法庭科学领域中的个体识别与NGS-姜先华

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1 法庭科学领域中的个体 识别与 NGS 辽宁省刑事科学技术研究所姜先华

2 一 法庭科学 DNA 技术的发展史

3 法医物证 - 个体识别 古代法医学 宋慈 ( 公元 1186 年 - 公元 1249 年 ) 法医学鼻祖, 南宋福建建阳人, 其所著 洗冤集录 是世界最早的一部完整的法医学专著 ( 滴血验亲 ) 现代法医 -- 物证学 林几 ( 公元 1897 年 ~ 公元 1951 年 ) 福建福州人, 是我国现代法医学的创始人 著有 二十年来法医学之进步 法医学史 等 40 多篇论著 个体识别的三个阶段 血型 蛋白质 DNA 个体种类识别 至今 同一个体识别

4 DNA 的发现与 DNA 的法医学应用 DNA 的发现 (1953) DNA 指纹图的发明 (1985) 与应用 (1986) mtdna 的应用 (1994) 1953 年 4 月 25 日, 沃森与克里克在 Nature 上发表了关于 DNA 结构和自我复制机制的论文, 开创了分子生物学时代 富兰克林和威尔金斯通过 X 线衍射获得 DNA 晶体结构照片证实了这一发现 1985 年英国 Leicester 大学 Jeffreys 教授报告了人肌红蛋白基因第一内含子中的小卫星序列的 DNA 图谱, 呈现极高的多态性, 称其为 DNA 指纹图 Peter Gill 教授是于 1986 年率先将 DNA 技术应用到实际案件中 同时, 他于 1994 年利用线粒体 DNA 技术成功鉴定俄国沙皇身源 1983 年琳达 1986 年多恩被强奸杀害案 安德鲁移民案 俄国沙皇身源鉴定案

5 法庭科学 DNA 技术的发展概览 DNA 指纹图在法医领域的应用 英国家数据库启用 (1995 年 4 月 10 日 ) 商品化的荧光标记 STR 复合扩增 CODIS 位点 ID PP 16 跨国 区域性 DNA 数据库 Globalfiler MiSeq PP24 PP ES17,18D,21 PGM NGM PP 16HS 高通量测序 ID plus 微流控芯片世界各国 DNA 数据库 SNP 2010 ABI 3500 mini-str 专家系统 ABO+STR 国产荧光试剂盒出现 Y-STR 2000 ABI ABI 3130xl 毛细管 STR 分型普遍应用 扩展 CODIS 位点 自动化工作站 小体系 PCR 精准身份鉴定 2015 NGS 数据 RFLP A-STR mtdna DQA1 & PM PCR 技术 平板胶电泳技术 1995 斑点杂交技术 复合扩增技术 毛细管电泳技术 平板胶电泳数据 毛细管电泳数据

6 二 法庭科学 DNA 技术的应用现状

7 常用遗传标记及其作用 同一认定 现场物证 犯罪嫌疑人 A-STR 亲子鉴定 数据库建设 Y-STR 父系排查 数据库建设 起步阶段 其它, 如 X-STR, 线粒体 DNA 等遗传标记也有所应用, 但较少

8 全国 DNA 数据库概况 公安系统 DNA 检验能力 4440 万 全国公安 DNA 数据库的成就 800 万 15 万 / 年 410 起 1300 万 / 年 发展迅速, 成就非凡, 作用巨大

9 毛细管电泳技术在案件中可以解决的问题 一 国内外基于毛细管电泳技术 (CE) 的试剂盒约有 30 多种 二 目前 CE-STR 技术可检测 6~8 种荧光色 最多可复合扩增 ~34 个 STR 三 CE-STR 技术灵敏度能达到纳克水平 四 可从多种类型检材中获得 STR 分型信息 如血痕 唾液斑 肌肉 条件较好的骨骼 牙齿等

10 面对智能犯罪的不断增多 DNA 检测技术能否做得更好 更丰富 更具指导意义 CE-STR 技术可解决案件的比例 通过 CE-STR 技 术可解决约 70% 的案例 通过 CE-STR 技 术未能解决的 案例约占 30% 一 CE-STR 技术检测能力有限 二 犯罪分子反侦查意识增强 : 破坏 留下更少的生物检材

11 案件侦破中的期望 降解检材微量检材 常 -STR Y- STR 部分线粒体 DNA 所提供的信息有限 能否获得更多有用的分型信息? 能否一次检测更多的遗传标记? 混合检材能否拆分每个贡献者的分型信息? 无比中信息 能否根据遗传信息刻画人物 重建现场? NGS 技术能否达到上述期望 实现精准打击犯罪?

12 三 NGS 在法庭科学中的应用

13 高通量测序检测基因多态性可实现的功能 常染色体 STR 个人识别 SNP 认定 祖先信息 SNP 家系信息 SNP mrna 推断 外部可视特征 SNP 刻画

14 高通量测序与电泳检测遗传标记的比较 CE NGS 常染色体 常染色体 可检测的遗传标记的种类 范围 Y 染色体 X 染色体 通常单独检测 Y 染色体 X 染色体 可联合检测 通常仅检测控制区甚至只检测高变区 检测线粒体全基因组 可检测的遗传标记的个数 STR~34 个 SNP~50 个 STR:60+ SNP:500+, 可以更多 可检测的样本个数 一个人 多个人 扩增子片段 70 bp 200 bp 400bp 长度范围 70~400 bp, 相同荧光色的片段不可重叠 70 bp 200 bp 400bp 长度范围通常 <200 bp, 不同片段可以重叠

15 目前可检测的遗传标记 STR SNP mtdna 其它标记 同一认定 (A-STR) 同一认定 (IISNP) 确定母系信息 追溯体液来源 父系排查 (Y-STR) 父系排查 (LISNP) 毛发 高度降解检 推断年龄 疑难亲缘认定 (X-STR) 祖先信息推断 (AI-SNP) 外貌特征推断 (EVC-SNP) 材的鉴定 区分同卵双生子分子解剖 混合检材拆分 (Microhaps) 同一认定 第 23 期 STR 第 25 期 SNP 第 22 期线粒体

16 目前可检测的遗传标记 STR 同一认定 (A-STR) 父系排查 (Y-STR) 疑难亲缘认定 (X-STR)

17 STR 在法庭科学中的应用 A-STR Y-STR X-STR 个人识别家系排查复杂亲缘鉴定

18 用 NGS 技术检测 STR 的优势 一 可联合检测 A-STR Y-STR X-STR 多种遗传标记, 信息量更多 A-STR Y-STR X-STR CE 和 / 或或最多 34 个 A-STR Y-STR X-STR NGS 和 和 目前 63 个 可以更多

19 频数 频数 用 NGS 技术检测 STR 的优势 二 同时获得长度与序列信息, 等位基因数目更多, 识别能力更高 D2S1338 共检出 16 个不同的等位基因 等位基因 共检出 64 个不同的等位基因 等位基因

20 用 NGS 技术检测 STR 的优势 三 扩增片段短, 有利于检测降解检材 扩增片段长度比较 检测效果比较 CE NGS ~70bp 200bp 400bp 多数 NGS-STR 的扩增子长度范围在 70 bp ~250 bp 左右, 而自然降解的 DNA 片段长度集中在 100 bp ~200 bp 左右 二者范围接近 NGS-STR 技术有利于提高降解检材的检出率 用 CE-STR 技术能获得 54.17%(13/24) 的信息 用 NGS-STR 技术能获得 92%(23/25) 的信息

21 目前可检测的遗传标记 SNP 同一认定 (IISNP) 父系排查 (LISNP) 祖先信息推断 (AI-SNP) 外貌特征推断 (EVC-SNP) 混合检材拆分 (Microhaps)

22 NGS-SNP 个人识别 SNP (IISNP) 突出优势 : 片段短, 利于检测降解检材白骨化检材 目前常用的 IISNP 主要由耶鲁大学 Kidd 团队以及欧洲 SNPforID 联盟及筛选出来, 具有片段短 杂合度高, 群体差异小等基本特点 CE-STR 在中国汉族人群中具有以下特点 : 用 CE-STR 技术获得 38%(9/24) 的信息 NGS-SNP 用 NGS-SNP 技术获得 90%(111/124) 的信息 另据文献报导,NGS-SNP 技术可从 12 世纪的遗骸中获得 76%(128/169) 的分型信息 1 南方汉族与北方汉族间无差异频率数据可共享 2 累计个人识别能力 ( 约 ) 90 个 IISNP > 22 个 A-STR( 约 ) 3 累计父权指数 (1.390 x ) 与 22 个 A-STR(5.924 x ) 的接近

23 NGS-SNP 家系信息 SNP(LISNP) 父系遗传的 Y-SNP 功能 : 提供性别信息进行父系排查 三代父系家系 ( 爷 - 父 - 子 ) 结果一致符合父系遗传规律

24 NGS-SNP 祖先信息 SNP(AISNP) 目前所用的 AISNP 主要由休斯顿大学 Seldin 团队和耶鲁大学 Kidd 团队分别筛选出来 这些祖先信息 SNP 具有群体间频率分布差异大 甚至是群体特异的特点 功能 : 推断个体生物地理学祖先信息, 间接描述个体的表型信息 ( 非洲 黑人 亚洲 黄种人 ), 提供侦查线索 1 能否区分较小的亚群结构 ( 我国南方汉族 北方汉族 ) 2 能否准确推断 混血 个体的始祖信息 东亚 100%

25 NGS-SNP 外部可视特征 SNP(EVC-SNP) 功能 : 提供外部可视特征信息, 从分子水平刻画人物体貌 预测肤色 预测头发颜色 预测面容 预测虹膜颜色 预测身高

26 NGS-SNP 微小单倍型 (Microhaps) 耶鲁大学 Kidd 团队通过筛选短距离内 (200 bp 内 ) 多态性良好的 SNP(2-4 个 ), 组成高度多态的单倍型, 用于混合检材分析, 称微小单倍型 不同民族中微小单倍型频率分布示意图 2-SNP 3-SNP 4-SNP 一般 中等 较高 区分混合检测的能力 模拟数据提示检测多个微小单倍型实现区分混合检材的可能性最高可达到 95% 微小单倍型 区分混合检材的希望

27 目前可检测的遗传标记 mtdna 确定母系信息 毛发 高度降解检材的鉴定

28 线粒体 DNA 在法庭科学中的应用 mtdna 适用于毛发 指甲 高度降解检材 ( 如白骨化遗骸 ) 等用常规 STR 技术不能进行个体识别的难题 俄国皇室罗曼诺夫家族以及他们经过遗传鉴定的遗骸 过去用一代测序技术, 仅能通过检测高变区的多态性位点来推断遗骸属于末代沙皇 而今, 可以通过 NGS 技术检测遗骸线粒体全基因组, 进一步肯定了遗骸的身份

29 检测线粒体全基因组, 获得更高的识别能力 高变 I 区 + 高变 II 区线粒体全基因组 人群 随机匹配概率 单倍型多样性 随机匹配概率 单倍型多样性 非裔美国人 2.42% 98.72% 1.31% 99.84% 高加索人 3.12% 98.06% 1.20% % 西班牙人 3.33% 97.53% 0.98% 99.91% 中国汉族 1.04% 99.89% 0.93% % 国内外数据均显示检测线粒体全基因组信息能得到更低的随机匹配概率, 意味着在人群里比中无关人员的可能性更小, 识别能力更高

30 检测线粒体全基因组, 获得更精确的单倍簇 样品 控制区 (CR) 线粒体全基因组 N021 M9a'b G N044 M9a1a1c1b1 D4 N079 M G2b1a N083 D4k C4a1-195 N088 M74 D4j7/D4j N094 R6 D4-195C mtdna 单倍簇分布简图 (rcrs) 亚洲 N096 M G1c 欧洲 非洲 利用线粒体全基因组信息可得到更精确的单倍簇信息, 能更准确地推测人物的母系遗传背景, 为案件侦查提供更准确的信息

31 与此同时本研究的北方汉族线粒体全基因组数据 (EMP00670) 是首个递交到 EMPOP 数据库的东亚群体数据 原始论著 Forensic Science International: Genetics 22 (2016) Strategies for complete mitochondrial genome sequencing on Ion Torrent PGM TM platform in forensic sciences ( 在 PGM 平台上检测人线粒体全基因组的策略 ) Yishu Zhou, Fei Guo, Jiao Yu, Feng Liu, Jinling Zhao, Hongying Shen, Bin Zhao, Fei Jia, Zhu Sun, He Song, Xianhua Jiang*( 周懿舒, 郭飞, 于蛟, 刘锋, 赵金玲, 沈红缨, 赵斌, 贾菲, 孙竹, 宋鹤, 姜先华 *) 检测策略 = 长片段 PCR 法 + 酶切打断法 + PGM 测序 + 含自编程序的 NGS 数据分析流程每周通量 = 30 个参考样本 以 26pM 的浓度制备测序模板,314/316/318 芯片分别检测 4/15/30 个样品, 可保证获得 1500 x 的平均测序深度 分析软件的准确率为 97.34% 分析软件在平均测序深度 1500 和均聚物 5-bp 时是可靠的 当存在 6-bp 均聚物 ( 尤其是 8-bp 时 ) 和平均测序深度 500 时, 一些特定区域甚至是整个线粒体基因组的变异需要回顾数据 与仅检测高变 I 区的数据相比较, 线粒体全基因组的随机匹配概率为 , 下降了 26.19%; 单倍性多样性为 1, 上升了 0.33%; 同时可得到更准确的单倍簇信息

32 原始论著 Forensic Science International: Genetics 23 (2016) Evaluation of the Early Access STR Kit v1 on the Ion Torrent PGM TM platform( 在 PGM 平台上对 EA-STR 试剂盒进行评估 ) Fei Guo, Yishu Zhou, Feng Liu, Jiao Yu, He Song, Hongying Shen, Bin Zhao, Fei Jia, Guangwei Hou, Xianhua Jiang,*( 郭飞, 周懿舒, 刘锋, 于蛟, 宋鹤, 沈红缨, 赵斌, 贾菲, 姜先华 *) EA-STR 是赛默飞公司 2015 年推出的 NGS-STR 试剂盒, 共有 25 个基因座, 其中含 16 个扩展 CODIS 基因座 8 个非 CODIS 基因座及 1 个性别基因座 与 CE 相比, 用 NGS 技术检测时唯一等位基因数目增加了 30 个 (27%) 在 D21S11 位置上偶尔观察到分型不一致 (0.95%), 由算法引起, 新算法可解决 灵敏度 : 100 pg 混合检材检测能力 :1:9 较 CE 适用于降解检材 (200 bp 片段的出峰率,CE:40.91% NGS:85.11%) 适用于血痕 微量检材 唾液斑 骨骼 牙齿 肌肉 精子 / 阴拭等案件检材

33 原始论著 Forensic Science International: Genetics 25 (2016) Next generation sequencing of SNPs using the HID-Ion AmpliSeq TM Identity Panel on the Ion Torrent PGM TM platform( 在 PGM 平台上用 HID- 个人识别试剂盒检测 SNP) Fei Guo, Yishu Zhou, He Song, Jinling Zhao, Hongying Shen, Bin Zhao, Feng Liu, Xianhua Jiang*( 郭飞, 周懿舒, 宋鹤, 赵金玲, 沈红缨, 赵斌, 刘锋, 姜先华 *) HID- 个人识别试剂盒共有 124 个基因座, 其中含 90 个 A-SNP 基因座 34 个 Y-SNP rs 基因座偶见分型不一致, 需移除或改良 种属特异性 : 与灵长类动物有一定的交叉反应, 分型图谱与人的有区别 灵敏度 : 100 pg; 对于 21 个循环的扩增条件而言,200pg 1ng 是最佳模板量 混合检材检测能力 :1:9 适用于陈旧血痕 肌肉 唾液斑 骨骼 脱落细胞案件检材 群体遗传学 : A-SNP: 南方汉族与北方汉族数据可共享 (F ST = 0.003,< 0.06) 累计匹配概率 :> x (>22 个 A-STR 的 x ) 累计非父排除率 : (> 99.99% 可应用 ) 累计父权指数 ( 父 - 子 - 母三联体 ):1.390 x (> 可应用 ) 累计父权指数 ( 父 - 子二联体 ):2.361 x 10 6 (> 可应用 ) Y-SNP: 在 55 名男性中共检出 8 种单倍型, 单倍型多样性为 0.684

34 目前可检测的遗传标记 其它标记 追溯体液来源推断年龄区分同卵双生子分子解剖同一认定

35 NGS- 其它应用 推断体液 / 组织的来源 年龄推断 同卵双生子的区分 RNA 甲基化重组端粒长度 微生物基因组 疾病基因耐药基因 同一认定 分子解剖 查明死因

36 四 NGS 的现状 面临的困难与前景

37 NGS 主题在近期学术会议中的比例 其他主题 NGS 主题

38 NGS 在法庭科学中的研究趋势 基础研究 应用研究

39 NGS 应用到高法庭科学需解决的问题 一 CE-STR 数据如何与 NGS-STR 数据结合使用 CE-STR 数据 NGS-STR 数据 二 新增遗传标记数据如何与原有数据结合使用 很少甚至无 三 制定质量控制标准 指南 四 简化检测流程 缩短耗时 原有数据 SWGDAM ISO 中国安全技术防范认证中心认证 CE 技术 简单最快 ~3 小时 CE 技术 新增遗传标记数据 目前仅有一份 STR 命名建议 暂无质控相关的标准 指南 NGS 技术 ( 法庭科学方向 ) 复杂最快 ~19 小时 NGS 技术 ( 法庭科学方向 )

40 NGS 在法医领域的前景 1 发展速度较毛细管电泳快 2 NGS 的可应用性需要经过一个验证过程 3 与毛细管电泳有共同存在的一个时期, 形成互补 4 NGS 取代毛细管电泳 充满希望 5 NGS 与三代测序 ( 单分子测序和纳米孔测序 ) 充满幻想

41 谢 谢

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