464 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 CD34,CD45andCK,butstronglyexpresCD73,CD90,HLA I.CKwasfoundnegativeforstemcels inimmunocytochemistrydetection,whilevimfo

Size: px

Start display at page:

Download "464 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 CD34,CD45andCK,butstronglyexpresCD73,CD90,HLA I.CKwasfoundnegativeforstemcels inimmunocytochemistrydetection,whilevimfo"

居树齐
5 years ago
Views:

1 第 35 卷第 5 期暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) Vol.35 No 年 10 月 JournalofJinanUniversity(NaturalScience&MedicineEdition) Oct 人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究高绿芬, 高雪松, 麦浩山, 张翼婷, 施重任, 宋泓, 杨一, 田雨可 ( 暨南大学第一附属医院妇产科, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨早孕蜕膜组织分离子宫内膜间质干细胞及子宫内膜间质干细胞向子宫内膜分化的方法. 方法 : 胶原酶 Ⅰ 法消化早孕人流子宫蜕膜组织, 贴壁法分离子宫内膜间质干细胞, 传代纯化至第 2 代, 流式细胞仪检测其表面抗原. 细胞免疫组织化学法检测角蛋白 (CK) 波形蛋白 (VIM) 的表达. 取第 2 代细胞, 接种于 24 孔培养板爬片. 实验分两组 : 单纯培养基组, 细胞因子组即分别加入质量浓度均为 10ng/mLTGF β EGF 与 PDGF BB. 培养至第 6 天, 采用免疫细胞化学法检测子宫内膜上皮标记物 CK18 和间质标记物 VIM 的表达. 结果 : 胶原酶 Ⅰ 酶消化后贴壁培养法能稳定从人早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞 ; 子宫内膜间质干细胞不表达 CD34 CD45 CK, 强表达 CD73 CD90 HLA I; 细胞免疫化学法检测干细胞 CK 阴性,VIM 阳性. 细胞免疫化学染色提示生长因子组 CK 阳性,VIM 阳性, 而对照组 CK 阴性,VIM 阳性. 结论 : 胶原酶法能有效从早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞, 且子宫内膜间质干细胞能向子宫内膜上皮细胞分化. [ 关键词 ] 干细胞 ; 子宫内膜间质干细胞 ; 子宫内膜干细胞 ; 子宫内膜 ; 蜕膜组织 ; 分离 ; 定向分化 [ 中图分类号 ] R711.4 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2014) doi: /j.jdxb First trimesterhumanheciduastromalstem celsdiferentiate intoendometrialepithelialcels GAOLüfen,GAOXuesong,MAIHaoshan,ZHANGYiting,SHIZhongren,SONGHong,YANGYi,TIANYuke (DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAfiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China) [Abstract] Aim:Toexplorethemethodforisolatingthefirst trimesterhumandeciduastromalstem cels,andtoinvestigatethediferentiationofendometrialstromalstemcelsintoendometrialcels.meth ods:first trimesterhumandeciduatisuewasdigestedwithcolagenasei.endometrialstromalstemcels werepurifiedviaceladherence.whenthecelswerepasagedtothesecondgeneration,detectionof surfaceantigenswascariedoutbyusingflowcytometry.immunohistochemicalmethodwasusedtodetect theexpresionofckandvim.thecelsofsecondgenerationwereseededina24 welcultureplate, anddividedintotwogroups:puremedium groupandcytokinegroup(10ng/mltgf β,10ng/ml EGF,and10ng/mLPDGF BBwereadded).Thecelswereculturedforsixdaysandthentheexpres sionofck18andvim weredeterminedbyimmunocytochemistrywithendometrialepithelialmarkersof CK18andstromalmarkersofVIM.Results:Colagenasedigestionandtheadherencemethodstabilized thefirst trimesterhumandeciduastromalstem cels;endometrialstromalstem celsdidnotexpres [ 收稿日期 ] [ 基金项目 ] 暨南大学第一临床医学院科研培育专项基金青年基金 ( ); 暨南大学第二批广东省大学生创新创业训练计划项目 ( ) [ 作者简介 ] 高绿芬 (1981-), 女, 博士, 主治医生, 讲师, 研究方向 : 子宫内膜损失修复等,Tel: ;E mail:freshlucy07@126.com

2 464 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 35 卷 CD34,CD45andCK,butstronglyexpresCD73,CD90,HLA I.CKwasfoundnegativeforstemcels inimmunocytochemistrydetection,whilevimfoundpositive.immunohistochemicalstainingalsorevealed positiveckandvim inthegrowthfactorgroup,butnegativeckandpositivevim inthecontrolgroup. Conclusion:Themethodofcolagenasedigestioncanbeusedforisolationofthefirst trimesterhumande ciduastromalstemcels;endometrialstromalstemcelscandiferentiateintoendometrialepithelialcels. [Keywords] stem cels; endometrialstromalstem cels; endometrialstem cels; first trimester humanhecidua; isolatation; diferentiation 子宫内膜干细胞的来源有 3 种 : 正常子宫内膜, 月经血及蜕膜组织. 正常子宫内膜的获取有创, 而月经血干细胞的研究则较多, 但获取过程较复杂, 且质量参差不齐. 哺乳动物的蜕膜是绒毛侵入诱导子宫内膜间质转化而来的特殊结构. 蜕膜间质细胞 (de cidualstromalcels,dscs) [1] 可以分泌多种细胞因子如 IL 6 IL 8 巨细胞集落因子刺激因子巨噬细胞炎性蛋白 1a 肿瘤坏死因子 a 促炎细胞因子趋化因子及血管生成因子等, 在细胞因子网络的形成中 [2] 起重要作用.Dimitrov 等成功从早孕蜕膜组织中分离出间充质干细胞, 并诱导成骨成脂, 向内皮样细胞分化. 本研究收集人早孕人工流产子宫蜕膜组织, 分离出集群能力更强的子宫内膜间质干细胞, 并探索出体外诱导其向子宫内膜上皮细胞分化的方法. 利用功能强大的 DSCs 细胞, 并成功诱导其子宫内膜上皮细胞分化. 1 材料和方法 1.1 材料 (1) 标本收集经暨南大学附属第一医院伦理委员会批准及患者本人知情同意,2012 年 6 月至 2013 年 6 月于暨南大学附属第一医院妇产科门诊手术室收集 10 例正常妊娠 6~8 周蜕膜组织, 生理盐水冲净血液后, 置于子宫内膜干细胞培养基中, 用冰盒 30min 内送至暨南大学附属第一医院中心实验室. 患者年龄 20~35 岁, 无乙肝等传染病, 无阴道炎等妇科炎症, 未合并内外科疾病, 未服用过保胎药,B 超提示胚胎发育正常. (2) 试剂和仪器胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ;Ⅰ 型胶原酶沟自美国 Sigma 公司 ; 鼠抗人波形蛋白单克隆抗体, 鼠抗人角蛋白单克隆抗体, 免疫组化试剂盒购自丹麦 DAKO 公司 ;TGF β1 EGF PDGF BB 购自上海普欣.CO 2 培养箱为美国 ThermoForma 公司产品 ;XDS 1B 倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品等. 1.2 方法 (1) 标本的处理将蜕膜组织用 PBS 液反复冲洗, 至液体变清亮. 然后移入无菌的培养皿中, 眼科剪剪成 1mm 3 大小. (2) 间质干细胞的分离培养将胶原酶 Ⅰ 加入培养皿中, 放入 37 恒温振荡培养箱消化 50min. 再加入等量 DMEM F12 培养基终止消化.1500r/ min 离心 5min. 小心弃上清. 加入适量 DMEM F12 培养液, 制成悬液后, 经 200 目滤网过滤, 滤过液加入到 T25 培养瓶中, 放入体积分数为 5% CO 2 培养箱中培养, 温度为 37, 每 3 天换液, 细胞融合到 80% 传代. (3) 间质干细胞显微镜观察将细胞传代至第 2 代, 接种于 T25 培养瓶后 48h, 在倒置相差显微镜下观察, 了解细胞的数量, 生长状态, 形态和贴壁情况等. 间质干细胞生长曲线 : 观察, 选取生长状态良好的间质干细胞, 用含有体积分数分别为 1% 两性霉素 1% 青 / 链霉素 20% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基, 配制成浓度的单细胞悬液. 接种于 96 孔板, 每孔 100μL. 置于 37, 体积分数 5% CO 2 饱和湿度培养箱内培养, 培养 d, 并每天设 5 个复孔. 测定前每孔加 10μLCCK 8 溶液, 避光, 然后放入培养箱中孵育 2h, 再检测 450nm 波长吸光度值. (4) 间质干细胞的鉴定间质干细胞表面标记物的流式细胞仪检测 : 取良好状态的细胞, 倒出培养液,PBS 液洗 2 遍, 胰酶消化后离心, 制成浓度的单细胞悬液,Ep 管加细胞悬液 100μL. 直接法分别加入 20μL 鼠抗人的 CD34 FITC,CD45 PC5,CD73 PE,CD90 PC5,CKPE,HLA I FITC 避光室温. 孵育 20min, 用 PBS 洗 2 次,1500r/min 离心 5min, 再次制成细胞悬液, 行流式细胞仪检测. (5) 间质干细胞表面标记物的免疫细胞化学检测取第 2 代生长到第 6 天的细胞, 免疫细胞化学检测其角蛋白 (Keratin,CK), 波形蛋白 (Vimentin, VIM) 的表达 ; 另一部分按细胞浓度 , 接种于 24 孔培养板, 进行细胞爬片,5d 后进行免疫细胞化学检测. 用 PBS 洗细胞爬片 3 次各 1min, 然后固

第 5 期高绿芬, 等 : 人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究 465 定 15min, 置空气中干燥 5min,PBS 洗细胞爬片 3 次, 每次 2min, 以 DPBS 配置体积分数为 0 5% TritonX 100 孵育 20min,1 次,PBS 洗细胞爬片 3 次, 每次 2min, 体积分数为 3% H 2 O 2 孵育 15min, DPBS

3~10min, 镜下观察至棕色, 蒸馏水洗 2 次, 复染用苏木精 0 5~1 0min, 最后自来水清洗 30min, 树胶封固, 显微镜下观察结果.

3 第 5 期高绿芬, 等 : 人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究 465 定 15min, 置空气中干燥 5min,PBS 洗细胞爬片 3 次, 每次 2min, 以 DPBS 配置体积分数为 0 5% TritonX 100 孵育 20min,1 次,PBS 洗细胞爬片 3 次, 每次 2min, 体积分数为 3% H 2 O 2 孵育 15min, DPBS 洗爬片 3 次, 每次 2min, 用体积分数为 5% 正常二抗血清 DPBS 液孵育 20min,PBS 配一抗, 滴度的湿盒孵育,4 冰箱过夜,37 60min,PBS 洗爬片 3 次各 5min,37 湿盒内二抗工作液孵育 30min,PBS 清洗爬片 3 次, 每次 5min,37 湿盒 C 液 30min,PBS 清洗爬片 3 次, 每次 5min, 避光, DAB 显色 3~10min, 镜下观察至棕色, 蒸馏水洗 2 次, 复染用苏木精 0 5~1 0min, 最后自来水清洗 30min, 树胶封固, 显微镜下观察结果. (6) 间质干细胞的定向分化诱导及鉴定取第 2 代生长到第 6 天的细胞, 制成细胞悬液, 以 , 接种于 24 孔培养板, 进行细胞爬片, 实验组培养基内加入质量浓度均为 10ng/mL 的 TGF β EGF PDGF BB, 对照组为正常培养基. 定向诱导后行细胞免疫化学法检测子宫内膜上皮标志物 CK, 间质标志物 VIM, 方法同上. 主要观察指标 : 间质干细胞特异性表面抗原上皮及间质细胞免疫化学染色结果. 2 结果 2.1 间质干细胞的分离培养的结果细胞接种于培养瓶 24h 内贴壁生长, 可见细胞有细小突起自边缘爬出. 培养 2d 后倒置显微镜下可见到 : 大多细胞为梭形, 具有成纤维细胞形态, 细胞贴壁生长 ( 图 1). 2.2 细胞生长曲线呈 S 形, 接种后第 1 天吸光度值变化不大, 为细胞的潜伏适应期, 从第 2 天开始细胞增殖加速并进入对数生长期, 第 5 天达高峰, 以后进入平台期 ( 图 2). 2.3 干细胞表面标志物的鉴定结果流式细胞仪间质干细胞的表面抗原分析显示, CD73 CD90 Ck 与 HLA I 呈阳性, 标记出现单峰, 而 CD34 与 CD45 阴性表达 ( 图 3). 细胞免疫化学法检细胞成梭形, 贴壁生长. 图 1 原代第 5 天的早孕蜕膜子宫内膜间质干细胞 ( 100) Fig.1 Thefifthdayoftheprimarydecidualendometrialstromal stemcels Fig.2 图 2 生长曲线第 2~5 天增殖活跃 Growactivelyontheseconddaytothefifthdaywas showedonthegrowthcurve 间充质标志物 CD90,CD73 阳性 ; 造血干细胞标志物 CD45,CD34 阴性 ; 上皮标志物 CK 阴性 ; 非绒毛来源标志物 HLA I 阳性, 说明非绒毛来源. 图 3 早孕蜕膜子宫内膜间质干细胞表面标记物的表达 Fig.3 Expresionofdecidualendometrialstromalstemcelsurfacemarkers

４６６暨南大学学报自然科学与医学版测ＣＫＶＩＭ阳性为胞浆染色切片中显示胞浆染为淡黄色至深棕黄色为阳性检测结果提示间质干细胞ＣＫ阴性ＶＩＭ阳性说明其间质来源图４第３５卷２４间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化及鉴定实验组ＣＫ和ＶＩＭ均为阳性而对照组ＣＫ阴性ＶＩＭ阳性图５ＡＣＫ阴性Ｂ

由功能层和基底层组成的人类子宫内膜在卵巢激素的作用下经历增生分化组织崩溃和剥脱形成月经而位于基底层的子宫内膜干细胞系统被认为在女性生殖道再生和重塑中发挥至等３证实人类子宫内膜干细关重要的作用Ｃｈ胞祖细胞的存在分为子宫内膜上皮干细胞和间质干细胞两种细胞集群被命名为具有在特别低密度下单个细胞分化成一群细胞的能力是各种成人干

4 ４６６暨南大学学报自然科学与医学版测ＣＫＶＩＭ阳性为胞浆染色切片中显示胞浆染为淡黄色至深棕黄色为阳性检测结果提示间质干细胞ＣＫ阴性ＶＩＭ阳性说明其间质来源图４第３５卷２４间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化及鉴定实验组ＣＫ和ＶＩＭ均为阳性而对照组ＣＫ阴性ＶＩＭ阳性图５ＡＣＫ阴性ＢＶＩＭ阳性１００图４早孕蜕膜子宫内膜间质干细胞表面标记物的表达Ｆｇ４ＥｘｐｍｍｍｍｋＡ对照组ＣＫ阴性１００Ｂ实验组ＣＫ阳性Ｃ对照组ＶＩＭ阳性Ｄ实验组ＶＩＭ阳性ＢＤ４００图５间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化Ｆｇ５Ｈｍｍｍｐｈ３讨论在月经周期由功能层和基底层组成的人类子宫内膜在卵巢激素的作用下经历增生分化组织崩溃和剥脱形成月经而位于基底层的子宫内膜干细胞系统被认为在女性生殖道再生和重塑中发挥至等３证实人类子宫内膜干细关重要的作用Ｃｈ胞祖细胞的存在分为子宫内膜上皮干细胞和间质干细胞两种细胞集群被命名为具有在特别低密度下单个细胞分化成一群细胞的能力是各种成人干细胞的检验特点人类子宫内膜间质细胞和上皮细胞是细胞集群但前者在体外有更多集群能力同时上皮或间质干细胞有高度分化潜能有骨髓和脂肪组织间充质干细胞的特点能分化成间充质谱系包括脂肪细胞平滑肌细胞心肌细胞神经细胞和骨细胞４１２因而广泛用于神经系统病变心血管系统病变重症肌无力等损伤修复的研究１３１５本实验采用混合法即机械和酶消化相结合对组

5 第 5 期高绿芬, 等 : 人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究 467 织进行消化, 其中胶原酶 Ⅰ 消化组织后得到的细胞数量多, 培养易于成活, 并且生长状态良好 [16]. 机械性目网的筛选作用, 可区分出不同大小的细胞, 从中分离出集群能力更强的间质细胞用于实验. 尚未发现子宫内膜干细胞特异性的表面标志物 [2,4,16], 其鉴定常根据其间充质来源而采用间充质干细胞表面标志物 CD29 CD73 和 CD90 等, 不表达造血干细胞标志物 CD34 和 CD45 等. 本实验分离的干细胞高表达 CD73 与 CD90 证明其间充质来源, 不表达 CD34 与 CD45 证明其为非造血干细胞来源. 高表达 HLA I, 证明其不来源于绒毛, 因为绒毛组织不表达 HLA I [1]. 不表达 CK, 证明其不是上皮来源. 同时细胞免疫化学法提示 CK 阴性,Vim 阳性, 进一步证实其间质来源. 本实验采用含 TGF β EGF 和 PDGF BB 的诱导培养基成功诱导间质干细胞向子宫内膜上皮分化. 干细胞分化的方向在很大程度上取决于细胞所处的微环境.TGF β 家族是生长因子超家族, 在调节许多生物学过程如细胞生长死亡干细胞多系分化起着非常重要的作用.PDGF BB 同 TGF β 一样, 是调节干细胞分化的重要生长因子 / 细胞因子. 祖细胞通过细胞表面受体即 PDGF BB 和 TGF β 受体感受始动信号过亚基的酪氨酸磷酸化使受体激活, 通过复合物的信号传递影响包括细胞分化的细胞生理学的各个方面.EGF 信号通路可通过调控蛋白调节细胞周期, 影响细胞的增殖分化. 波形蛋白和角蛋白可用于区别间质细胞和上皮细胞, 在诱导效果的评价中是通过细胞免疫化学法检测这两种蛋白的表达情况来判断间质干细胞是否向上皮细胞分化. 间质干细胞是表达波形蛋白, 不表达角蛋白的, 如果在诱导后其表达角蛋白则可以说明其向上皮细胞分化. 本实验在诱导前检测上皮标志物角蛋白阴性, 诱导后为阳性. 证实成功诱导间质干细胞向上皮分化. [ 参考文献 ] [1] GULERIAI,SAVEGHM H.Maternalacceptanceofthe fetus:truehumantolerance[j].jimmunol,2007,178 (2): [2] DIMITROV R,KYURKCHIEV D,TIMEVA T,etal. First trimesterhumandeciduacontainsapopulationof mesenchymalstemcels[j].fertilsteril,2010,93(1): [3] CHANRW,GARGETTCE.Identificationoflabel re tainingcelsin mouseendometrium[j].stem Cels, 2006,24(6): [4] CERVELLOI,MASA,GIL SANCHISC,etal.Recon structionofendometrium from HumanEndometrialSide PopulationCelLines[M].PLoSONE,2011,6(6): e [5] GARGETTCE,SCHWABKE,ZILLWOODRM,et al.isolationandcultureofepithelialprogenitorsandmes enchymalstemcelsfromhumanendometrium[j].biolo gyofreproduction,2009,(1)80: [6] MARUYAMAT.Stem/progenitorcelsandtheregenera tionpotentialsinthehumanuterus[j].reproductive MedicineandBiology,2010,9(7):9-16. [7] MARUYAMAT,YOSHIMURAY.Molecularandcelu larmechanismsfordiferentiationandregenerationofthe uterineendometrium[j].endocrinejournal,2008,55 (2): [8] MASUDAH,MARUYAMAT,ONOM N,etal.Isola tionandidentificationofputativestem/progenitorcels fromhumancyclingendometrium[c].proceedingsofthe EndocrineSociety,87thAnnualMeeting. SanDiego, CA,USA.OR2005: [9] MASUDAH,KALKAC,TAKAHASHIT,etal.Estro gen mediatedendothelialprogenitorcelbiologyandki neticsforphysiologicalpostnatalvasculogenesis[j].cir culationresearch,2007,101(1): [10] MASUDA H,MARUYAMA T,HIRATSU EY,etal. Noninvasive and realtime asesmentofreconstructed functionalhumanendometriuminnodscidimmunodefi cientmice[j].pnas,2007,104(3): [11] MASUDAH,MARUYAMAT,ONOM N,etal.Isola tionandfunctionalanalysisofputativehumanendometrial stem/progenitorcels[j].humanreproduction,2008, 23(Suppl1)i195. [12] MASUDAH,MATSUZAKIY,HIRATSUE,etal.Stem cel likepropertiesoftheendometrialsidepopulation: implicationinendometrialregeneration[j].plosone, 2010,5:e [13]CESARV.BORLONGAN,YUJIKANEKO,etal.Men strualblood CelsDisplayStem Cel LikePhenotypic MarkersandExertNeuroprotectionFolowingTransplanta tioninexperimentalstrokestem CELLSANDDEVEL OPMENT,2010,19(4): [14] JONATHANH.DINSMORE,NABILDIBstemcelsand cardiacrepair:acriticalanalysis[j].jofcardiovasc TransRes,2008,1(1): [15]TOYODAM,CUICH,UMEZAWAA.Myogenictrans diferentiationofmenstrualblood derivedcels[j].acta Myologica,2007,26: [16] 马颖, 何援利. 两种方法分离子宫内膜干细胞的比较 [J]. 中国组织工程研究,2013,17(6): [ 责任编辑 : 朱颖?]

干细胞和再生医学科学学位免考免考非定向干细胞和再生医学科学学位免考 85 非定向干细胞和再生医学科学学位免考 69 非定向护理学科学学位免考免考非定向护理学科学学位

干细胞和再生医学科学学位免考免考非定向干细胞和再生医学科学学位免考 85 非定向干细胞和再生医学科学学位免考 69 非定向护理学科学学位免考免考非定向护理学科学学位 2018 年秋季报考博士上线考生名单序号准考证号报考专业名称学位类型外语成绩专业基础课成绩报考类别备注 1 180371 病理学与病理生理学科学学位免考免考非定向 2 180393 病理学与病理生理学科学学位免考免考非定向 3 180427 病理学与病理生理学科学学位免考免考非定向 4 180436 病理学与病理生理学科学学位免考免考非定向 5 180474