功能性酵素於食品產業之應用 - 將 keratinase 實際水解羽毛一實驗目的 : 由於羽毛是由角蛋白組成, 利用微生物所生產的角蛋白酶 (Keratinase), 將羽毛水解後可產生多種胜肽類與游離胺基酸, 可作為動物飼料之蛋白質來源及植物營養劑等, 相較於傳統使用高壓蒸煮或化學藥劑處理羽毛廢棄物 ; 使用生物技術處理不僅可以解決環境污染問題, 更可以提高收羽毛廢棄物之利用價值由於角蛋白質地堅硬, 含有高量的胱胺酸並形成雙硫鍵, 故雙硫鍵的裂解與角蛋白之分解有密切的關係角蛋白酶在與角蛋白初期接觸時會產生雙硫鍵的裂解反應, 此作用之後角蛋白結構更易於被破壞及分解三藥品與器材 : 三角瓶 (250 ml) 恆溫培養箱粗羽毛角蛋白酶電子秤 ph 酸鹼度計高壓滅菌釜鑷子簽字筆鋁箔紙四操作步驟 : 水解條件探討 : 利用 250 ml 三角搖瓶裝入 50 ml H2O 與 2% 粗羽毛, 添加角蛋白酶於 150 rpm 水解 0~2 hr, 探討不同因子對角蛋白酶水解羽毛之影響 : (1) 酵素添加量分別添加 1% 2% 角蛋白酶水解粗羽毛, 探討角蛋白酶水解羽毛之最適添加量 (2) 水解溫度添加 1% 2% 角蛋白酶, 分別以 55 o C 或 37 o C 水解 2% 粗羽毛, 探討角蛋白酶水解羽毛之最適水解溫度 (3) 加熱處理製備粗羽毛之水解搖瓶時, 粗羽毛先以 121 o C 加熱 15 分鐘而另一組不加熱, 兩組同時添加 2% 角蛋白酶於 55 o C 溫度下水解 0~2 hr, 探討角蛋白酶水解羽毛之前處理條件影響每組間隔一小時取出樣品測定 ph 值及粗羽毛變化情形並記錄五各組分配 : 組別 Temperature ( o C) Enzyme add (%) Pretreat Heat by autoclave Heat by autoclave Heat by autoclave Heat by autoclave Non-heat 第 13 頁, 共 17 頁

14 六結果與討論 : (1) ph value: Hydrolysis time (hr) o C 55 o C Heated Heated Non-heated 1% enz. 2% enz. 1% enz. 2% enz. 2% enz (2) 粗羽毛經水解後外觀型態是否改變? (3) 不同酵素濃度與水解粗羽毛之影響? (4) 添加相同酵素濃度, 在不同溫度下水解, 其反應結果為何? 原因為何? (5) 粗羽毛經過前處理, 是否影響水解反應? 第 14 頁, 共 17 頁

15 實驗八 (W11,12/6) 業師授課 - 功能性酵素特性與生產製程一實驗目的 : 角蛋白酶活性測定 - 測定微生物生產之 Keratinase Activity 以角蛋白酶與 azokeratin ( 偶氮角蛋白 ) 進行酵素反應後, 產生游離 azo-dye ( 偶氮色素 ), 並利用此 azo-dye 含量推測其角蛋白酶酵素活性三藥品與器材 : Azokeratin NaH2PO4 Na2HPO4 Trichloroacetic acid 微量分注器 :1000 μl 分光光度計試管震盪器桌上型離心機恆溫震盪培養箱 1.5 ml 微量離心管四操作步驟 : 試藥及試劑配製 ( 一 ) 0.625% Azokeratin (ph 7.5) 配製 M phosphate buffer (ph 7.5): A: 取磷酸二氫鈉 (NaH2PO4) 0.6 g 溶於 100 ml 蒸餾水 B: 取磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) 0.71 g 溶於 100 ml 蒸餾水以 B 液調整 A 液至 ph 秤取 0.1 g azokeratin, 再加入 16 ml 之 ph 7.5 phosphate buffer ( 二 ) 10% TCA: 秤取 10 g 加入 100 ml 蒸餾水混合均勻測定步驟 ( 一 ) 酵素液製備 : 取發酵液以 rpm 離心 20 分鐘, 收集其上層液, 以上層液進行分析活性 1. 測試樣品 (1) 取 0.8 ml 0.625% azokeratin 溶液及 0.2mL 粗酵素液置於 50 o C 培養箱中, 反應 60 分鐘 (2) 加入 0.2 ml 之 10% TCA 終止酵素反應 (3) 靜置 3 分鐘後, 以 rpm 離心 20 分鐘 (4) 取上層液, 並於波長 450 nm 下測定其吸光值 2. 空白組 (1) 取 0.8 ml 0.625% azokeratin 溶液及 0.2 ml 之 10% TCA 置於 50 o C 培養箱中, 反應 60 分鐘 (2) 反應完畢, 加入 0.2 ml 粗酵素液 (3) 靜置 3 分鐘後, 以 rpm 離心 20 分鐘 (4) 取上層液, 並於波長 450 nm 下測定其吸光值 ( 二 ) 活性計算 Unit (unit / ) = 450 nm 吸光值 F Df ( ) Df= 原酵素液稀釋倍數 F= 反應體積稀釋倍數 ( 反應體積 / 酵素體積 =1.2/0.2) 五各組分配 : 每組分別測定一管實驗組與控制組六參考資料 : A. Riffel, F. Lucas, P. Heeb, A. Brandelli Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Archives of Microbiology. 179(4): 七結果與討論 : 1. 請計算 Keratinase 之活性? 第 15 頁, 共 17 頁

16 實驗九 (W14,12/13) 自製優酪乳與菌數檢測 ( 滴定法 ) 一實驗目的 : 利用市售優酪乳之菌種進行無菌的脫脂牛奶發酵, 自製優酪乳另學習 drop method 檢驗分析活菌優酪乳之菌數 Drop method: 在稀釋液中加入 0.1% agar 使稀釋液不易流動, 達到 plate 減量的目的優酪菌發酵 : 利用市售優酪乳之活菌, 接種到已滅菌脫脂牛奶液 (2% skim milk + 0.1% glucose or 0.1% sucrose) 中, 進行發酵並儲藏一週, 利用劃線單離培養以確認活菌是否存在三器材及藥品 : 打火機 250 ml flasks 簽字筆酒精燈酒精噴槍試管架震盪器 pipette (1 ml) 滅菌 tips (1 ml) ph meter 市售樣品稀釋液 50 ml beaker 四操作步驟 : 乳酸菌發酵 : 取 5% 市售優酪乳接入滅菌脫脂牛奶三角瓶 (2% skim milk + 0.1% glucose or 0.1% sucrose) 中, 於 37 o C 培養 24 hr 後, 放入 4 o C 冰箱, 進行儲藏一週試驗菌數檢測 : 1. 於無菌操作台內取市售優酪乳進行十倍連續稀釋至 Drop method: 將 MRS plate 劃分五區域, 取 0.1 ml 滴定於 plate 上 ( 做二重複 ), 確定凝固後放置厭氧箱中, 於 37 o C 培養 1 天 (24 hr) 3. 隔日計算菌落數 ph 值測定 : 分別檢測市售優酪乳培養基 ( 接菌前接菌後 ) 培養 24 小時後與儲藏終點之 ph ( 注意 : 樣品取樣皆須於無菌操作臺內進行, 避免汙染!) 五參考資料 : 吳全耀等 (2003), 普通微生物學實驗 ( 第一版 ), 台北 : 九州圖書 (pp ) 六結果與討論 : 1. 脫脂牛奶接種市售優酪乳後,pH 值是否改變? 2. 自製優酪乳發酵 24 小時後, 其外觀 ph 值是否有改變, 請說明原因為何? 3. 自製優酪乳與市售優酪乳之菌數為何? 第 16 頁, 共 17 頁

17 自製優酪乳 ph 變化組別樣品培養基配方一二統一 AB 優酪乳三光泉優酪四乳五養樂多六七林鳳營優八酪乳九統一 LP33 十益敏優多市售優酪乳菌數檢測組別一二樣品統一 AB 優酪乳 2% skim milk + 0.1% glucose 2% skim milk + 0.1% glucose 2% skim milk + 0.1% glucose 2% skim milk + 0.1% glucose 2% skim milk + 0.1% glucose 菌數 - Drop method ph 原樣品接菌前接菌後培養 24 hr 後低溫儲藏後菌濃度總菌數三四光泉優酪乳五六養樂多七八九十林鳳營優酪乳統一 LP33 益敏優多自製優酪乳菌數檢測 ( 發酵 0 小時 ) 組別一二樣品統一 AB 優酪乳菌數 - Drop method 菌濃度總菌數三四光泉優酪乳五六七八九十養樂多林鳳營優酪乳統一 LP33 益敏優多第 17 頁, 共 17 頁

18 一實驗目的 : 實驗十 (W15,12/20) 自製優酪乳儲藏試驗 ( 劃線單離 ) 自製優酪乳, 儲藏一週後, 利用劃線單離培養, 檢測是否有活菌取市售優酪乳之活菌, 接至已滅菌之脫脂牛奶, 發酵終點檢測 ph 值並於儲藏一週後進行劃線單離, 以確認其是否有活菌之存在三器材及藥品 : 接種環 MRS plates 打火機簽字筆酒精燈酒精噴槍 ph meter 四操作步驟 : 自製優酪乳儲藏試驗之樣品檢測 ph 值並進行劃線單離五各組分配 : 每人皆需練習單離一片 agar plate 六結果與討論 : 1. 請說明並記錄自製優酪乳儲藏一週後, 是否仍具有活菌存在? 2. 儲藏一週後, 其外觀型態是否改變? 第 18 頁, 共 17 頁

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