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灸团亥
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1 1488 南方医科大学学报 J South Med Univ 2011;31(9) 基础研究子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究杨新园 1 王伟 2 陈葳 3 李旭1 2 西安交通大学医学院第一附属医院 1 妇产科麻醉科 3 检验科陕西西安摘要目的研究子宫内膜基质干细胞在特定培养条件下向成骨及成软骨细胞分化探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性方法取 15 例因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的内膜组织磁珠分选法获得子宫内膜基质干细胞用成骨诱导和成软骨诱导培养基诱导组织化学染色检测其向成骨和成软骨细胞分化的情况结果从人子宫内膜组织中培养出基质干细胞能稳定增殖传代在成骨诱导培养基诱导下子宫内膜基质干细胞茜素红染色出现钙结节成软骨诱导培养基诱导下阿利新兰染色呈阳性结论从子宫内膜组织中可获得具有多向分化潜能的基质干细胞并能在体外稳定增殖传代经诱导后可分化为成骨细胞和成软骨细胞有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一关键词子宫内膜干细胞成骨分化成软骨分化中图分类号 R329.2 文献标志码文章编号 Induced differentiation of endometrial stromal stem cells into osteoblast and chondroblasts YNG Xin-yuan1, WNG Wei2, HEN Wei3, LI Xu1 Department of Gynecology and Obstetrics, 2Department of nesthesiology, 3Department of linical Laboratory, First ffiliated 1 Hospital, Xi'an Jiaotong University ollege of Medicine, Xi'an , hina bstract: Objective To investigate the capacity of human endometrial stromal stem cells for differentiation into osteoblasts and chondroblasts and their potential as seeding cells in bone tissue engineering. Methods Human endometrial stromal stem cells were obtained from hysterectomy tissues from 15 women during normal menstrual cycles and induced to differentiate into osteoblasts and chondroblasts. The differentiated cells were examined with cytochemistry. Results population of endometrial stromal stem cells was successfully isolated from human endometrial tissue and showed stable proliferation in vitro. fter treatment with osteoblast and chondroblast revulsant, the endometrial stromal stem cells differentiated towards osteoblasts were verified by positive staining with alizarin red and towards chondroblasts by positive staining with lcian blue. onclusion Endometrial stromal stem cells obtained from human endometrial tissue with multilineage potential can differentiate into osteoblasts and chondroblasts in vitro, and may serve as candidate autogenous seeding cells for bone tissue engineering. Key words: endometrium; stem cell; osteogenic differentiation; chondrogenic differentiation 干细胞是一类具有无限自我更新能力的细胞干细养体系及定向成骨及成软骨诱导的方法为骨组织工程胞可进行多次连续的自我更新式的细胞分裂起源于研究提供新的种子细胞并为子宫内膜基质干细胞的应单一干细胞的子细胞可以分化出超过一种以上的细胞用提供理论依据类型并具有能够在生物体内重建原来组织的功能 1 han 等 2 在人子宫内膜中成功分离获得子宫内膜间充 1 材料与方法质干细胞并命名为人子宫内膜基质干细胞本研究通 1.1 材料过对人的子宫内膜基质干细胞分离获取和诱导培养观察其定向分化潜能以期建立子宫内膜基质干细胞的培 DMEM/F12 胎牛血清购自 Hyclone 公司胶原酶 Ⅲ 免疫磁珠 EpM 免疫磁珠 D45 胰岛素 β-甘油磷酸钠地塞米松抗坏血酸转化生长因子β1均购自为收稿日期 Sigma公司胰蛋白酶等购自Gibco公司基金项目国家自然科学基金方法 Supported by National Natural Science Foundation of hina 作者简介杨新园在读博士研究生主治医师 xinyuan@stu.xjtu 子宫内膜组织的取材留取 15 例子宫内膜样本 edu.cn 患者年龄 31~49 岁因子宫肌瘤行全子宫切除术手术通讯作者李旭教授博士生导师前3个月未服用激素类药物组织学诊断未发现子宫内

第9期杨新园,等.子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究 1489 膜有病理性改变标本均经本人及家属知情同意后获细胞低密度接种于 60 mm 培养皿上接种密度 300~ 得在无菌条件下取内膜组织标本为子宫内膜全层+ 500 /cm2 基质细胞 6~7 d 换液 1 次培养 15 d 后选取子宫肌层5 mm 取材远离病变部位放入冰浴 DMEM/ 形成的大克隆用0.

1 μmol/l 地塞米松 10 mmol/l β- 甘油 37 恒温水浴摇床 150 r/min 消化每 15 min 吸取细磷酸钠 50 mg/l 抗坏血酸诱导分化培养 3 周每 72 h 胞悬液显微镜检 1 次大约 45~60 min 后加入 DMEM/ 换液1次 F-12/5%NS终止消化用40 μm滤网过滤收集滤液 1.2.5 子宫内膜基质干细胞的成软骨诱导培养取 3 代 10 ml DMEM/F-12/5% NS 重悬细胞 2.

25 mg/l胰岛素 10 μg/l转化生长以去除红细胞用抗-PTPR D45 的磁珠分离弃掉血因子β1 50 μmol/l维生素每3 d进行换液细胞调整细胞浓度为 1 10 /ml 取细胞悬液 80 μl 加 1.2.6 茜素红染色成骨诱导 3 周的细胞 4%多聚甲醛 8 入标记有羊抗鼠EpM抗体的免疫磁珠20 μl 混匀后置于 4 冰箱中孵育 15 min 加 2 ml PS

2 第9期杨新园,等.子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究 1489 膜有病理性改变标本均经本人及家属知情同意后获细胞低密度接种于 60 mm 培养皿上接种密度 300~ 得在无菌条件下取内膜组织标本为子宫内膜全层+ 500 /cm2 基质细胞 6~7 d 换液 1 次培养 15 d 后选取子宫肌层5 mm 取材远离病变部位放入冰浴 DMEM/ 形成的大克隆用0.025%胰酶消化和克隆环获取传代 F-12/5%NS培养液中低温条件下迅速转移到实验室培养进行分离培养子宫内膜基质干细胞的成骨诱导培养取第 3 代子宫内膜基质细胞的培养无菌操作将内膜组织细胞1 105/cm接种于24孔板待80%融合时吸去完全用PS冲洗3次小心刮取子宫内膜剪碎成约1 mm3小培养基加入成骨诱导培养液 DMEM/ F-12/ 10%NS 块加入胶原酶Ⅲ 300 μg/ml +DN酶I 40 μg/ml 置基础培养液加0.1 μmol/l 地塞米松 10 mmol/l β- 甘油 37 恒温水浴摇床 150 r/min 消化每 15 min 吸取细磷酸钠 50 mg/l 抗坏血酸诱导分化培养 3 周每 72 h 胞悬液显微镜检 1 次大约 45~60 min 后加入 DMEM/ 换液1次 F-12/5%NS终止消化用40 μm滤网过滤收集滤液子宫内膜基质干细胞的成软骨诱导培养取 3 代 10 ml DMEM/F-12/5% NS 重悬细胞 2.5 ml Ficoll- 细胞1 105/cm接种于24孔板待80%融合时吸去完全 Paque 390 g 离心 8~10 min 之后将子宫内膜细胞从其培养基加入成软骨诱导培养液 DMEM/ F-12/10% 表面移去 PS 冲洗 1 ml DMEM/F-12/1%NS 重悬 NS基础培养液加6.25 mg/l胰岛素 10 μg/l转化生长以去除红细胞用抗-PTPR D45 的磁珠分离弃掉血因子β1 50 μmol/l维生素每3 d进行换液细胞调整细胞浓度为 1 10 /ml 取细胞悬液 80 μl 加茜素红染色成骨诱导 3 周的细胞 4%多聚甲醛 8 入标记有羊抗鼠EpM抗体的免疫磁珠20 μl 混匀后置于 4 冰箱中孵育 15 min 加 2 ml PS 300 r/min 固定 15 min PS 洗涤 3 次加入 1%茜素红溶液 37 染色30 min 蒸馏水洗去多余染料晾干后甘油明胶封离心 10 min 小心吸去上清用 500 μl PS 重悬细胞片镜检将分离仪上分离得到的EpM- 的基质细胞加入培养阿利新兰染色细胞爬片经蒸馏水冲洗3遍加入液置于37 体积分数为5% O2条件下培养 24 h 后更换培养液 SP 法鉴定人子宫内膜基质细胞在24孔培养板中 0.1 mm/l 盐酸反应 5 min 冲洗后加入阿利新兰染料室温下染色6 h 蒸馏水洗去多余染料晾干后甘油明胶封片镜检培养好细胞后吸除培养基 PS 轻洗 3 次 95%酒精室温固定 10 min PS 轻洗细胞 3 次 0.25%TritonX 结果打孔 3%过氧化氢溶液浸泡 10 min PS 洗 3 次滴入 2.1 子宫内膜基质细胞的形态观察 5%羊血清室温10 min吸弃孔上的羊血清直接加入已子宫内膜基质细胞种植 2 h 后细胞开始贴壁 12 h 稀释的一抗 Vimentin 稀释 4 过夜将一抗吸内大部分细胞贴壁倒置显微镜下观察子宫基质细胞多箱中 30 min PS 洗 5 次加入 SP 后放 30 min 用 PS 生长特点细胞排列成漩涡状放射状或似栅栏状子洗5 次加入D显色复染脱水透明封片宫基质细胞Vimentin免疫细胞化学染色阳性图1 弃并用PS洗5次加入已稀释的二抗后放入37 恒温呈梭形不规则三角形核为卵圆形位于胞质的中央子宫内膜基质干细胞的获取将纯化分离的基质图 1 子宫内膜基质细胞的形态观察 : 倒置显微镜下观察子宫基质细胞形态 40 ; : 子宫内膜基质细胞 Vimentin 免疫细胞化学染色阳性 : 100 : 200 Fig.1 Human endometrial stromal cells cultured for 15 days.

1490 南方医科大学学报 J South Med Univ 第 31 卷 2.

基质细胞平板克隆小克隆 40 大克隆 40 D 小克隆 100 E 大克隆 100 Fig.

cells seeded at the clonal density and cultured

3 子宫内膜基质干细胞成骨诱导培养的形态观察经成骨诱导培养 2 d 后细胞呈多中心放射状排

而周围细胞仍呈长梭形显细胞质内颗粒状物质增多有些细胞团的中央可见状诱导后第3~7天

3 1490 南方医科大学学报 J South Med Univ 第 31 卷 2.2 子宫内膜基质干细胞的培养将细胞低密度接种于培养板上可形成散在分布的宫内膜干细胞小克隆小克隆多它主要是由一些低集落集落形成>50 个细胞包含两种克隆图 2 大更成熟的集落形成单位由短暂扩充细胞产生的是短克隆含>4000 个细胞的大克隆数目少其中含有高核暂增殖细胞其排列松散核质比率疏松连接的大细胞组成这些细胞可能是一些质比率的小细胞紧密聚集而成这些细胞被认为是子 D E 图 2 子宫内膜基质细胞的克隆培养基质细胞平板克隆小克隆 40 大克隆 40 D 小克隆 100 E 大克隆 100 Fig.2 olonies formed by human endometrial stromal cells seeded at the clonal density and cultured for 15 days. 2.3 子宫内膜基质干细胞成骨诱导培养的形态观察经成骨诱导培养 2 d 后细胞呈多中心放射状排细胞质丰富细胞器发达细胞核增大核仁增多诱导列位于中心的细胞体积增大而周围细胞仍呈长梭形显细胞质内颗粒状物质增多有些细胞团的中央可见状诱导后第3~7天倒置显微镜下观察其形态由梭形棕色物质茜素红染色可见钙结节图3 7 d 细胞体积增大更明显扁平突起变短细胞增殖明转变为卵圆形或多角形细胞形态均一体积明显增大图 3 子宫内膜基质干细胞成骨能力检测 : 成骨诱导 3 周 100 : 茜素红染色有钙结节形成 200 : 茜素红染色有钙结节形成 100 Fig.3 Osteogenic differentiation of human endometrial stromal stem cells.

周 100 : 阿尔辛蓝染色 100 : 阿尔辛蓝染色 200 Fig.4 hondrogenic differentiation of human endometrial stromal stem cells.

但却因伦理道德的细胞流式细胞仪分离法是根据细胞表面的一些特种族观念可取数量有限增加患者痛苦及潜在的免疫殊标志来分离备选干细胞贴壁筛选法获取细胞操作排斥反应等而影响其应用前景因此有必要探索新的简单快捷但纯度小流式细胞仪分离法对实验条件要组织工程种子细胞来源多年前就有学者提出假说认求高价格昂贵对细胞影响大操作复杂而应用较少为子宫内膜存在干/祖细胞

4 杨新园,等.子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究第9期 2.4 子宫内膜基质干细胞成软骨诱导培养的形态观察单个细胞形态无明显变化随诱导时间延长在细胞密度较大处细胞群逐渐聚集诱导7 d后即可在聚集 1491 时达到高峰成软骨诱导阿尔辛蓝染色阳性诱导细胞可分泌中性及酸性黏多糖成分其中有较多软骨细胞所特有的酸性糖蛋白基质图4 细胞的表面看到微黄色的物质积累量逐渐增多 14 d 图 4 子宫内膜基质干细胞成软骨能力检测 : 成软骨诱导 3 周 100 : 阿尔辛蓝染色 100 : 阿尔辛蓝染色 200 Fig.4 hondrogenic differentiation of human endometrial stromal stem cells. 3 讨论膜基质干细胞的方法主要有贴壁筛选法流式细胞仪组织工程技术是解决组织缺损最理想的途径而其分离法和免疫磁珠法三种贴壁筛选法是根据子宫内中种子细胞的来源及其稳定扩增和细胞支架的选材问膜基质干细胞的底物黏附特性来实现分离的通过培养题仍未很好地解决从理论上讲胚胎干细胞和骨髓基基的不断更换及平衡盐溶液的漂洗洗去悬浮的不贴壁质干细胞是种子细胞的最佳来源 3-4 但却因伦理道德的细胞流式细胞仪分离法是根据细胞表面的一些特种族观念可取数量有限增加患者痛苦及潜在的免疫殊标志来分离备选干细胞贴壁筛选法获取细胞操作排斥反应等而影响其应用前景因此有必要探索新的简单快捷但纯度小流式细胞仪分离法对实验条件要组织工程种子细胞来源多年前就有学者提出假说认求高价格昂贵对细胞影响大操作复杂而应用较少为子宫内膜存在干/祖细胞是来自于胚胎发育时期中本实验选择了较为经典的免疫磁珠法取得了满意效肾管残留下来的位于子宫内膜基底层的少量的未分果在原代培养物中除了外形呈成纤维细胞样的子宫化细胞这种细胞随激素的周期性变化而不断增殖分内膜基质干细胞外可能还混杂着其他细胞研究中应化形成月经周期中不断生长的子宫内膜但这一假说用Vimentin染色分析细胞类型结果表明细胞是基质细一直没有得到证实后来 han 等将纯化的子宫内膜胞同时通过克隆培养进一步获取子宫内膜基质干细上皮和基质细胞进行体外培养 0.22±0.07 % 的上皮胞克隆培养14 d左右可见有数个细胞大集落散在分细胞和 1.25±0.18 %的基质细胞能形成>50 个细胞的布于培养皿底部挑取大克隆细胞进行后续实验本克隆其中少数细胞能形成含 4000 个细胞以上的大克实验发现虽然子宫内膜干细胞具有较强的增殖潜能但隆这些细胞进行30~32次群体倍增后才静止或向成熟是在传代二十多代后细胞出现衰老现象增殖速度减细胞分化 Schwab 等随后又证实增生期分泌期和慢失去光泽贴壁能力减弱因此实验时取第二或第非活动性子宫内膜细胞的克隆形成比率无显著差异提三代的子宫内膜基质干细胞进行诱导分化是非常必要示子宫内膜组织中确实存在着数目极少的而又拥有强的大增殖潜能的子宫内膜干细胞新近研究发现子宫内本实验成功的诱导内膜基质干细胞分化为成骨细膜组织中 EpM+的上皮细胞和 EpM-的基质细胞和成软骨细胞因为只有干细胞才有多向分化的特胞经克隆培养后具有形成大克隆能力且有较强的增殖性故诱导实验也可作为内膜基质干细胞鉴定的一条间能力和分化潜能认为是子宫内膜干细胞但到目前为接途径进一步验证内膜基质干细胞的多向组织分化潜止尚没有发现子宫内膜基质干细胞的特异性标志对能经成骨诱导培养基地塞米松 β2甘油磷酸钠和抗其进行鉴定较为困难 7-10 子宫内膜基质干细胞具有贴坏血酸诱导分化 3 周茜素红染色可见细胞团中央有壁生长的特性在体外易于分离扩增用于分离子宫内钙化结节形成主要含磷酸钙碳酸钙表明内膜基质

5 1492 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第 31 卷干细胞经诱导培养后具有成骨细胞的生物学特性同时, 经成软骨诱导培养基 ( 胰岛素转化生长因子 β1 维生素 ) 培养 3 周, 倒置显微镜下在聚集细胞的表面看到微黄色的物质积累, 阿辛蓝染色阳性, 证实细胞中含中性及酸性黏多糖成分在特定诱导条件下, 内膜基质干细胞不仅能够向成骨细胞分化, 而且还能向软骨细胞分化, 具有多向分化潜能内膜基质干细胞传至第 15 代后仍具较强向骨细胞及软骨细胞定向分化的能力, 而骨髓来源的间充质干细胞 (MSs) 在传代 3 次后其多向分化的能力即大大减弱, 提示内膜基质干细胞在多向分化方面较 MSs 有更好的潜能, 可能成为整形外科组织工程生物填充材料的种子细胞参考文献 : [1] Rao MS, Mattson MP. Stem cells and aging: expanding the possibilities[j]. Mech geing Dev, 2001, 122: [2] han RW, Schwab KE, Gargett E, et al. lonogenicity of human endometrial epithelial and stromal cells[j]. iol Reprod, 2004, 70: [3] Strem M, Hicok K, Zhu M, et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells[j]. Keio J Med, 2005, 54 (3): [4] Lee RH, Kim, hoi I, et al. haracterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bonemarrow and adipose tissue[j]. ell Physiol iochem, 2004, 14(4-6): [5] Schwab KE, han RW, Gargett E. Putative stem cell activity of human endometrial epithelial and stromal cells during the menstrual cycle[j]. Fertil Steril, 2005, 84: [6] Schwab KE, Gargett E. o-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from human endometrium[j]. Hum Reprod, 2007, 22: [7] Gargett E. Uterine stem cells: what is the evidence[j]? Hum Reprod Update, 2007, 13: [8] Schwab KE, Hutchinson P, Gargett E, et al. Identification of surface markers for prospective isolation of human endometrial stromal colony-forming cells[j]. Hum Reprod, 2008, 23: [9] Gargett E. Identification and characterisation of human endometrial stem/progenitor cells[j]. ust N Z J Obstet Gynaecol, 2006, 46: [10]Tsuji S, Yoshimoto M, Takahashi K, et al. Side population cells contribute to the genesis of human endometrium[j]. Fertil Steril, 2008, 90: ( 编辑 : 黄开颜 )

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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