2 山东大报 ( 医版 ) 53 卷 10 期要成分,Aβ 由淀粉样前体蛋白 (β amyloidprecursor protein,app) 经 β 分泌酶和 γ 分泌酶水解产生因此, 稳定转染 APP SW 的 HEK293 细胞 20E2 可作为 AD 的细胞模型 [1 2] 研究发现,A

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委牧
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1 第 53 卷第 10 期 Vol.53 No.10 山东大报 ( 医版 ) JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) 2015 年 10 月 Oct.2015 文章编号 : (2015) DOI: /j.isn 基础医线粒体自噬在阿尔茨海默病细胞模型中的作用机制赵雪莲 1, 于君 2, 谢兆宏 1, 曹彦军 1, 刘震 1, 王晓 1, 徐琳琳 1, 杨慧 1, 郑晓磊 1, 沈阳 1 1, 毕建忠 (1. 山东大第二医院神经内科, 山东济南 ;2. 山东中医药大附属医院, 山东济南 ) 摘要 : 目的研究阿尔茨海默病细胞模型 20E2 自噬情况及其可能机制方法应用 ELISA 检测体外培养的 HEK293 细胞和 20E2 细胞 ( 稳定转染 APP SW 的 HEK293 细胞 ) 上清 Aβ 1 40 水平 Westernbloting 检测 APP 蛋白表达水平, 确定 20E2 细胞是否建模成功电镜下观察细胞内线粒体,JC 1 检测两种细胞线粒体膜电位, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 Westernbloting 检测 LC3 I PINK1 Parkin 表达水平结果与 HEK293 细胞相比,20E2 细胞 APP 蛋白 Aβ 1 40 表达增加 (P<0.05), 线粒体肿胀嵴消失空泡化明显, 线粒体膜电位下降,PINK1 Parkin 自噬相关蛋白 LC3 I 表达增加 (P<0.05) 结论阿尔茨海默病细胞模型 20E2 线粒体形态改变明显膜电位下降, 这些改变可能通过 PINK1 Parkin 途径引起线粒体自噬增加关键词 : 阿尔茨海默病 ; 线粒体自噬 ; 线粒体膜电位 ;PINK1;Parkin 中图分类号 :R 文献标志码 :A Mechanism ofmitophagyinacelmodelofalzheimer sdisease ZHAOXuelian 1,YUJun 2,XIEZhaohong 1,CAOYanjun 1,LIUZhen 1,WANGXiao 1, XULinlin 1,YANGHui 1,ZHENGXiaolei 1,SHENYang 1,BIJianzhong 1 (1.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,Shandong,China; 2.TheAfiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,Shandong,China) Abstract:Objective ToinvestigatetheefectofautophagyinvolvedinAlzheimer sdiseasecelmodel20e2andits posiblemechanism.methods Todeterminewhetherthe20E2celsmodelwassuccesfulyestablished,wedetectedthe levelsofaβ 1 40 inhek293celsand20e2cels(hek293celsstablyexpresingswedishmutantapp)culturedinvitro byelisakit,andtheexpresionofappproteinlevelwasdetectedbywesternbloting.themitochondriaincelswas observedbyelectronmicroscope.themitochondrialmembranepotentialofbothcelswasdetectedbyfluorescenceprobe JC 1.Flowcytometrywasusedtomeasuretheapoptoticrate.LC3 I,PINK1andParkinweredetectedbyWesternblot ting.results TheexpresionlevelsofAPPproteinandAβ 1 40 increasedin20e2celscomparedwiththoseinhek293 cels.mitochondrialswolen,cristaedisappearedandvacuolizationwasobviouslyobserved.mitochondrialmembranepo tentialdecreased.theexpresionlevelsofpink1,parkinandlc3 Iincreased(P<0.05).Conclusion InAlzheimer s diseasecelmodel20e2,themitochondrialmorphologychangedobviouslyandmembranepotentialofmitochondria declined,andthesechangesmaycausetheincreaseofmitochondrialautophagythroughpink1andparkinpathway. Keywords:Alzheimer sdisease;mitophagy;mitochondrialmembranepotential;pink1;parkin 阿尔茨海默病 (Alzheimer sdisease,ad) 是以进行性的认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统病变, 尚无特效治疗方法老年斑 (senile plaque,sp) 和神经原纤维缠结 (neurofibrilarytan gle,nft) 是 AD 特征性的病理改变, 而 β 淀粉样蛋白 (β amyloidprotein,aβ) 是 AD 患者老年斑的主收稿日期 : ; 网络出版时间 : 网络出版地址 :htp:// 基金项目 : 国家自然科基金 ( , , ); 山东省自然科基金 (ZR2011HM064); 山东省卫生厅科研项目 (2013WS0248) 通讯作者 : 毕建忠 E mail:bjz@sdu.edu.cn

2 2 山东大报 ( 医版 ) 53 卷 10 期要成分,Aβ 由淀粉样前体蛋白 (β amyloidprecursor protein,app) 经 β 分泌酶和 γ 分泌酶水解产生因此, 稳定转染 APP SW 的 HEK293 细胞 20E2 可作为 AD 的细胞模型 [1 2] 研究发现,AD 患者海马区神经元内, 可见正常线粒体数目明显减少, 大量线粒体嵴破坏和线粒体碎片沉积 [3] 线粒体除了能量转化, 还与细胞的自噬与凋亡有关为了维持正常的细胞状态, 需要及时将受损的线粒体清除, 这一过程主要依赖于线粒体自噬线粒体膜上靶向丝氨酸 / 苏氨酸激酶 PTEN 诱导激酶 1(PTEN inducedputa tivekinase1,pink1) 与 E3 泛素连接酶 Parkin 相互作用, 引起线粒体自噬,PINK1 的激酶活性及其线粒体定位序列是 Parkin 易位到去极化线粒体的条件 [4] 微管相关蛋白轻链 3(lightchain3,LC3) 包括 LC3 I 和 LC3 I,LC3 I 被视为检测自噬的特异性标记蛋白本实验探讨 AD 细胞模型 20E2 自噬情况及可能的病理机制, 为 AD 的防治提供理论依据 1 材料与方法 1.1 材料实验细胞 HEK293 细胞 ( 人肾上皮细胞 ) 20E2 细胞 ( 稳定转染 APP 的 HEK293 细胞 ) 由山东大齐鲁医院孙秀莲教授馈赠, 山东大第二医院中心实验室传代培养主要试剂与仪器 DMEM 高糖培养基 ( 美国 HyClone 公司 ), 胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ), G418( 美国 Sigma 公司 ),0.25% 胰蛋白酶 ( 美国 HyClone 公司 ),Aβ 1 40 ELISA 试剂盒 ( 美国 Invitro gen 公司 ),JC 1 线粒体膜电位检测试剂盒 ( 中国碧云天生物技术公司 ),BCA 蛋白定量分析试剂盒 ( 美国 Thermo 公司 ),DAPi( 美国 Sigma 公司 ), 兔源 anti PINK1 抗体 ( 美国 Celsignalingtechnology 公司 ), 兔源 anti App 抗体 ( 美国 Sigma 公司 ), 兔源 anti LC3b 抗体 ( 美国 Sigma 公司 ), 鼠源 anti Parkin 抗体 ( 美国 Celsignalingtechnology 公司 ), 辣根酶标记山羊抗兔 IgG( 北京中杉金桥生物技术公司 ), 辣根酶标记山羊抗鼠 IgG( 北京中杉金桥生物技术公司 ) 37 5% CO 2 细胞培养箱,MultiskanMk3 型酶标仪,4 离心机 ( 美国 Thermo 公司 ), 凝胶成像仪 ( 美国 BIO RAD 公司 ), 电镜 ( 日本电子株式会社 ) 1.2 方法 HEK293 细胞 20E2 细胞培养及处理将 HEK293 细胞作为对照组,HEK293 20E2 细胞在 37 5% CO 2 条件下, 培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖完全培养基, 每 2~3 天传代 1 次, 取对数生长期的细胞进行实验 Westernbloting 检测蛋白表达水平弃细胞培养液,PBS 冲洗细胞 2 次, 加入 0.25% 胰蛋白酶, 置于显微镜下观察, 待细胞趋于变圆时加入完全培养基终止消化 1200r/min 离心 5min, 弃上清, 用预冷的 PBS 冲洗细胞,1200r/min 离心 5min, 重复 3 次, 弃上清, 加入蛋白裂解液, 轻轻吸打, 置于冰上裂解 30min,12000r/min 离心 10min, 吸取上清, BCA 法测定蛋白浓度, 加上样缓冲液,100 变性 5min 制胶 (12% 分离胶,5% 浓缩胶 ), 上样 30μg, SDS PAGE 电泳将蛋白分离, 然后 150mA 恒流将蛋白转移到 PVDF 膜上, 使用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液室温封闭 1h, 将膜放入预先配置好的一抗中,4 冰箱过夜,TBST 溶液洗膜 5min/ 次, 共 3 次二抗室温孵育 2h, 洗膜后 ECL 显色曝光 ELISA 法检测细胞上清 Aβ 1 40 水平取相同数量级 HEK293 20E2 细胞的培养液上清, 按照 ELISA 试剂盒说明书检测 Aβ 1 40, 通过酶标仪检测样品光密度, 并根据标准曲线计算 Aβ 1 40 浓度 JC 1 检测线粒体膜电位水平制备 HEK293 20E2 细胞爬片, 弃原培养液, 在孔板中加入 1mL 新鲜培养液和 1mLJC 1 染色工作液, 充分混匀,37 孵育 20min 吸除上清, 用 JC 1 染色缓冲液洗涤 2 次, 荧光显微镜下观察并拍照电镜观察细胞超微结构弃细胞培养液, PBS 冲洗细胞 2 次, 加入 0.25% 胰蛋白酶, 置于显微镜下观察, 待细胞趋于变圆时加入完全培养基终止消化,1200r/min 离心 5min, 弃上清用 PBS 重悬细胞,3000r/min 离心 10min, 弃上清, 加入戊二醛, 送山东大医院电镜室观察流式细胞仪检测细胞凋亡情况将生长状态良好的 HEK293 20E2 细胞分别用胰酶消化收集, 调整细胞为个 /ml,pbs 冲洗 2 次, 1000r/min 离心 5min, 加入 500μL 结合缓冲液轻轻重悬细胞, 加入 5μLAnnexinV FITC 混匀, 再加入 5μLPI 混匀,4 避光染 30min, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 1.3 统计处理采用 SPSS17.0 Graphpad Prism5.0 软件, 数据以 x±s 珋表示, 组间比较采用 t 检验,P<0.05 为差异有统计意义 2 结果 2.1 Westernbloting 与 ELISA 法检测 APP Aβ 1 40

３赵雪莲等线粒体自噬在阿尔茨海默病细胞模型中的作用机制蛋白表达Ｗｂｇ检测ＡＰＰ蛋白表达量ｇｍｌ两组差异有统计意义Ｐ５表明

９± ９７ｇｍｌ对照组３ ± ９线粒体肿胀嵴消失出现空泡化改变见图Ｅ细胞较对照组图Ｗｂｇ检测ＡＰＰ蛋白表达水平Ｐ５Ｆ

线粒体膜电位较高Ｅ细胞较ＨＥＫ９３细胞红色荧光显著色荧光时Ｊ聚集在线粒体的基质形成聚合物产生红减弱绿色荧光明显增强表

3 ３赵雪莲等线粒体自噬在阿尔茨海默病细胞模型中的作用机制蛋白表达Ｗｂｇ检测ＡＰＰ蛋白表达量ｇｍｌ两组差异有统计意义Ｐ５表明Ｅ细胞较对照组ＡＰＰ表达量明显增加图细胞模型Ｅ建模成功ＥＬＳＡ法检测细胞上清Ａβ ４水平Ｅ细胞Ａβ ４电镜观察细胞超微结构含量４９± ９７ｇｍｌ对照组３ ± ９线粒体肿胀嵴消失出现空泡化改变见图Ｅ细胞较对照组图Ｗｂｇ检测ＡＰＰ蛋白表达水平Ｐ５ＦＴｘｆａｐｐｄｙｗｂｇＰ５图电镜下观察线粒体形态ＦＴｍｇｙｆｍｄｂｖｙｍ３Ｊ检测线粒体膜电位线粒体膜电位较高Ｅ细胞较ＨＥＫ９３细胞红色荧光显著色荧光时Ｊ聚集在线粒体的基质形成聚合物产生红减弱绿色荧光明显增强表明Ｅ细胞较色荧光线粒体膜电位较低时Ｊ为单体产生绿ＨＥＫ９３细胞线粒体膜电位下降见图３图３Ｊ检测线粒体膜电位Ｆ３Ｍｄｍｍｂｄｙｊ

４山４流式细胞仪检测细胞凋亡东大报医版５３卷期线粒体膜电位的照组 ± ３两组无统计差异Ｐ下降可以引起线粒体自噬同时也是细胞凋亡早期５说明Ｅ线粒体膜电位降低主要引起线粒的一个标志Ｅ细胞凋亡率７± 对体自噬见图４图４流式细胞仪检测细胞凋亡Ｆ４Ｃｄｙｆｗｙｍｙ５Ｗｂｇ检测ＬＣ３ＰＮＫＰ蛋白表达

4 ４山４流式细胞仪检测细胞凋亡东大报医版５３卷期线粒体膜电位的照组 ± ３两组无统计差异Ｐ下降可以引起线粒体自噬同时也是细胞凋亡早期５说明Ｅ线粒体膜电位降低主要引起线粒的一个标志Ｅ细胞凋亡率７± 对体自噬见图４图４流式细胞仪检测细胞凋亡Ｆ４Ｃｄｙｆｗｙｍｙ５Ｗｂｇ检测ＬＣ３ＰＮＫＰ蛋白表达Ｅ细胞较对照组ＬＣ３ＰＮＫＰ蛋白表达水平明显增加差异有统计意义Ｐ５见图５图５Ｗｂｇ检测ＬＣ３ＰＮＫＰ蛋白表达Ｐ５ｖＨＥＫ９３Ｆ５Ｔｘｆｌｃ３ＰＮＫｄｐｄｙｗｂｇＰ５ｖＨＥＫ９３跨膜转运在内膜两侧形成电位差即线粒体膜电位３讨论线粒体膜电位下降可以导致一些促凋亡因子的释放引起细胞凋亡线粒体膜电位下降是细胞凋亡ＡＰＰ及其同系物属于保守的单次跨膜蛋白质的一个早期事件９自噬可以防止受损的线粒体释家族ＡＰＰ代谢产物Ａβ沉积形成的老年斑是ＡＤ放促凋亡因子从而阻止细胞凋亡的继续传递患者大脑的特征性病理改变ＡＰＰ经 α 分泌酶 β 分泌酶和 γ 分泌酶降解降解过程分为淀粉样蛋白本实验结果表明Ｅ细胞膜电位下降凋亡与对途径和非淀粉样蛋白途径５ＡＰＰ经 β 分泌酶和分泌酶组成的淀粉样蛋白途径降解产生Ａβ γ ＡＰＰ在线粒体外膜堆积可以导致线粒体功能障碍和能量代谢受损６Ｅ细胞Ａβ表达量明显增照组无明显差异自噬水平较对照组明显增加ＰＮＫＰ途径包括ＰＮＫ和Ｐ两个隐性帕金森连锁基因它们通过调节膜电位钙稳态嵴结构呼吸活动和线粒体ＤＮＡ的完整性等一些生理过程维持线粒体的完整性另外ＰＮＫ加Ａβ可使神经细胞线粒体膜电位显著降低线粒Ｐ途径是清除不正常线粒体的关键３在体肿胀性状发生改变７本实验结果与既往研究ＰＮＫＰ缺失时细胞往往产生线粒体碎相符神经元及其他非神经元细胞通过自噬溶酶体片４在正常的线粒体中因为膜电压抑制的原选择性消除受损线粒体称为线粒体自噬８因ＰＮＫ被迅速降解当线粒体膜电位去极化后线粒体为双层膜结构细胞器外膜通透性较高而内膜通透性很低在内膜上存在质子泵质子的ＰＮＫ才以电压依赖的方式在线粒体外膜上稳定表达５解耦联剂羰基氰化间氯苯腙ｂｙｙ

5 赵雪莲, 等. 线粒体自噬在阿尔茨海默病细胞模型中的作用机制 5 nidechlorophenyhydrazone,cccp) 可以使线粒体膜电位降低, 使用 CCCP 处理细胞可以使 PINK1 表达增加, 并在线粒体稳定表达 [16] PINK1 为 Parkin 的上游分子, 可以通过其激酶活性磷酸化 Parkin, 使 Parkin 定位于膜电位下降的线粒体, 而线粒体自噬可以阻止线粒体依赖的细胞凋亡的继续传递 [17] 自噬特异性标记蛋白 LC3 I 是第一个确定的与自噬体膜相关联的哺乳动物蛋白质 LC3 I 是自噬发生前 LC3 的形式, 自噬发生时,LC3 I 经过泛素样加工修饰, 与自噬小体表面的磷脂酰乙醇胺结合, 发生脂化而形成 LC3 I LC3 I 主要存在于细胞质中,LC3 I 则定位于前自噬体和自噬体 [18 19] 本实验结果表明,AD 细胞模型 20E2( 稳定转染 APP 的 HEK293 细胞 ) 自噬明显增加, 线粒体肿胀, 嵴消失, 线粒体膜电位下降明显, 与线粒体膜电位相关的自噬蛋白 PINK1/Parkin 表达增加, 而细胞凋亡与对照组相比无明显变化, 说明 20E2 自噬增加可能通过 PINK1/Parkin 途径引起然而自噬调节存在多种机制, 该 AD 细胞模型是否还通过其他自噬途径进行调控, 还有待进一步实验证实参考文献 : [1]QingH,ZhouW,ChristensenMA,etal.Degradationof BACEbytheubiquitin proteasomepathway[j].faseb J,2004,18(13): [2]ChenCH,ZhouW,LiuS,etal.IncreasedNF κbsig nalingup regulatesbace1expresionanditstherapeutic potentialinalzheimer sdisease[j].intjneuropsycho pharmacol,2012,15(1): [3]HiraiK,AlievG,NunomuraA,etal.Mitochondrialab normalitiesin Alzheimer sdisease[j]. JNeurosci, 2001,21(9): [4]GeislerS,Holmstrm KM,SkujatD,etal.PINK1/Par kin mediatedmitophagyisdependentonvdac1andp62/ SQSTM1[J].NatCelBiol,2010,12(2): [5]SoldanoA,HasanBA.Beyondpathology:APP,brain developmentandalzheimer sdisease[j].curopin Neurobiol,2014,27: [6]FakevalA,AlikhaniN,BhushanS,etal.Degradation oftheamyloidbeta proteinbythenovemitochondrial petidasome,prep[j].jbiolchem,2006,281(39): [7] 李丽, 张杰, 余焕玲, 等.β 淀粉样肽介导的神经细胞线粒体损伤及机制研究 [J]. 中国食品卫生杂志, 2008,20(2): LILi,ZHANGJie,YUHuanling,etal.Studyondam ageandmechanismofmitochondriaofneuronsinducedby Aβ31 35[J].ChineseJournalofFoodHygiene,2008, 20(2): [8]AmadoroG,CorsetiV,FlorenzanoF,etal.Morpholog icalandbioenergeticdemandsunderlyingthemitophagyin post mitoticneurons:thepink parkinpathway[j].front AgingNeurosci,2014,6:1 18. [9] 刘晓婷, 王延让, 张明. 线粒体介导细胞凋亡的研究进展 [J]. 环境与健康杂志,2013,30(2): LIU Xiaoting,WANG Yanrang,ZHANG Ming.Mito chondria mediatedapoptosis:areview ofrecentstudies [J].JournalofEnvironmentandHealth,2013,30(2): [10] 鲁严, 周梅华. 线粒体自噬和线粒体凋亡及其相关病理生理机制研究进展 [J]. 实用老年医,2011,25 (1): LUYan,ZHOUMeihua.Therelatedpathophysiological mechanism ofmitochondrialautophagyandmitochondria apoptosis:areviewofrecentstudies[j].practgeriatr, 2011,25(1): [11]TrempeJF,andFonEA.Structureandfunctionofpar kin,pink1,anddj 1,thethreemusketeersofneuro protection[j].frontneurol,2013,4:1 11. [12]NarendraD,TanakaA,SuenDF,etal.Parkinisrecrui tedselectively to impaired mitochondriaand promotes theirautophagy[j].jcelbiol,2008,183(5): [13]MatsudaN,SatoS,ShibaK,etal.PINK1stabilizedby mitochondrialdepolarizationrecruitsparkintodamaged mitochondriaandactivateslatentparkinformitophagy [J].JCelBiol,2010,189(2): [14]BüelerH.Mitochondrialdynamics,celdeathandthe pathogenesisofparkinson sdisease[j].apoptosis, 2010,15(11): [15] 李清华, 肖福英. 线粒体自噬最新研究进展 [J]. 国际遗传杂志,2012,35(1): LIQinghua,XIAO Fuying.Advancesintheregulation ofmitophagy[j].intjgenet,2012,35(1): [16]Gómez SánchezR,GeggME,Bravo SanPedroJM,et al.mitochondrialimpairmentincreasesfl PINK1levels bycalcium dependentgeneexpresion[j].neurobiol Dis,2014,62: [17] 杨辉, 左?, 刘雯.Parkin PINK DJ 1 和线粒体功能障碍与帕金森病 [J]. 生命科,2010,22(10): YANGHui,ZUOJi,LIUWen.Parkin,PINK1,DJ 1 andmitochondriadysfunctionwithparkinson sdisease [J].ChineseBuletinofLifeSciences,2010,22(10): [18]KabeyaY,MizushimaN,UenoT,etal.LC3,amam malianhomologueofyeastapg8p,islocalizedinauto phagosomemembranesafterprocesing[j].embo J, 2000,19(21): [19] KadowakiM,Karim MR.CytosolicLC3ratioasa quantitativeindexofmacroautophagy[j].methodsenz ymol,2009,452: ( 编辑 : 周英智 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

2 山东大报 ( 医版 ) 53 卷 10 期 要成分,Aβ 由淀粉样前体蛋白 (β amyloidprecursor protein,app) 经 β 分泌酶和 γ 分泌酶水解产生 因此, 稳定转染 APP SW 的 HEK293 细胞 20E2 可作为 AD 的细胞模型 [1 2] 研究发现,A

2 山东大报 ( 医版 ) 53 卷 10 期要成分,Aβ 由淀粉样前体蛋白 (β amyloidprecursor protein,app) 经 β 分泌酶和 γ 分泌酶水解产生因此, 稳定转染 APP SW 的 HEK293 细胞 20E2 可作为 AD 的细胞模型 [1 2] 研究发现,A