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专题基于多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大庄英萍博士研究员博导现任华东理工大学生物工程学院院长国家生化工程技术研究中心上海主任 863 生物和医药领域工业生物技术主题专家中国微生物学会第十届理事会常务理事生化过程模型化与控制专业委员会主任委员中国化工学会生物化工专业委员会副主任委员长期从事发酵过程的优化与放大研究与团队共同建立了完整的理论方法与装备

1 专题基于多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大庄英萍博士研究员博导现任华东理工大学生物工程学院院长国家生化工程技术研究中心上海主任 863 生物和医药领域工业生物技术主题专家中国微生物学会第十届理事会常务理事生化过程模型化与控制专业委员会主任委员中国化工学会生物化工专业委员会副主任委员长期从事发酵过程的优化与放大研究与团队共同建立了完整的理论方法与装备并在数十个品种的工业发酵产品中成功应用近年获国家科技进步二等奖三项发表 SCI 论文 100 余篇获授权发明专利近 30 项基于多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大庄英萍田锡炜张嗣良华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海摘要细胞大规模培养过程是活体细胞代谢的过程因此存在着基因细胞反应器多尺度相关关系通过对生物反应过程中生理代谢特性参数检测并分析参数的理化相关和生物相关可以实现多尺度观察与调控主要介绍了在生物过程优化与放大研究中整合分析与细胞生理代谢特性相关的参数变化信息以及反应器流场特性参数变化信息从而实现微观与宏观相结合的过程优化方法以及细胞生理和反应器流场特性相结合的过程放大策略关键词多尺度参数相关分析微观与宏观代谢生理与流场特性优化与放大 DOI: /j.issn 大规模细胞培养过程的对象可以是微生物动物植物等各种细胞的培养过程而通过细胞大规模培养过程可以得到细胞菌体酶初级或次级代谢产物蛋白表达产物等产品可以生产出人们所需要的医药食品化工农业能源等领域的各类用品满足国民经济的发展需求尤其是在石油和煤炭资源即将耗竭之际社会经济的主体将会从碳氢化合物石油和煤炭经济转变为碳水化合物各类糖作为基础原料经济因此高效利用可再生资源并解析细胞大规模培养过程中复杂生命代谢的主体细胞生理代谢机理最终实现细胞基金项目国家 863 计划项目 SS2015AA 上海市科委重点项目 15DZ 大规模培养过程的优化与放大生产出低成本的各类产品已成为生物制造领域的主要研究内涵之一 1 生物过程多尺度理论与装备细胞大规模培养的生物反应过程中细胞生命代谢过程是一个复杂的系统过程首先微生物菌种的基因决定了该代谢过程的基本特性如顶头孢霉菌 Cephalosporium Acremonium 主要代谢产物是头孢菌素 C 这就是基因尺度决定细胞代谢的基本特性然而反应器的设计与操作条件差异又有可能改变细胞代谢的特性同样是上述菌种的代谢过程代谢调控策略培养基配方补料策略等的变化月 49

2 专题会引起最终目标产物产量的差异, 这表明, 细胞代谢特性除了受基因信息影响外, 还会受到操作条件的影响 ; 而反应器的不同结构会对物质传递造成很大的差异, 最终也会导致代谢产物产量的差异因 [1-2] 此, 张嗣良等提出了微生物反应过程存在基因尺度细胞尺度反应器尺度等多尺度多输入多输出的复杂系统, 多尺度相关特性示意图如图 1 所示其中物质流能量流信息流最为重要, 可以决定生物过程特性, 因此在实现生物过程优化与放大的进程中, 需要对生物反应过程的物质流能量流信息流进行跨尺度观察与调控为了全面了解细胞在反应器中的宏观生理代谢 [2] 特性, 实现跨尺度观察与调控, 张嗣良等设计了用于了解细胞生理代谢特性的全参数检测生物反应器整个装置由生物反应器与计算机数据采集系统两部分组成, 参数检测配置见图 2 生物反应器体积可以是几十升的实验室规模装置, 也可以是 300t 以上的工业装置 30L 或 50L 左右的发酵体积, 适于实验室操作和规划, 由此所得到的试验数据可根据参数调整的放大原理, 直接放大到 300t 以上的工业发酵罐规模在全参数检测的生物反应器中, 除了常规检测的温度 DO 转速等, 还配置了一些特殊参数的检测 : 检测尾气氧和二氧化碳浓度, 用于计算整个生物反应过程的氧摄取速率 (OUR) 和二氧化碳生成速率 (CER); 同时为了计算上述两个生理代谢参数, 还配置了准确测定空气流量的质量流量计 ( 工业规模为涡街流量计 ) 直接安装在反应器顶部的压力变送器反应器全罐称重系统 ( 工业规模为差压变送器 ) 和对代谢物质流检测的补料电子称系统等另一方面, 在反应器中还专门配置了用于数据处理的 BioStar 软件包 [3], 该软件包除了实现数据集成功能 ( 包括离线参数的输入 ), 更为重要的内置功能包括细胞生理代谢和反应器流场特征状态 rdna rdna RNA H + CO 2 DO CO 2 H + [1] 图 1 生物反应器中多尺度网络关系示意 (1 月 )

3 专题基于多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大 ݒ ઍ ੦ 但是所有的参数变化事实上又是有相关耦合性的即参数变化具有耦合性 100 ᄟ ୲(CER) ᄟฝൽ ୲ (OUR) ࢬဌ (RQ) ҽ ଉ ۹ᆳ ଉ ဦԇ ଉ ໗ప ଉ DO ओ უ O2 CO2 ၂ DO णਸ਼ ฉ ऐ p මᄟ ओ ఇຕገ ૐඐ ओ 图2 全参数检测生物反应器参数检测与控制配置示意 [2] 参数的直接呈现以及多批次生物过程参数的实时同步显示如 OUR CER 比生长速率氧传递系数 KLa 菌丝体形态图片等从而为后续实现过程参数相关分析奠定基础 2 80 ੦ዷऐ ܔ ଉ/% ଉ ຕఇገ ਪ ഘ 基于生物过程多尺度理论的参数相关分析生物反应过程中存在着基因细胞反应器等多尺度的网络关系由于绝大多数的生物过程是批培养过程所以基质消耗产物合成细胞生长等都表现出随时间变化而不断变化的特性如何从生物反应过程中获取实时参数信息找到不同尺度间的相互联系最终实现跨尺度观察与调控其关键在于从海量的参数信息中寻找到表征生物反应过程的核心内容即寻找到关键敏感参数变化之间的相关性最终以敏感参数作为细胞生理代谢反应器流场特性等过程调控的入手点实现生物过程的优化与放大解决上述问题的核心就是建立有关生物反应过程中各类参数的相关分析方法前提是运用各种参数检测的传感器对参数进行在线检测或部分数据实现离线检测与此同时在计算机辅助下对生物过程中的各类参数包括在线和离线参数的时序性变化进行综合研究和分析图 3 为某抗生素在发酵过程中所得到的部分典型参数随时间变化的趋势曲线由这些趋势曲线可以看出发酵过程中所检测到的各类参数是随着发酵时间的变化而不断变化的即参数具有时变性而且发酵过程中各个参数的变化形式各不相同即参数具有多样性此外这些参数在发酵过程中的变化往往是不确定的也即参数变化具有不确定性 0 32 图 ট क़/h 抗生素发酵过程中参数变化趋势曲线生物过程的参数相关特性可简单地分为理化相关和生物相关两大类理化相关是指由于纯粹的物质理化性质变化所引起的参数相关物理过程可包括物质或能量传递混和搅拌转速通气流量和罐压力等化学过程则包括传热加热或冷却酸碱补入以及由此形成的物理化学反应等理化相关的典型表现包括在发酵过程中打开冷却水的阀门就会引起罐温的下降或加入某种酸碱物质引起的的变化等显而易见的理化相关发酵罐搅拌转速提高时 DO 也会随之提高这主要是由于搅拌转速提高后打碎气泡的能力加强气液接触表面积增加提高了 KLa 也就是说发生了供氧水平 OTR 大于 OUR 的情况理化相关特征对不同细胞对象具有同一性不会因为细胞生理活性的变化呈现不同的理化相关特性生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间的耦合相关主要体现为两种方式第一通过生物细胞生长代谢引起的培养液物性的变化进而引起参数相关即在发酵过程中由于菌体生长情况变化而引起发酵液物性的变化从而引起其他测量参数相关变化的现象这是发酵过程的普遍现象如发酵起始接入菌种后由于营养成分丰富细胞逐渐进入快速生长期随着菌量的不断增加培养液黏度会逐渐上升此时若不增加供氧会引起 DO 水平的下降同时培养液黏度的变化也会引起 CO2 溶解与排出较前期出现差异当发酵进入后期时菌体发生自溶其浓度会降低则会月 51

专题引起 KLa 逐渐上升与此同时 DO 值明显上升上升的原因是由于菌体耗氧量下降与 KLa 上升的协同作用这就是由于 KLa 特性变化所引起的 DO 变化第二通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化直接对控制对象特性发生影响如发酵过程 DO 与 OUR 的相关性是完全与细胞生理代谢特性的强度有关的发酵过程 OUR CER 呼吸熵 RQ 等参数的相关变化

4 专题引起 KLa 逐渐上升与此同时 DO 值明显上升上升的原因是由于菌体耗氧量下降与 KLa 上升的协同作用这就是由于 KLa 特性变化所引起的 DO 变化第二通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化直接对控制对象特性发生影响如发酵过程 DO 与 OUR 的相关性是完全与细胞生理代谢特性的强度有关的发酵过程 OUR CER 呼吸熵 RQ 等参数的相关变化往往与细胞代谢途径或基质利用特性有关这些相关特性会受到不同细胞株同一细胞株不同生长环境条件的影响因此要根据实际情况进行相关分析才有可能获得真实有效的分析结果为后续发酵过程的优化与放大提供理论指导 3 基于微观与宏观生理代谢特性相结合的生物过程优化细胞代谢是在细胞内完成的但是代谢过程中各种代谢物会在胞内外形成一个动态平衡这些代谢物浓度的变化往往是过程调控中最为重要的内容然而实际生物反应过程中实时准确地检测这些浓度又有较大的困难一方面实现细胞代谢过程胞内微观代谢流研究是非常重要的一个环节另一方面细胞在反应器层面宏观细胞生理代谢的实时变化情况分析也可为过程调控提供依据生物反应过程胞内代谢流研究任何生物反应过程都是与胞内的代谢途径通量息息相关的营养物质被利用后通过一系列胞内的代谢途径网络生成目标产物在此过程中环境组微生物胞内基因组转录组蛋白组和代谢组信息的变化直接影响着胞内代谢途径通量获取发酵过程中细胞微观代谢通量变化信息是了解细胞生理代谢直接可靠的手段代谢通量分析对生物反应过程强化有着重要的意义国内外已有多个研究团队对基于稳定性同位素 13C 的细胞代谢通量分析原理进行了探讨但目前国际上常用的 13C 代谢流测定方法只适用于处于稳态的连续培养或批培养对数生长期难以应用到发酵工业上常见的批培养和补料批培养的生产过程因此其在工业规模生产过程的应用尚未有报道针对 13C 代谢流测定技术在实际生产应用中碰到的实验成本高实验周期长等困难以装置微型化标记动态化及取样快速化的解决思路能够有效研究批培养和补月料批培养过程中胞内代谢途径通量的变化同时与在线采集的生理状态参数变化结合分析能够较好地解决上述困难并将有可能在工业化研究中得到成功应用在具体的研究过程中通过研制专用微观代谢流研究装置采用四罐并行的全参数检测微型反应器实际反应体积在 150mL 左右图 4 可以实现完全相同初始生理状态反应液向不同调控策略如不同 13C 标记底物流加策略不同反应器操作策略等的平行转移从而测定不同的胞内代谢流变化情况此外快速取样系统样品处理方法以及利用气相质谱 GC-MS 或液相质谱 / 质谱 LC-MS/ MS 准确测定胞内重要代谢物方法也是保证样品真实性的必要条件最后根据分析所得的数据和细胞代谢基本信息利用自主研制的 BIOFLUX 软件系统构建出合理的胞内代谢网络 [4] 图4 用于 13C 同位素示踪技术联动并行的微型反应器系统在黑曲霉 A. niger 产糖化酶代谢调控机制研究过程中鲁洪中等 [5] 利用 13C 标记代谢流分析结合代谢物组学分析的方法比较了高产菌 DS03043 与模式菌 CBS 在胞内代谢流分布中心碳代谢物池上的差异发现高产菌 A. niger DS03043 中总氨基酸浓度池 ATP/AMP 比例和磷酸戊糖途径通量出现明显增加对于低产菌 A. niger CBS 由于存在 NADH 产生和消耗的不平衡菌株处于相对较高的还原态导致胞内柠檬酸草酰乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸的积累以及副产物草酸和柠檬酸的大量分泌这就在一定程度上降低了菌体对葡萄糖的摄入速率因此通过代谢物组学和 13C 标记代谢流关联分析技术能够初步揭示黑曲霉在生产糖化酶过程中能量和还原力代谢对细胞通量分布的调控作用在维生素 B12 发酵过程研究中首先完成了维生素 B12 发酵基本代谢特性研究与调控通过对维生素 B12 发酵培养基中营养因子进行研究确立了玉米浆

5 专题基于多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大 [6-8] 质量以及廉价糖蜜的使用标准, 同时李昆太等对 Zn 2+ Co 2+ DMBI 甜菜碱等在维生素 B 12 发酵中的作用进行了考察分析, 并以此对补料工艺进行改进, 建立了工业生产罐中简单且效果非常显著的 -stat 控制策略, 并且发酵过程中维持甜菜碱最优化浓度为 5 ~ 7g/L( 最有利于维生素 B 12 的合成 ) 基于上述系统培养基优化研究, 使得维生素 B 12 发酵生产水平从 90 mg/l 提升到 176mg/L 其次开展了基于微观代谢流分析的碳代谢机理研究 : 王泽建 [9] 等开发了以葡萄糖和甜菜碱为碳源的全合成培养基和培养工艺, 使得产物比生产速率能够接近工业生产复合培养基条件下的效果 ; 建立了基于同位素 13 C 标记的脱氮假单胞菌微观代谢途径通量分析方法 ; 并在此基础上利用 13 C 同位素葡萄糖标记实验确立了脱氮假单胞菌生产维生素 B 12 过程中碳中心代谢网络, 解析了关键底物甜菜碱的降解机理及对整体代谢途径通量变化的影响 ; 此外根据相关代谢物碳原子的同位素标记丰度信息证实了 C 4 途径 ( 甘氨酸和琥珀酰辅酶 A 合成 5- 氨基乙酰丙酸 ) 是脱氮假单胞菌中维生素 B 12 合成的主要途径, 而 C 5 途径 ( 谷氨酸生成 5- 氨基乙酰丙酸 ) 所占通量比例只有 15% ~ 20% ; 同时还进一步考察了氧限制条件下不同比氧摄取速率对该生产菌胞内微观代谢途径通量变化的影响最后形成了基于微观与宏观代谢流场与生理特性相结合的优化策略 : 通过分批和恒化培养详细考察了脱氮假单胞菌的氧代谢生理特性, 考察结果显示该菌的最大比氧摄取速率和氧亲和常数 K O2 分别为 10.38mmol/(g h) 和 0.104, 发酵过程中影响呼吸代谢的临界氧浓度为 2.4 ~ 2.7mg/ L, 表明该菌对氧有很高的亲和力结合不同比氧摄取速率对胞内微观代谢途径通量影响的考察, 提出了以 OUR 为在线控制参数的分阶段降低供氧调控策略该优化策略成功地用于工业生产放大过程, 使得发酵单位提高了 17.3% [10-12] 此外, 在详细研究维生素 B 12 分批发酵过程不同阶段微观代谢通量变化的基础上, 证实了一定浓度溶解 CO 2 (3.02mmol/L) 能明显促进维生素 B 12 的合成, 而高于 3.5mmol/L 时产物的合成会受到显著抑制, 并伴随副产物粪卟啉的大量合成因此, 在脱氮假单胞菌维生素 B 12 发酵工艺放大过程中, 建立 OUR 和 CO 2 浓度控制, 并与发酵罐中流场混合状态的设计相结合的策略, 成功实现了在 120t 发酵罐中维生素 B 12 发酵水平达到 264mg/L 的目标, 单位维生素 B 12 合成所消耗葡萄糖量减少 34.4%, 并大大降低了动力消耗, 从而提高了生产效益 4 基于细胞生理特性与反应器流场特性相结合的生物过程放大细胞在小试反应器获得了优化的工艺后, 欲在大型反应器实现相同的优化工艺, 关键在于大型反应器中重现小试反应器的细胞生理状态利用各类过程在线检测技术获得细胞在大型反应器中的生理特性, 若其与小试反应器相似, 那么优化的工艺就有可能实现 ; 反之就应对反应器流场特性进行研究, 找到细胞生理代谢差异的原因, 并随之进行反应器结构改造工艺调控策略调整等, 最终实现与小试反应器相同的生理代谢特性, 这就是细胞生理特性和反应器流场特性相结合的生物反应过程放大方法在将头孢菌素 C 小试反应器内优化的工艺直接应用于生产车间 160m 3 反应器时发现, 相同工艺条件下小试反应器中发酵单位可以达到 U/mL, 而 160 m 3 生产反应器中最高只有 ~ U/mL, 同时两个反应器内代谢参数具有很大不同, 尤其体现在 RQ 值上发酵 30h 以内两个反应器的 RQ 值较为接近, 而 30h 后大型反应器的 RQ 值开始上升, 而小试反应器的 RQ 值则处于较低水平这在发酵中后期产物合成阶段 (80h 后 ), 大型反应器的 RQ 值虽然开始下降并最终维持在一定水平, 但仍低于同时期小试反应器的 RQ 值, 这就表明小试反应器中细胞对油的利用比大型反应器充分对两个反应器的发酵液离心后发现均有明显的油层存在, 说明发酵过程中油的补加完全能够满足细胞的消耗另外, 离心后大型反应器油层明显要比小试反应器油层厚, 说明大型反应器中油的混合与利用是工艺放大中一个重要的问题, 这与搅拌设备有很大的关系此外, 头孢菌素 C 合成是一个高耗氧的过程, 因而对反应器的供氧能力要求较高, 通过比较高耗氧阶段大型反应器和小试反应器中溶氧水平的变化发现, 小试反应器可维持 DO 水平在 30% 以上, 而 (1 月 ) 53

6 专题大型反应器中 100h 后 DO 水平就只有 20% 甚至以下可见溶氧水平限制也是工艺放大中一个重要问题原大型反应器中配备的是与菌种引进一起提供的四层径流式 Rushton 桨, 这种桨功率准数很大, 单罐电机功率达到 3kW/m 3, 因此要想提高溶氧有很大困难基于上述分析, 只有改造现有搅拌系统, 才能实现小型反应器优化工艺放大的同时降低功率, 减少生产成本 CFD 数值模拟表明, 平叶涡轮桨产生明显的径向流, 桨间流型相互干扰, 底层搅拌桨与罐底形成迟滞区, 而且气含率分布表明底层桨附近会产生气泛现象最后, 通过加长搅拌桨叶长度, 增加轴向混合的搅拌桨, 头孢菌素 C 在 160m 3 发酵罐上的产量也能达到 U/mL 以上, 从而取得显著的经济效益 [13] 5 总结针对以活体细胞作为主体的细胞大规模培养过程, 生物反应过程具有生命特征细胞代谢的复杂特性, 所以对活体细胞在反应器中的生理状态调控是过程优化与放大的核心, 获知细胞在反应器环境中的生理代谢特性设计合理的反应器系统等是实现生物反应过程优化放大的前提在细胞大规模培养过程优化研究中, 反应器操作条件的变化会影响细胞内微观代谢, 与之相对应的反应器层面宏观代谢情况也会发生变化, 因此必须分别开展细胞微观代谢流和宏观代谢流的研究, 进而分析生物反应器内反应过程中微观与宏观代谢, 实现菌体细胞微观代谢特性的宏观观测与策略调控, 进而完成生物反应过程的优化与放大参考文献 [1] ZHANG S L,CHU J,ZHUANG Y P. A multi-scale study on industrial fermentation processes and their optimization[j]. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,2004,87: [2] 张嗣良, 储炬. 多尺度微生物过程优化 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 2003:34. [3] 华东理工大学. 基于生物信息的发酵过程工艺分析软件 ( 简称发酵之星 )[CP]. 登记号 :2009SR [4] NIE Y S,HUANG M Z,LU J J,et al. Impacts of high betagalactosidase expression on central metabolism of recombinant Pichia pastoris GS115 using glucose as sole carbon source via 13 C metabolic flux analysis[j]. Journal of Biotechnology,2014, 187(19): [5] LU H Z,LIU X Y,HUANG M Z,et al. Integrated isotope-assisted metabolomics and 13 C metabolic flux analysis reveals metabolic fluxredistribution for high glucoamylase production by Aspergillus niger[j]. Microbial Cell Factories,2015,14(1): [6] LI K T,LIU D H,LI Y L,et al. Improved large-scale production of vitamin B 12 by Pseudomonas denitrificans with betaine feeding[j]. Bioresource Technology,2008,99(17): [7] LI K T,LIU D H,LI Y L,et al. An effective and simplified stat control strategy for the industrial fermentation of vitamin B 12 by Pseudomonas denitrificans[j]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2008,31(6): [8] LI K T,LIU D H,LI Y L,et al. Influence of Zn 2+,Co 2+ and dimethylbe idazole on vitamin B 12 biosynthesis by Pseudomonas denitrifi cans[j]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,24(11): [9] WANG Z J,WANG P,LIU Y W,et al. Metabolic flux analysis of the central carbon metabolism of the industrial vitamin B 12 producing strain Pseudomonas denitrificans using 13 C-labeled glucose[j]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers,2012, 43(2): [10] WANG Z J,WANG P,CHU J,et al. Enhance vitamin B 12 production by online CO 2 concentration control optimization in 120m 3 fermentation[j]. Journal of Bioprocessing & Biotechniques,2014, 159:2-9. [11] WANG Z J,WANG P,CHU J,et al. Optimization of nutritional requirements and ammonium feeding strategies for improving vitamin B 12 production by Pseudomonas denitrificans[j]. African Journal of Biotechnology,2011,10(51): [12] WANG Z J,ZHANG Y M,WANG H Y,et al. Improved vitamin B 12 production by stepwise reduction of oxygen uptake rate under dissolved oxygen limiting level during fermentation process[j]. Bioresource Technology,2010,101(8): [13] YANG Y M,XIA J Y,LI J H,et al. A novel impeller configuration to improve fungal physiology performance and energy conservation for cephalosporin C production[j]. Journal of Biotechnology,2012, 161(3): (1 月 )

7 专题基于多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大 Cell culture process optimization and scale-up based on multi-scale parameter related analysis ZHUANG Yingping,TIAN Xiwei,ZHANG Siliang State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai , China Abstract:Due to the metabolism of living cells, multi-scale relationships exist among genetic, cellular and reactor levels in large scale cell culture process. Through detecting physiological and metabolic parameters, and subsequently analyzing their physical and chemical as well as biological relationships, multi-scale observation and regulation could be accomplished in bio-reaction process. This paper introduced that the integrated parameters characterizing cell physiological and metabolic characteristics as well as reactor flow field characteristics should be analyzed integrally for realizing bioprocess optimization and scale-up by the method of combining microscopic and macroscopic metabolism analysis and for achieving bioprocess scale-up by the method of combining cell physiological and flow field characteristic analysis. Key words:multi-scale; parameter related analysis; microscopic and macroscopic metabolism; physiological and flow field characteristics; optimization and scale-up (1 月 ) 55

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<B7E2C3E620B7E2B5D72E6169> SHP8400PMS 过程气体质谱分析仪全面快速稳定上海舜宇恒平科学仪器有限公司 SHP8400PMS 过程气体质谱分析仪 01 反应器因环境基通过尾气的在线分析获得精准的生物过程信息 CER=Q F C in in V 1 ( C C inertia CO2out CO X C 2 CO2in O out C ) 2 CO2out f OUR=Q O2 X F V in C O2in Cin