刘芸等灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究 283 已严重限制着中国作物的生产发展和其他植物病原 1.3 抑菌圈法测定灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用菌一样尖孢镰刀菌致病菌株对不同作物及同一作物采用杯碟法 [12] 将灰黄霉素用二甲基亚砜的不同品种表现出致病性差

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慧媚漩盛
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1 2011,27(27): 中国农学通报 Chinese Agricultural Science Bulletin 灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究刘芸 1,2 朱育菁 1,2 陈清西 3 李智聪 3 胡桂萍 2 于晓杰 3 刘波 2 2 福建省农业科学院生物技术研究所福州福建省农业科学院农业生物资源研究所福州厦门大学生命科学学院福建厦门摘要为进一步扩展灰黄霉素的农业应用范畴选择采自甜瓜黄瓜西瓜苦瓜辣椒和西红柿的不同专化型的 10 株致病性尖孢镰刀菌作为试验对象系统研究了灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用分别采用抑菌圈法和抑菌率法测定灰黄霉素对不同寄主来源的尖孢镰刀菌的抑制作用并显微观察灰黄霉素对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响结果表明灰黄霉素对不同寄主来源的尖孢镰刀菌具有良好的广谱抑制作用但对不同菌株抑制效果差异显著其抑制中浓度 IC50 为 0.42~2.81 mm 尖孢镰刀菌经 4 mm 灰黄霉素处理后菌丝变得稀疏畸形膨大扭曲从而影响其生长因此灰黄霉素可用于开发防治作物枯萎病的新型生物农药关键词灰黄霉素尖孢镰刀菌枯萎病中图分类号 S4 文献标志码 A 论文编号 The Study on Antifungal Activity of Griseofulvin Against Fusarium oxysporum Liu Yun1,2, Zhu Yujing1,2, Chen Qingxi3, Li Zhingcong3, Hu Guiping2, Yu Xiaojie3, Liu Bo2 (1Biotechnology Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou ; Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou ; 2 College of Life Science, Xianmen University, Xiamen Fujian ) 3 Abstract: The antifungal activities of greseofulvin against 10 isolates of Fusarium oxysporum, pathogen of crop Fusarium wilt disease were investigated with an aim to extend the application of griseofulvin for controlling the disease. The antifungal activities were determined in a set of inhibition ratio and inhibition ring tests with the ten isolations of F. oxysporum as indicators, which were isolated from oriental melon, cucumber, water melon, pepper and tomato. The effect of griseofulvin on the growth of the isolations was observed under microscopes. The results revealed that 10 isolations presented significantly different but high sensibility to griseofulvin. The halfinhibitory concentration (IC50) values of greseofulvin against the fungi were calculated as mm. Treated with 4 mm griseofulvin, F. oxysporum was found to be induced degenerative changes of hyphal morphology. The study indicated that griseofulvin might be a new promising biological agent or a lead compound for novel antifungal agent for controlling Fusarium wilt disease. Key words: griseofulvin; Fusarium oxysporum; blight 0 引言尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum Schl. 是一种世界性分布的土传病原真菌[1] 寄主范围广泛可引起西瓜香蕉番茄等 100 多种植物发生毁灭性的枯萎病[2] 基金项目福建省自然科学基金灰黄霉素的藕合修饰及其对植物重要真菌病害 2007J0058 第一作者简介刘芸女 1976 年出生福建福州人助理研究员硕士长期从事害虫综合治理生物农药生物防治的研究通信地址福州市五四路 247 号福建省农业科学院农业生物资源研究所 Tel cloundly@yahoo.com.cn 朱育菁女 1972 年出生研究员博士从事农业生物技术研究通信地址福州市五四路 247 号福建省农业科学院农业生物资源研究所 Tel zyjingfz@163.com 通讯作者刘波男 1957 年生福建惠安人研究员博士主要从事生物技术和生物防治研究通信地址福州市五四路 247 号福建省农业科学院 Tel liubofaas@163.com 收稿日期修回日期

2 刘芸等灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究 283 已严重限制着中国作物的生产发展和其他植物病原 1.3 抑菌圈法测定灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用菌一样尖孢镰刀菌致病菌株对不同作物及同一作物采用杯碟法 [12] 将灰黄霉素用二甲基亚砜的不同品种表现出致病性差异具有高度的寄主专化 Dimethyl sulfoxide, 简称 DMSO 分别稀释成性已报道的专化型和小种至少有 120 多个由于病 16 mm 备用取 15 ml 灭菌后的 PDA 培养基置于原菌的多样性和变异性生产上尚缺乏有效的化学防 9 cm 培养皿中作为下层培养基将 10 ml 含有治手段和抗病品种并且高浓度的化学农药易造成环 105 cfu/ml 尖孢镰刀菌的 PDA 培养基均匀覆盖在冷却境污染农药残留等问题 [4] 农用抗生素作为生物农后的下层 PDA 培养基上静置冷却 1 h 而后在每块药的一个重要分支是随着医用抗生素的发展而发展平板上放置 4 个牛津杯直径 0.6 cm 高 1.0 cm 用无起来的它具有高效低毒无残留等优点日益受到菌移液枪头分别向每个牛津杯内加入 100 μl 各浓度 [3] [5] 人们的重视中国已开发的井冈霉素放线菌酮与灰黄霉素水平放置直到药液完全渗透到培养基中庆丰霉素等农用抗生素对某些植物真菌性病害显示出将处理后的平板置于 28±1 培养箱中每个处理 3 良好的防治效果在生产上广泛应用[67] 因此研究开次重复以 DMSO 为对照培养 3 天后用十字形法发针对尖孢镰刀菌的抗生素防治植物枯萎病是一个值测量抑菌圈直径得探索的课题 1.4 抑菌率法测定灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用灰黄霉素是由 Oxford 等从灰黄青霉 Penicillium griseofulvin 培养液中得到的一种含氯代谢产物分子式为 C17H17ClO6 分子量为为白色或类白色结晶性粉末 [8] 它属非多烯类的抗真菌抗生素自 1958 年开始用于临床医学以来已广泛应用于治疗皮肤和角质层真菌感染对红色发癣菌断发癣菌和琉毛发癣菌等具有强烈的抑制作用[9] 随着对灰黄霉素代谢机制的深入研究它的应用范围现已逐步扩大到畜牧业水产用于防治动物真菌性病害 [10] 在防治植物真菌性病害方面苏明星等[11]的初步研究表明灰黄霉素对甜瓜枯萎病原尖孢镰刀菌和豇豆枯萎病原尖孢镰刀菌的生长有明显的抑制作用由于植物病原菌的不同专化型可能对杀菌剂表现出不同的敏感性本研究选择采自甜瓜黄瓜西瓜苦瓜辣椒和番茄的不同专化型的 10 株致病性尖孢镰刀菌作为试验对象系统研究了灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用为进一步扩展灰黄霉素的农业应用范畴实现植物真菌性病害的防治提供依据 1 材料与方法 1.1 试验时间地点室内试验于 2010 年在福建省农业科学院农业生物资源研究所试验室进行 1.2 供试材料供试菌株见表 1 分别为福建省甜瓜黄瓜西瓜苦瓜辣椒和番茄发病植株分离到的尖孢镰刀菌灰黄霉素 CAS % 购自上海新华联制药有限公司尖孢镰刀菌的培养基为马铃薯葡萄糖培养基 PDA 用无菌水将于 PDA 平板上培养 7 天的各供试尖孢镰刀菌菌落刮下后制成孢子悬浮液用无菌水稀释至 cfu/ml 备用将灰黄霉素用 DMSO 分别稀释成 mm 备用接种前将各浓度灰黄霉素分别喷施于 PDA 平板培养基上在无菌操作台内抽风干燥 2 h 而后在培养皿正中央接种 100 μl 尖孢镰刀菌孢子悬浮液 cfu/ml 将处理后的平板置于在 28±1 培养箱中每个处理 3 次重复以 DMSO 为对照培养 7 天后对照组菌丝完全覆盖平板时测定抑菌率 Inhibition rate D Dt 抑菌率 = c 100% Dc Dc 代表对照的菌落直径 Dt 代表经不同浓度灰黄霉素处理的菌落直径 1.5 灰黄霉素对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响取 15 ml 灭菌后的 PDA 培养基置于 9 cm 培养皿中作为下层培养基将 10 ml 含有 105 cfu/ml 尖孢镰刀菌的 PDA 培养基均匀覆盖在冷却后的下层 PDA 培养基上静置冷却 1 h 而后在每块平板上放置 2 个牛津杯分别加入 100 μl 用 DMSO 稀释的灰黄霉素 4 mm 和 DMSO 水平放置直到药液完全渗透到培养基中将处理后的平板置于在 28±1 培养箱中每个处理 3 次重复培养 3 天后收集抑菌圈周边的菌丝置于倒置显微镜 Leica DMI 3000 M 下观察菌丝形态研究灰黄霉素对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响 2 结果与分析 2.1 抑菌圈法测定灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用在抑菌圈试验中灰黄霉素对来自不同寄主的尖孢镰刀菌均表现出良好的抑制作用但不同尖孢镰刀菌菌株对灰黄霉素的敏感性存在显著性差异表 1 灰黄霉素对甜瓜专化型的 FJAT129 和 FJAT130 黄瓜专化型的 FJAT3007 香蕉专化型的 FJAT3071 和

284 中国农学通报 http://www.casb.org.cn FJAT3076 的抑制作用优于其他菌株如灰黄霉素浓 2.2 抑菌率法测定灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用度为 4 10 mm 时对黄瓜专化型 FJAT3007 和香蕉用菌落生长速率法测定了灰黄霉素对 10 种尖孢 6 专化型 FJAT3071 的抑菌圈直径分别为 23.

oxysporum f. sp. niveum FJAT3006 黄瓜 F. oxysporum f. sp. cucumerinum FJAT3007 黄瓜 F. oxysporum f. sp. cucumerinum FJAT3017 苦瓜 F. oxysporum f. sp. momordica FJAT3071 香蕉 F. oxysporum f. sp. cubense FJAT3076 香蕉 F.

3 284 中国农学通报 FJAT3076 的抑制作用优于其他菌株如灰黄霉素浓 2.2 抑菌率法测定灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制作用度为 4 10 mm 时对黄瓜专化型 FJAT3007 和香蕉用菌落生长速率法测定了灰黄霉素对 10 种尖孢 6 专化型 FJAT3071 的抑菌圈直径分别为 23.6 mm 图 1 镰刀菌的抑制率试验结果见表 2 处理 7 天后灰黄和 22.9 mm 图 2 霉素对所有供试的病原菌表现出广谱的抑制作用对表 1 灰黄霉素对尖孢镰刀菌的抑制效果灰黄霉素/mM 菌株编号寄主专化型 FJAT129 甜瓜 F. oxysporum f. sp. melonis FJAT130 甜瓜 F. oxysporum f. sp. melonis FJAT137 西瓜 F. oxysporum f. sp. niveum FJAT3006 黄瓜 F. oxysporum f. sp. cucumerinum FJAT3007 黄瓜 F. oxysporum f. sp. cucumerinum FJAT3017 苦瓜 F. oxysporum f. sp. momordica FJAT3071 香蕉 F. oxysporum f. sp. cubense FJAT3076 香蕉 F. oxysporum f. sp. cubense FJAT9082 辣椒 F. oxysporum f. sp. vasinfectum FJAT9206 西红柿 F. oxysporum f. sp. lycopersici 注以溶剂二甲基亚砜作为阴性对照抑菌圈直径大于24 mm 抑菌圈直径大于20 mm小于24 mm 抑菌圈直径大于16 mm小于20 mm 无抑制效果分别表示灰黄霉素浓度为 mm 分别表示灰黄霉素浓度为 mm 图 1 灰黄霉素对尖孢镰刀菌 FJAT3007 的抑菌效果图 2 灰黄霉素对尖孢镰刀菌 FJAT3071 的抑菌效果表 2 不同浓度灰黄霉素对尖孢镰刀菌生长的抑制率 % 菌株编号专化型 FJAT129 灰黄霉素的浓度/mM IC /mm f. sp. melonis 9.5±2.4f 21.4±3.1g 36.7±0.6e 49.1±2.7cd 55.7±3.0c 2.40 b FJAT130 f. sp. melonis 20.7±6.0cd 30.8±1.9e 42.4±2.6d 51.6±4.0c 55.5±4.7c 2.12 b FJAT137 f. sp. niveum 14.3±1.8ef 27.6±2.6ef 35.9±1.0e 44.8±3.0de 56.4±2.6c 2.58 b FJAT3006 f. sp. cucumerinum 11.5±3.1f 23.9±4.2fg 29.8±1.8f 41.9±2.1e 57.6±4.7c 2.81 b FJAT3007 f. sp. cucumerinum 17.5±2.9de 54.5±1.9a 70.8±2.9c 73.9±2.1a 77.1±2.4a 0.67 a FJAT3017 f. sp. momordica 32.8±2.7b 43.6±1.8b 53.0±2.2c 61.4±4.6b 69.7±2.7b 0.85 a FJAT3071 f. sp. cubense 23.6±4.9c 37.6±2.1cd 54.3±3.2d 62.2±1.3b 71.0±5.0b 1.03 a FJAT3076 f. sp. cubense 29.6±0.9b 35.7±4.2d 46.6± ±3.2b 66.6±1.6b 1.16 a FJAT9082 f. sp. vasinfectum 18.7±0.8cde 42.1±2.2bc 52.8±3.6c 62.0±1.1b 66.8±2.8b 1.13 a FJAT9206 f. sp. lycopersici 43.2±3.5a 52.4±1.4a 60.2±1.8b 65.2±1.7b 67.8±0.1b 0.42 a 注同列数据后标有不同小写字母者表示差异显著 Duncan s P 5%

285 刘芸等灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究菌丝生长的抑制作用与其浓度呈正相关图 3 当浓起的感染其作用机理是由于灰黄霉素的结构与鸟嘌度为 0.25 mm 时灰黄霉素的抑制率为 9.5%~43.2% 呤相似能竞争性抑制鸟嘌呤进入 DNA 分子中干扰当浓度为 4 mm 时抑制率为 55.5%~77.

81 mm 其中灰黄霉素对西红柿专化型的本研究测定了灰黄霉素对甜瓜黄瓜西瓜辣椒 FJAT9206 黄瓜专化型 FJAT3007 和苦瓜专化型的等来源尖孢镰刀菌的抑制作用表明灰黄霉素对尖孢 FJAT3017 的抑制效果最好 IC50 低于 1 mm 镰刀菌表现出广谱抑制作用但是对不同寄主来源 2.

4 285 刘芸等灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究菌丝生长的抑制作用与其浓度呈正相关图 3 当浓起的感染其作用机理是由于灰黄霉素的结构与鸟嘌度为 0.25 mm 时灰黄霉素的抑制率为 9.5%~43.2% 呤相似能竞争性抑制鸟嘌呤进入 DNA 分子中干扰当浓度为 4 mm 时抑制率为 55.5%~77.1% 并且灰黄真菌 DNA 合成而抑制真菌的生长并且它与微管蛋白霉素对不同寄主来源的尖孢镰刀菌的抑制效果存在显结合阻止真菌细胞分裂[9] 近年来的研究发现将灰著性差异 P<0.05 通过抑制中浓度 IC50 的计算表黄霉素作为农业抗生素应用于农业植物保护方面有着明灰黄霉素对不同尖孢镰刀菌的抑制中浓度 IC50 为巨大的潜力 0.42~2.81 mm 其中灰黄霉素对西红柿专化型的本研究测定了灰黄霉素对甜瓜黄瓜西瓜辣椒 FJAT9206 黄瓜专化型 FJAT3007 和苦瓜专化型的等来源尖孢镰刀菌的抑制作用表明灰黄霉素对尖孢 FJAT3017 的抑制效果最好 IC50 低于 1 mm 镰刀菌表现出广谱抑制作用但是对不同寄主来源 2.3 灰黄霉素对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响的尖孢镰刀菌灰黄霉素的抑制作用存在显著差异利用倒置显微镜观察了经灰黄霉素处理的尖孢镰葛慈斌等[4]从土壤中分离得到的芽孢杆菌 JK2 菌株陈刀菌菌丝形态的变化初步研究灰黄霉素的抑菌机理雪丽等[16]从大豆根际分离的多粘类芽孢杆菌 BRF1 和结果见图 4 在 DMSO 处理的对照中供试菌株的菌枯草芽孢杆菌 BRF2 对不同枯萎病的尖孢镰刀菌的抑丝形态皆为纤细均匀细长表面平滑而经 4 mm 灰制作用同样也存在显著差异这可能是由于尖孢镰刀菌黄霉素处理后不同寄主来源尖孢镰刀菌的菌丝均变存在着遗传多态性具有高度的寄主专化性使得种内得稀疏畸形膨大扭曲菌株形态生理和病理等方面存在着多变性和复杂性[3] 3 结论与讨论同时利用倒置显微镜对灰黄霉素抑菌机理的初农用抗生素指由微生物发酵过程中产生的次生代谢产物在低浓度时可抵制或杀灭作物的病虫草害用可能是这种畸变作用造成了尖孢镰刀菌菌丝失活农用抗生素的研究主要从影响了尖孢镰刀菌的生长刘建国等[17]用电镜观察到以下 3 个方面着手 1 大量筛选新的化合物 2 重点经 APS 处理后的菌丝发生顶端膨大分支缩短等异常改造一些医用抗性素的结构以增加用途或提高药效形态变化 APS 是一种由蜡状芽孢杆菌产生的新型抗及调节作物生长发育 [1315] 步研究发现其对尖孢镰刀菌菌丝具有显著的致畸作 3 加强老品种的再开发以拓宽其用途 [5,15] 灰黄霉真菌环状多肽也是农用抗生素中的一种具有广谱抗素早期作为一种有效的医用抗生素治疗皮肤癣菌属引菌性对棉花枯萎病等多种病原真菌具有强烈的抑制 a b c d e 平板 a~e 中灰黄霉素浓度分别为 mm 平板 f 是溶剂 DMSO 对照图 3 灰黄霉素对尖孢镰刀菌甜瓜专化型 FJAT129 生长的影响 f

5 286 中国农学通报 C 为 DMSO 处理对照,T 为经灰黄霉素 (4 mm) 处理后的菌丝生长情况图 4 灰黄霉素对 10 种尖孢镰刀菌菌丝生长的影响 [1819] 作用孔建等的研究同样发现, 枯草芽孢杆菌抗菌物质可使镰刀菌孢子和菌丝畸形, 细胞崩解, 内含物外 [20] 泄, 从而使病菌丧失对植物的侵染能力而蒋细良等的研究发现, 农用抗生素农抗 120 对西瓜枯萎病菌病菌的孢子萌发和菌丝的形态无明显影响, 只是通过抑制病菌孢子形成和菌丝生长而起到防治病害的作用农用抗生素长期以来由于成本和性能问题, 一直发展缓慢随着人类对生态环境和食品安全的日益重视, 加上现代微生物工业化生产技术的日趋完善, 农用抗生素的研究开发已引起广泛重视而灰黄霉素突破了农用抗生素高成本的瓶颈, 中国吴松刚教授于 1973 年分离到灰黄霉素产生菌 (Penicillium Patulum) 野生菌株, 并通过在发酵培养基中提高氯化物浓度, 将含氯灰黄霉素的发酵效价提高了 34.5%, 大大降低生产成

6 刘芸等 : 灰黄霉素对尖孢镰刀菌抑制作用的研究 287 [21] 本现今中国已成为世界上最大唯一的灰黄霉素出口国因此, 开发应用灰黄霉素作为防治作物枯萎病的新型农用抗生素有着良好的发展前景参考文献 [1] Correll J C. The relationship between formae speciales, races, and vegetative compatibility groups in Fusarium oxysporum[j]. Phytopathology, 1991, 81: [2] Booth C.The Genus Fusarium[M].Kew. Surrey, England: Commonwealth Mycological Institute Press,1971. [3] 王政逸, 李德葆. 尖孢镰刀菌的遗传多态性 [J]. 植物病理学报, 2000, 30(3): [4] 葛慈斌, 刘波, 蓝江林, 等. 生防菌 JK2 对尖孢镰刀菌抑制特性的研究 [J]. 福建农业学报, 2009, 24(1): [5] 朱昌雄, 宋渊. 中国农用抗生素的现状与发展趋势探讨 [J]. 中国农业科技导报,2006,8(6):1719. [6] 邱德文. 中国植物病害生物防治的现状及发展策略 [J]. 植物保护, 2010, 36(4): [7] 朱育菁, 于晓杰, 潘志针, 等. 灰黄霉素的研究进展 [J]. 厦门大学学报 : 自然科学版,2010,49(3): [8] Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from grisefulvinintoxicated mice[j].comparative Hepatology, 2004, 3:5. [9] Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Criseofulvin and its uses [J]. Int J Antimicrob Ag, 1996, 6: [10] 李国勤, 孙仁寅. 抗动物皮癣与螨虫病联合缓释剂研制与应用 [J]. 浙江农业学报, 2002, 14(1): [11] 苏明星, 朱育菁, 刘波, 等. 生物杀菌剂松刚霉素对枯萎病病原菌抵制作用的研究 [J]. 武夷科学,2004,20:812. [12] 温志强, 林太礼, 廖朝阳. 三种杀菌剂对木霉菌及食用菌的毒力测定 [J]. 福建农业大学学报,2001,30(1):4852. [13] 李勇, 杨慧敏, 李铭刚, 等. 微生物农药的研究和应用进展 [J]. 贵州农业科学, 2003,31(2): [14] 魏海燕, 蔡磊明, 赵玉艳, 等. 中国微生物农药的应用现状 [J]. 干旱环境监测, 2008, 22(4): [15] 杨丽荣, 全鑫, 刘玉霞, 等. 农用微生物杀菌剂研究进展 [J]. 河南农业科学, 2009(9): [16] 陈雪丽, 王光华, 金剑, 等. 多粘类芽孢杆菌 BRF1 和枯草芽孢杆菌 BRF2 对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果 [J]. 中国生态学业学报, 2008, 16(2): [17] 刘建国, 丛威, 欧阳藩, 等. 新型抗真菌多肽 APS 的抑菌性能研究 [J]. 中国生物防治, 1999, 15(3): [18] 孔建, 赵白鸽, 王文夕. 枯草芽孢杆菌物质对镰刀菌抑制机理的镜下研究 [J]. 植物病理学报, 1998, 28(4): [19] 孔建, 王文夕. 枯草芽孢杆菌 B903 菌株的研究 Ⅰ 对植物病原菌的抵制作用和防治 [J]. 中国生物防治, 1999, 15(4): [20] 蒋细良, 朱昌雄, 谢德龄, 等. 农抗 120 防治西瓜枯萎病的机制 [J]. 植物保护学报, 1998, 25(4): [21] 沈育芬, 吴松刚. 灰黄霉素产生菌耐前体变株 F1012 的选育及其发酵特性 [J]. 亚热带植物通讯, 1994, 23(2): 1925.

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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