110 非常大, 国内外对内生菌的相关研究也越来越 [10] 多小叶榕 (Ficus microcarpa L.f.) 是常绿小乔木, 树冠伞形或圆形, 叶色深绿, 入药主要用其叶小叶榕的叶片含有多种药用成份, 如黄酮三萜类齐墩果酸脂肪族化合物和甾体化合物等, 经证实, 小叶榕水提取物和醇

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炎习
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1 广东农业科学 2018,45(2): Guangdong Agricultural Sciences doi: /j.issn x 邓雪萍, 杨博. 一株小叶榕抗菌内生细菌的分离筛选和鉴定 [J]. 广东农业科学,2018,45(2): 一株小叶榕抗菌内生细菌的分离筛选和鉴定邓雪萍 1, 杨博 2 (1. 清远职业技术学院食品药品学院, 广东清远 ; 2. 华南理工大学生物科学与工程学院, 广东广州 ) 摘要 : 从小叶榕茎段和叶片中分离筛选和鉴定抗菌活性内生细菌, 以开发生物防治菌剂采用组织块法和组织匀浆法分离内生菌, 杯碟法和菌落生长速率法检测内生细菌的抗菌活性, 通过培养特征和菌体形态观察生理生化特性试验 16S rdna 序列测定和系统发育树的构建鉴定内生菌结果表明, 从小叶榕植物样本中分离得到的一株内生细菌 QYPT-B01 的发酵滤液对铜绿假单胞菌大肠埃希菌和黑曲霉有较强的抑制作用, 经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis), 今后可进一步研究该内生菌发酵液中活性物质的组分及对植物病原菌的拮抗作用关键词 : 内生细菌 ; 抗菌活性 ; 筛选 ; 鉴定 ; 小叶榕中图分类号 :S476.9 文献标识码 :A 文章编号 : X(2018) Separating,screening and identification of an antimicrobial endophytic bacterium from Ficus microphylla L.f. DENG Xue-ping 1,YANG Bo 2 (1.College of Food & Drug,Qingyuan Polytechnic,Qingyuan ,China; 2. College of Bioscience & Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou ,China) Abstract:This study was done to screen and identify the endophytes with antibacterial activity from Ficus microcarpa L.f. in order to develop biocontrol agents. Endophytes were isolated by tissue block method and tissue homogenate method. The bacteriostatic activity of endophytic bacteria was determined by cup dish method and colony growth rate method. Identifing the endophytic bacteria through the strain characteristics and bacteria morphology observation,physiological and biochemical characteristic test,determination of 16S rdna gene sequences,and construction of phylogenetic tree. The results showed that one of the endophytes named QYPT-B01 had antibacterial activity. The fermentation filtrate of strain QYPT-B01 had strong bacteriostatic effect on Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Aspergillus niger. The composition of active substances in fermentation broth and its antagonistic effect on plant pathogenic bacteria could be further studied in the future. Key words:endophytic bacteria;antibacterial activity;screening;identification;ficus microcarpalla L.f. 在健康植物组织内部通常生存着一些微生物, 但不会导致宿主植物有明显的感染症状, [1] 称为植物内生菌有研究报道, 植物的根茎叶花果实和种子经过表面消毒后, 均能分离到内生菌植物内生菌能产生种类多样的活性成分, 经证实, 这些活性成分大多为抗肿 [2-3] [4-5] 瘤活性类抗菌类活性类抗糖尿病物 [2] [6-7] [8] 质类活性酶类抗氧化活性类杀 [9-10] [11] 虫活性类促植物生长类等因此, 内生菌在生物防治医药卫生等领域的应用潜力收稿日期 : 基金项目 : 清远职业技术学院科学技术研究项目 (ZK12006) 作者简介 : 邓雪萍 (1973-), 女, 硕士, 讲师, 工程师,E-mial:dengxueping73@163.com

2 110 非常大, 国内外对内生菌的相关研究也越来越 [10] 多小叶榕 (Ficus microcarpa L.f.) 是常绿小乔木, 树冠伞形或圆形, 叶色深绿, 入药主要用其叶小叶榕的叶片含有多种药用成份, 如黄酮三萜类齐墩果酸脂肪族化合物和甾体化合物等, 经证实, 小叶榕水提取物和醇提取物有止咳平喘作用, 对治疗心血管疾病抗炎抑菌等方 [12] 面都有显著效果目前, 还没查询到国内外对小叶榕内生菌的相关研究资料本试验从清远职业技术学院校内种植的小叶榕中分离纯化内生菌, 并筛选抗菌活性菌株, 鉴定到菌种, 为寻找天然抗菌物质提供有用资源 1 材料与方法 1.1 试验材料植物样本 : 选取清远职业技术学院校内种植的小叶榕的不同植株, 采集健康的茎和叶片培养基 : 营养琼脂 ( N A ), 营养肉汤 ( N B ), 高氏一号培养基, 马铃薯葡萄糖 (PDA) 培养基, 发酵培养基 (1% 葡萄糖 2% 酵母粉 0.3% 磷酸氢二钾 0.05% 氯化钠,pH 7.0) 筛选指示菌 : 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilus) 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 大肠埃希菌 (Escherichia coli) 白色念珠菌 (Candida albicans) 黑曲霉 (Aspergillus niger), 均由清远职业技术学院应用微生物研究所提供 1.2 试验方法小叶榕内生菌的分离纯化用无菌剪刀剪取植株顶端健康的茎段和嫩叶, 用干净的保鲜袋装好, 立即进行下述处理 ( 如不能立即处理, 则将样本置于 4 冰箱中 1 周内处理 ): 茎段和叶片均采用 75% 酒精 -0.1% 升汞法表面消毒, 印迹法和最终洗涤水法相结合检验消毒效果分离内生菌时, 茎段采用组织块法, 叶片采 [13] 用组织匀浆法, 具体操作见图 1~ 图 3, 所有操作均为无菌操作对照平板 7 d 内有菌生长或分离平板在 7 d 内无菌生长, 均判定表面消毒无效 ; 对照平板 7 d 内无菌生长且分离平板在 7 d 内有菌生长, 则判定表面消毒有效逐日观察对照平板和分离平板, 一旦发现培养基中有菌长出, 及时分离纯化到对应培养基,28(±1) ( 内生真菌 ) 或 36(±1) ( 内生细菌 ) 培养 3~7 d 重复以上步骤, 直至分离到纯培养物剪取长约 3 cm 的茎段自来水洗涤干净无菌水冲洗 3 次 75% 酒精浸泡 1~1.5 min 剪去茎的两端和韧皮部无菌水冲洗 4 次 0.1% 升汞浸泡 1~1.5 min 无菌水冲洗 3 次剪成 3 段种植在 3 种分离平板上 28(±1) 培养 14 d 图 1 茎段内生菌分离步骤称取叶片 1 g 自来水洗涤干净无菌水冲洗 3 次 75% 酒精浸泡 1.5~2.0 min 置于装有 10 ml 无菌生理盐水的灭菌研体, 研碎无菌水冲洗 4 次 0.1% 升汞浸泡 1.5 min 无菌水冲洗 3 次静置 15 min, 吸取 200 μl 上清液涂布在 3 种分离平板上 28(±1) 培养 14 d 图 2 叶片内生菌分离步骤

3 111 吸取最后一次洗涤涂布在 3 种再分别种植经上述处理的茎 28(±1) 水 20 μl 分离平板上段或叶片 ( 茎段过火消毒 ) 培养 14 d 图 3 对照平板制备流程抗菌活性内生菌的筛选发酵滤液的制备 : 内生菌解冻复苏后, 取 5 环到 5 ml 无菌生理盐水制备菌悬液, 按 1% 的接种量接入发酵培养基, 在 34(±1) 160 r/min 摇床中培养 72 h 发酵液 r/min 离心 10 min, 上清液用 0.45 μm 的无菌微孔滤膜过滤除菌后得发酵滤 [13-15] 液, 用作抑菌试验,3 次重复 ( 本试验只对分离得到的两株内生细菌进行抗菌活性筛选 ) 杯碟法检测发酵滤液抗细菌抗酵母菌活性 : 将指示菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌接种于 NA 平板,36 (±1) 培养 24 h; 白色念珠菌接种于 PDA 平板,28(±1) 培养 48 h 选取单菌落混悬于灭菌生理盐水, 使指示菌液最终浊度与 0.5 号麦氏标准比浊管相同, 此时菌悬液中菌数大概为 CFU/mL [13,16] 在平板上均匀涂布指示菌液,5 min 后用无菌镊子夹取无菌牛津杯放入平板上, 每块平板可放 3~4 个牛津杯, 牛津杯之间的距离相等牛津杯内加入 200 μl 发酵滤液, 盖上皿盖, 用无菌生理盐水做对照以上均在 28(±1) 暗处培养 48 h, 培养完毕, 取出牛津杯, 测量抑菌圈直径菌落生长速率法检测发酵滤液抗丝状真菌活性 : 黑曲霉为指示菌, 将 1 ml 发酵滤液加入到无菌培养皿中, 倒入 9 ml 已冷却至 40 左右的 PDA 培养基, 充分摇匀, 冷却后, 将直径 6 mm 28(±1) 培养 48 h 的黑曲霉菌块接种于该平板中央, 盖上皿盖, 以不加发酵滤液的 10 ml PDA 培养基作为对照, 试验平板和对照平板均在 28(±1) 暗处培养 3~5 d, 每天用游标卡尺测量菌落直径, 计算内生菌发酵滤液对黑曲霉菌丝生长的抑制率 (%) [17-18] 抗菌活性内生菌的鉴定培养特征菌体形态观察及生理生化特性试验 : 本试验仅对分离得到的抗菌活性内生细菌 QYPT-B01 进行鉴定将内生菌株接种到 NA 斜面 NA 平板 NB 肉汤,34(±1) 培养 2~5 d, 观察内生菌的培养特征, 并进行革兰氏染色芽孢染色和生化反应, 按常见细菌系统鉴定手册 [19] 中的方法进行操作和鉴定 : 抑菌圈直径 0~5 mm 表示无抑制作用,6~15 mm 表示弱抑制作用,> 15 mm 表示强抑制作用 16S rdna 基因序列测定 : 将内生细菌菌株接种到营养肉汤,34(±1) 下 160 r/min 培养至对数生长期后, r/min 离心 5 min, 在菌体沉淀中加入 50 mmol/l Tris-HCl(pH 8.0)800 μl 和 32 μl 溶菌酶, 使溶菌酶最终浓度为 2~4 mg/ml, 振荡均匀 ;37(±1) 保温 30~60 min 至菌液呈牛乳状 ; 加入 65 μl 25%SDS, 颠倒混匀,50~60 水浴 10 min 至溶液完全清亮 ; 加入 200~400 μl 氯仿 - 异戊醇 (24 1) 溶液, 充分振荡混匀, 冰上放置 10 min; r/min 条件下离心 10 min 后, 取上清液 ; 加入 0.7~1 倍体积异丙醇, 颠倒混匀, 将白色絮状沉淀挑出至 70% 乙醇中洗涤两次, 吹干, 溶于适量的超纯水中, 振荡溶解, 置于 -20 冰箱中按上述方法提取基因组 DNA 后, 以其为模板, 设计引物为 P16sF1:5 -AGAGTTTGATCCTGGC TCAGAACGAACGCT-3 ;P16sB1:5 -TACGG CTACCTTGTTACGACTCACCCC-3 PCR 的程序为 :94 预变性 5 min;94 变性 30 s;48 退火 30 s;72 延伸 1.5 min;30 个循环后 72 延伸 10 min,4 保温 PCR 产物以 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测, 切割目标条带, 使用 Roche Applied Science 试剂盒纯化电泳产物 PCR 反应扩增出的 16S rdna 片段经纯化后, 委托上海生工生物工程技术服务公司测序利用 NCBI 网站中的 Blast 工具 ( 将 QYPT-B01 菌株的 16S rdna 序列与 Genbank 中已知细菌的 16S rdna 序列进行比较, 寻找与目的基因序列同源性最高的己知分类地位的菌种, 并得到同源性相似百分比 Matsulci [20] 研究认为, 凡是 16S rdna 可变区序列同源性大于 97.5% 便可认为是同一个种, 所以本试验以同源

4 112 性大于 97.5% 为菌种的鉴定标准, 进一步利用 MGTA 软件构建系统发育树, 确定该菌的分类地位 2 结果与分析 2.1 小叶榕内生菌分离纯化结果从小叶榕植物样本中分离得到 7 株丝状真菌和 2 株细菌将分离得到的 9 株内生菌进行体外培养, 发现有一株丝状真菌不能生长 ( 表 1) 表 1 小叶榕内生菌的分离纯化结果菌株编号取样部位内生菌能否体外种类培养 QYPT-B01 叶细菌能 QYPT-B02 叶细菌能 QYPT-F01 叶丝状真菌能 QYPT-F02 QYPT-F03 QYPT-F04 QYPT-F05 QYPT-F06 QYPT-F07 茎茎茎叶叶叶丝状真菌丝状真菌丝状真菌丝状真菌丝状真菌丝状真菌不能能能能能能 2.2 抗菌活性内生菌筛选结果分离得到的一株小叶榕内生细菌 ( 命名为 QYPT-B01) 发酵滤液对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和大肠埃希菌有较强的抑制作用 ( 图 4, 封三 ; 表 2), 其中对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达 23.28(±0.286)mm, 对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用, 而对枯草芽孢杆菌没有抑制作用 QYPT-B01 菌株发酵滤液对白色念珠菌没有抑制作用, 对黑曲霉的生长有很强的抑制作用 ( 图 5, 封三 ; 表 3), 培养 3 d 后该菌株发酵滤液对黑曲霉菌丝生长的抑制率达 77.25(±0.212)%, 培养 5 d 后抑菌率达 82.39(±0.140)% 在培养过程中, 对照平板黑曲霉菌落厚菌丝多且强壮形成大量黑色孢子, 而试验平板菌落薄菌丝少且纤细没有孢子形成, 培养 4 d 后菌落大小不再有变化试验分离到的另一株内生细菌对 5 种指示菌均无抑制作用表 2 QYPT-B01 菌株发酵滤液对 4 种指示菌的抑菌效果指示菌抑菌圈直径 (mm) 抑菌作用铜绿假单胞菌 23.28±0.286 强大肠埃希菌 16.02±0.297 强金黄色葡萄球菌 8.76±0.191 弱枯草芽孢杆菌 0 无表 3 QYPT-B01 菌株发酵滤液对黑曲霉菌丝生长的抑制效果对照菌落净处理菌落净培养时间抑菌率生长直径生长直径 (d) (%) (mm) (mm) ± ± ± ± ± ± ± ± ± 抗菌活性内生菌鉴定结果培养特征菌体形态观察及生理生化特性试验结果 QYPT-B01 菌株在 34(±1) 培养箱中培养 3 d 后, 在 NA 斜面上其菌苔呈灰白色, 边缘不规则, 向四周扩展, 表面有皱褶干燥不透明 ; 在 NA 平板上其菌落灰白色, 较大, 扁平, 边缘不规则, 菌落向四周扩展明显, 呈树根状, 表面有皱褶干燥不透明 ; 在 NB 肉汤液面形成一层灰白色的菌膜, 培养液仍澄清革兰氏染色呈阳性, 显微镜下观察呈直杆状, 芽孢近中生, 孢子囊不膨大菌株的主要生理生化特征见表 4 结合培养特征形态观察和生理生化特性, 初步鉴定 QYPT-B01 菌株为芽孢杆菌属 S rdna 测序结果 QYPT0-B1 菌株的 16S rdna 经 PCR 扩增, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳对扩增产物分析, 结果见图 6 从图 6 可以看出,QYPT-B01 菌株的 16S rdna 扩增片断长约 1.5 kb, 细菌 16S rdna 的长度一般为 1.550(± 0.200)kp 将 PCR 产物测序, 得到全长为 kp 的 16S rdna 序列该序列与 GenBank 中的细菌 16S rdna 序列比较, 获得同源序列为芽孢杆菌属 (Bacillus) 的 16S rdna 序列, 其相似性达到 98% QYPT-B01 菌株的 16S rdna 序列与

5 113 表 4 内生细菌 QYPT-B01 菌株与枯草芽孢杆菌主要生理生化特征比较项目 QYPT-B01 菌株枯草芽孢杆菌耐盐性 2% 5% 7%NaCl 都能生长 2% 5% 7%NaCl 都能生长过氧化氢酶 +( 有气泡 ) +( 有气泡 ) 甲基红 (M.R) 试验 +( 红色 ) +( 红色 ) 乙酰甲基甲醇 (V.P) 试验 +( 红色 ) +( 红色 ) 淀粉水解试验 +( 有透明圈 ) +( 有透明圈 ) 明胶水解 + + 柠檬酸盐利用 +( 红色 ) +( 红色 ) 丙二酸利用 -( 不利用 ) -( 不利用 ) 吲哚试验 -( 不显红色 ) -( 不显红色 ) 硝酸盐还原成亚硝酸盐 +( 红色 ) +( 红色 ) 葡萄糖发酵试验产酸不产气产酸不产气 M bp 9416 bp 6557 bp 2322 bp 2027 bp 564 bp 1~4:QYPT-B01 菌株的 16S rdna 扩增片段, M:Marker 图 6 QYPT-B01 菌株 16S rdna 的 PCR 扩增结果 66 株枯草芽孢杆菌 16S rdna 序列的相似性也达 98%( 表 5) 基于 QYPT-B01 菌株和芽孢杆菌属的 10 个模式菌株的 16S rdna 序列, 利用 MEGA 软件中的 Neighbor-Joining 方法构建系统发育树,1 000 次随机抽样, 计算自引导值 (Bootstrap) 以评估系统进化树的置信度从建立的系统发育树 ( 图 7) 可以看出,QYPT- B01 和枯草芽孢杆菌的进化距离最靠近结合培养特征形态观察和生理生化特性, 最终鉴定内生细菌 QYPT-B01 为枯草芽孢杆菌 3 结论与讨论从小叶榕植物样本中分离得到 7 株丝状真菌和 2 株细菌, 将分离得到的 9 株内生菌进行体外培养, 发现有一株丝状真菌不能生长可能是由于某些内生菌的生长需要依赖宿主植物提供的环境条件, 所以在普通培养基上难以生长, 需进一步研究适合其生长的植物体外培养条件对分离得到的两株内生细菌进行初筛, 发现 QYPT-B01 菌株发酵培养 72 h, 其发酵滤液对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌有较强的抑制作用, 抑菌试验平板培养 48 h, 对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达 23.28(±0.286)mm, 对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱 QYPT-B01 菌株发酵滤液对黑曲霉菌丝的生长有很强的抑制作用, 试验平板培养 5 d 后抑菌率达 82.39(± 0.140)% 综上所述, 小叶榕 QYPT-B01 菌株能产生主要针对革兰氏阴性菌和丝状真菌的抗菌活性物质, 具有潜在的应用价值对抗菌能力较强的内生细菌 QYPT-B01 菌株进行了培养特征和菌体形态观察生理生化特性试验 16S rdna 基因序列测定和系统发育树的构建, 最终鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)

6 114 表 5 QYPT-B01 菌株与 6 株枯草芽孢杆菌的 16S rrna 基因同源性比较登记号比对序列匹配分值总体分值序列相似性 GU GU GQ GU GU FJ 枯草芽孢杆菌 CP-56 菌株的 16S rrna 基因部分序列枯草芽孢杆菌 AF0907 菌株的 16S rrna 基因部分序列枯草芽孢杆菌 LZHC10 菌株的 16S rrna 基因部分序列枯草芽孢杆菌 DBT3ST1 菌株的 16S rrna 基因部分序列枯草芽孢杆菌 DB-2 菌株的 16S rrna 基因部分序列枯草芽孢杆菌 EIV-23 菌株的 16S rrna 基因部分序列 % % % % % % Bacillus cereus Bacillus licheniformis 82 Bacillus subtilis 98 Bacillus amyloliquefaciens 49 Bacillus vallismortis 100 Bacillus anthracis Bacillus thuringiensis 36 Bacillus circulans 69 Bacillus coagulans Bacillus alcalophilus 图 7 QYPT-B01 菌株在 Bacillus 属中的系统发育地位小叶榕由于易生长, 遮阴效果好, 所以分布十分广泛, 也是街道公园绿地公路企事业单位常用的园林景观植物但是受气候栽培因素等影响, 小叶榕极易发生病虫害, 如槐尺蛾刺蛾灰白蚕蛾榕木虱榕管蓟马叶斑 [21] 病煤污病炭疽病等传统的治疗方法有合理密植科学修剪化学药剂喷注和生物防治 [22] 等方法, 目前主要是用化学药剂喷雾法从保护生态环境和可持续发展的角度看, 生物防治是最好的防治方法, 对人畜植物均安全, 主要包括保护有益天敌和使用生物农药两种措施小叶榕内生菌 QYPT-B01 是枯草芽孢杆菌, 具有防治植物病害的作用, 国内外已经成功研 [23-24] 制出一批枯草芽孢杆菌菌剂国内已开发并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有麦丰宁百抗纹曲宁依天得亚宝等 QYPT-B01 内生菌能产生抑菌活性物质, 今后可进一步研究该活性代谢产物对植物病原菌的拮抗作用, 以开发具生防作用的微生物菌剂植物与动物和人类一样, 均属于真核系统, 而内生菌能寄生在植物体内, 说明内生菌产生的活性物质毒性较低或无毒, 否则宿主组织会受损伤甚至死亡, 可见, 植物本身已对活性成分进行了初筛, 利用 QYPT-B01 内生菌作为生防菌剂的来源优势明显, 具有良好的应用前景综上可知, 今后可进一步研究 QYPT-B01 菌株发酵液中活性物质的组分及其对植物病原菌的拮抗作用, 以进一步开发生物防治菌剂参考文献 : [1] 李军, 李白, 高广春. 药用植物内生菌抑菌作用研究进展 [J]. 浙江农业科学,2017,59(11): [2] 陈雪英, 都晓伟, 李滨. 内生菌与药用植物活性成分相关性研究进展 [J]. 国外医药植物药分册,2008,23(2): [3] 代金霞, 杜晓宁. 宁夏枸杞内生菌的抗菌和抗肿瘤活性研究 [J]. 中国中药杂志,2017,42 (11): [4] 陈至里, 沈娟, 王影姣, 等. 美洲大蠊肠道内生细菌的分离及其初步抑菌活性研究 [J]. 生物学通报,2016,51(11): [5] 邓振山, 魏婷婷, 苏瑞, 等. 一株具有抑菌活

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第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖