1 期王宏华, 等 : 病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 129 E.coli BL21(DE3) 为本实验室保存 ; 杆状病毒表达截短的 VHSV 病毒 G 蛋白 ( 分子量 49 ku) 由山东省出入境检验检疫中心孙涛博士惠赠 ;pmd18- T 载体 Taq DNA 聚

Size: px

Start display at page:

Download "1 期王宏华, 等 : 病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 129 E.coli BL21(DE3) 为本实验室保存 ; 杆状病毒表达截短的 VHSV 病毒 G 蛋白 ( 分子量 49 ku) 由山东省出入境检验检疫中心孙涛博士惠赠 ;pmd18- T 载体 Taq DNA 聚"

忌顶常
5 years ago
Views:

1 水第 4 卷第 1 期 216 年 1 月产学报 Vol. 4, No. 1 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA 文章编号: 1 615(216) Jan., 216 DOI: /jfc 病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定王宏华 1 侯竹美 2 张全启 1* 于海洋 1 王志刚 1 齐洁 1 王旭波 1 (1. 中国海洋大学海洋生命学院山东青岛青岛农业大学海洋科学与工程学院山东青岛 26619) 摘要为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody ScFv)并鉴定其生物学功能本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总 RNA并反转录获得cDNA模板通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区 (VH)编码序列将其拼接成单链抗体ScFv基因后插入载体pET28a中构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达结果表明单链抗体主要以可溶性形式表达分子量约 28 ku 能特异性识别 VHSV病毒的 G蛋白并对 VHSV病毒具有体外中和活性其对 VHSV病毒的 G蛋白亲和力 (KD)达到 M 单链抗体 ScFv的制备为进一步研究 VHSV的治疗性抗体快速诊断试剂奠定了基础关键词: 鱼病毒性出血性败血症病毒单链抗体中图分类号: Q 785 S 941 文献标志码: A 病毒性出血性败血症 (viral hemorrhagic 3 端至5 端依次包含N-P(M1)-M2-G-NV-L 6个基因分别编码病毒的核蛋白磷蛋白基质蛋白糖蛋白非结构蛋白和聚合酶蛋白由于尚缺乏相应的抗体国内对VHSV病毒进行快速检测的免疫学技术及预防监测方面的研究非常缺乏国标方法仍为细胞培养分离病毒结合中和实验进行确诊 [8] 相对来说检测周期长且灵敏度不高本实验室在前期研究中通过杂交瘤技术获得一株单抗1G5 可与VHSV病毒的所有基因型(I II III和IV)反应且对VHSV病毒有中和作用极具研究和应用价值本研究克隆获得了单抗1G5的单链抗体基因并实现了其原核表达为下一步的抗体改造诊断试剂开发等提供了基础 septicemia VHS)是由病毒性出血性败血症病毒 (viral hemorrhagic septicemia virus VHSV)引起的一种以暴发性流行为主的传染病常引起多种养殖鱼类如虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 牙鲆 (Paralichthys olivaceus)和大菱鲆 (Scophthalmus maximus)等发病死亡率高达9% [1] 由于该病在水产养殖中危害巨大世界动物卫生组织 (Office International Des Epizooties OIE)将其列入水生动物疫病名录我国将其列为二类动物疫病均明确为必须申报的疫病 [2] 该病最早流行于欧洲一些国家 [ 3 ] 1999年扩散至北美洲 [ 4 ] 2年后扩散至亚太地区日本 [5] 韩国 [6] 和中国 [7]均有该病确诊的报道随着我国水产贸易的比重在国际上的快速增加病毒性出血性败血症已对我国渔业生产形成巨大威胁病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus VHSV)属弹状病毒科 (Rhabdoviridae) 直径65 8 nm 有囊膜基因组为一段负义链的单链RNA 长度约12 kb 从收稿日期修回日期: 资助项目国家八六三高技术研究发展计划(211AA1A42) 通信作者张全启 qzhang@ouc.edu.cn 材料与方法实验材料 VHSV病毒 CHSE-214细胞 VHSV中和单抗细胞株1G5 质粒pET28a (+) E.coli DH5α和

2 1 期王宏华, 等 : 病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 129 E.coli BL21(DE3) 为本实验室保存 ; 杆状病毒表达截短的 VHSV 病毒 G 蛋白 ( 分子量 49 ku) 由山东省出入境检验检疫中心孙涛博士惠赠 ;pmd18- T 载体 Taq DNA 聚合酶 T 4 DNA 连接酶限制性内切酶 BamH I Hind III 购自大连宝生物工程公司 ;RNA 提取试剂盒 cdna 合成试剂盒质粒提取及回收试剂盒为天根公司产品 ;HRP 标记抗 His 单克隆抗体为北京华大蛋白公司产品 ; PCR 引物合成与序列测定由南京金斯瑞生物工程公司完成 1.2 RNA 的抽提与 cdna 的合成将 VHSV 中和单抗 1G5 杂交瘤细胞培养至最佳生长状态, 用 RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA, 以总 RNA 为模板, 随机引物为反转录引物, 反转录合成第一链 cdna, 冻存备用 1.3 VH 和 VL 基因的扩增根据鼠源单克隆抗体重链和轻链可变区基因 [9] 的特点, 结合苗向阳等的方法, 设计如下扩增引物, 其中 VH-F 引物加入 BamH I 酶切位点,VL- R 引物加入 Hind III 酶切位点 ( 表 1) 引物 primer VH-F VH-R VL-F VL-R 以杂交瘤细胞 cdna 为模板, 分别进行抗体 VL VH 基因的扩增 PCR 反应体系为 5 µl, 模板 cdna 4 µl,1 Taq buffer 5 µl,dntp 4 µl, H 2 O 34 µl, 正 / 反向引物各 1 µl,taq DNA 聚合酶 1 µl PCR 程序 :94 C 预变性 5 min,94 C 变性 3 s,55 C 退火 3 s,72 C 延伸 4 s,3 个循环 ; 最后 72 C 延伸 1 min 琼脂糖电泳鉴定 PCR 产物并回收表 1 单抗可变区基因 PCR 引物 Tab. 1 Primers for mabs V gene 核酸序列 nucleotide sequence cgcggatccsaggtsmagctgcagsagtcwgg cgagccgccacctccagagccacctccgcctgaggagacggtgaccgtgg ggcggaggtggctctggaggtggcggctcggayattgtgmtsacmcarwctmca ccgaagcttttatttgatttccagcttgg Notes: S = G/C, R = G/A, M = A/C, Y = C/T, W = A/T, V = A/C/G 1.4 单链抗体 ScFv 的拼接与扩增采用重叠延伸 PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR) 法, 将回收的含有 linker 的 VL VH 基因进行拼接 PCR 反应体系为 5 µl,1 Taq buffer 5 µl,dntp 4 µl,h 2 O 36 µl,taq DNA 聚合酶 1 µl, 回收的 VL VH 基因按 1 1 比例各加入 2 µl PCR 程序 :94 C 预变性 5 min,94 C 变性 3 s,55 C 退火 3 s,72 C 延伸 4 s,1 个循环 PCR 结束后, 体系中补加引物 VH-F 和 VL-R 各 1 µl, 扩增全长 ScFv,PCR 反应条件 :94 C 预变性 5 min,94 C 变性 3 s, 55 C 退火 3 s,72 C 延伸 4 s,3 个循环 ; 最后 72 C 延伸 1 min 琼脂糖电泳鉴定 PCR 产物将 PCR 产物连入 pmd18-t 载体并转入 E.coli DH5α, 阳性克隆菌株送南京金斯瑞生物工程公司测序 1.5 单链抗体 ScFv 原核表达与纯化将测序正确的抗 VHSV 单链抗体基因用 BamH I 和 Hind III 双酶切连入 pet28a(+) 载体, 转化表达菌株 E.coli BL21(DE3), 筛选阳性克隆阳性克隆转入少量含卡那霉素的 LB 液体培养基中, 37 C 培养过夜作为种子液种子液按 1% 比例接种于 LB 培养基 ( 含卡那霉素 ) 中,37 C 培养至对数生长期, 加入终浓度 1 mm 的 IPTG 进行诱导表达, 并将重组菌体超声破碎后用镍离子螯合柱纯化, 获得抗 VHSV 单链抗体, 灰度扫描法计算蛋白纯度,Bradford 法测定蛋白浓度, 2 C 保存备用 1.6 单链抗体 ScFv 的 Western-Blot 鉴定 SDS-PAGE 电泳重组 VHSV 病毒 G 蛋白, 电泳结束后转硝酸纤维素膜, 转移结束后将膜用含 5% 脱脂乳的 PBST 4 C 封闭过夜用 PBST 洗膜 1 次, 加入 5 倍稀释的抗 VHSV 单链抗体作为一抗, 于 37 C 摇床温育 1 h,pbst 洗涤 3 次, 加入 5 倍稀释的 HRP 标记抗 His 单克隆抗体作为二抗, 于 37 C 摇床温育 1 h,pbst 洗涤 2 次, 再用 PBS 洗涤 2 次, 加入 DAB 底物显色液显色, 鉴定抗 VHSV 单链抗体的结合活性 1.7 单链抗体 ScFv 的体外中和活性 [1] 参考 Zhou 等方法, 将抗 VHSV 单链抗体进行 2 倍倍比稀释 ( ng/µl), 分别与 1TCID 5 的 VHSV 等体积混合,18 C 作用 1 h 取单链抗体 -VHSV 病毒混合液 2 µl, 加入在 96 孔板中新鲜制备的单层 CHSE-214 细胞,18 C 培养, 同时设立单抗

13 水产学报 4 卷 1G5组 VHSV攻毒组和正常培养组作为对照在28 ku处有一产物条带与推算的ScFv蛋白大观察细胞病变小相符表达量约占菌体总蛋白的2% 镍柱纯 1.8 单链抗体ScFv的亲和力测定采用表面等离子共振技术 (surface plasmon 化后ScFv蛋白纯度在9%以上(图3) 2.

3 13 水产学报 4 卷 1G5组 VHSV攻毒组和正常培养组作为对照在28 ku处有一产物条带与推算的ScFv蛋白大观察细胞病变小相符表达量约占菌体总蛋白的2% 镍柱纯 1.8 单链抗体ScFv的亲和力测定采用表面等离子共振技术 (surface plasmon 化后ScFv蛋白纯度在9%以上(图3) 2.3 单链抗体ScFv的Western blot鉴定 resonance SPR)测定单链抗体的亲和力将 Western blot 结果表明在分子量大小4 55 VHSV病毒 G蛋白固定在 BIAcore3仪器的 ku处可见特异色带由于重组VHSV病毒的G蛋 CM5芯片上流速设为 1 µl/min 单链抗体白分子量约为 49 ku 说明所表达的单链抗体 ScFv设7个浓度梯度( ScFv与VHSV病毒的G蛋白有结合活性(图4) 32 nm) 反应 7 s 每个稀释度反应后用 mm Glycine (ph 3.)再生18 s BIAcore3仪器自带软件计算ScFv的亲和力常数 2 结果单链抗体ScFv的体外中和活性细胞中和实验表明重组表达的抗VHSV单链抗体具有较高的中和活性 2.5 ng/µl的scfv就可以保护CHSE-214细胞免受VHSV病毒攻击与原始毒株相比差别不大(表2) 2.1 单链抗体ScFv的获得 2.5 以VHSV中和单抗1G5的cDNA基因序列为模板 PCR扩增出VL VH抗体基因并通过SOEPCR拼接获得其ScFv基因结果显示 VH 基因片段约为 342 bp VL基因片段约为 333 bp ScFv基因片段约为75 bp 与预期基因片段大小相符(图1 2) 将ScFv基因测序后在GenBank数据库中进行核苷酸同源性比较结果表明所扩增序列与GenBank 中鼠的免疫球蛋白可变区基因同源性最高符合鼠源抗体可变区的基因排序证明克隆获得的是VHSV中和单抗1G5的单链抗体基因 2.2 单链抗体ScFv的原核表达与纯化抗VHSV单链抗体的亲和力 BIAcore3检测VHSV病毒单链抗体的亲和力纯化后的单链抗体 ScFv对重组 VHSV病毒 G蛋白的结合速率(ka)为 /Ms 解离速率 (kd)为 /s 亲和力(KD)达到 M 根据BIAcore3仪器说明强的抗原抗体的亲和力为 1 8 ~1 1 M 说明纯化后的单链抗体 ScFv对重组VHSV病毒G蛋白具有较高亲和力但低于原始单抗1G5的亲和力( M 表3) 3 讨论 VHSV可感染虹鳟牙鲆大菱鲆等8多种淡水和海水鱼类且在欧洲北美洲东亚均构建原核表达载体pET28a-ScFv并进行诱导已发现其存在 [11] 基于VHSV病毒的N基因或G基表达从SDS-PAGE电泳图可以看出重组菌株因序列的进化树分析表明 VHSV病毒分为4个基因型(I II III IV) 其中I型又分为Ia Ib Ic Id 和Ie 5个亚型 IV型又分为IVa IVb和IVc 3个亚型 [12] 由于VHSV病毒拥有较多的基因型且可在多个种属鱼类中携带建立快速准确的 VHSV病毒检测方法无疑对阻止其在世界范围内传播具有重要意义 VHSV病毒检测方法在国外的研究较早大致可分为分子生物学方法和免疫学方法两大类其中分子生物学方法主要包括反转录-聚合图1 SOE-PCR法扩增的 ScFv基因电泳图 M. DNA分子质量标准 1. VH基因 2. VL基因 3. ScFv基因 4. ScFv基因 Fig. 1 ScFv gene amplified by SOE-PCR M. DL2; 1. VH; 2. VL; 3. ScFv; 4. ScFv 酶链反应(RT-PCR) [13] 实时荧光定量PCR(Realtime PCR) [14] 和逆转录环介导等温扩增技术(RTLAMP)[15]等免疫学方法主要包括中和实验免疫荧光免疫组化酶联免疫法(ELISA) [16] 等基于血清学检测的酶联免疫法(ELISA)在VHSV病

4 1 期王宏华, 等 : 病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 131 图 2 ScFv 抗体基因序列 Fig. 2 Gene sequence of ScFv antibody 毒检测中具有快速准确和操作简单等特点, 备受国内外关注 ELSIA 方法需要高特异性和敏感性的抗体, 而国内对 VHSV 病毒的抗体研究相 [7] 对比较缺乏, 仅见景宏丽等少量报道, 且未见进行下一步功能性鉴定的数据本实验室用超速纯化的 VHSV 病毒免疫小鼠后筛选获得一株单抗 1G5, 其为 VHSV 病毒特异性抗体, 与鲤 (Cyprinus carpio) 春病毒血症病毒 (spring viremia of carp virus,svcv) 传染性造血组织器官坏死病毒 (infectious hematopoietic necrosis virus,ihnv) 均无交叉反应单链抗体 (ScFv) 是将抗体的重链可变区 (VH) 与轻链可变区 (VL) 用 Lingker 连接起来获得的一种基因工程抗体, 它保留了完整抗体的特异性, 在血液内更容易被清除, 组织穿透力更强, 且可以通过计算机结构模拟和氨基酸替换等方法提高其抗体活性本研究利用实验室保存的 VHSV 病毒单抗 1G5 的杂交瘤细胞株, 通过 PCR 方法扩增了其单链抗体 ScFv 基因全长, 约 75 bp VH VL 基因片段符合鼠源抗体可变区的排列结构,Blast 比对表

132 水产学报 4 卷表2 Tab. 2 ScFv对VHSV病毒的体外中和活性 The neutralizing activity of ScFv against VHSV ScFv 浓度/(ng/µL) ScFv concentration 病变率/% percent of CPE 1 5 2.5 1.25.

3 单链抗体ScFv的原核表达与 Kinetics parameters of ScFv proteins binding to G protein of VHSV 纯化的SDS-PAGE检测 M. 预染的蛋白质分子质量标准 1. 纯化的单链抗体蛋白 2. 单链抗体基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物 3. pet28a 空载体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物 Fig.

5 132 水产学报 4 卷表2 Tab. 2 ScFv对VHSV病毒的体外中和活性 The neutralizing activity of ScFv against VHSV ScFv 浓度/(ng/µL) ScFv concentration 病变率/% percent of CPE G5 5 ScFv 5 1 VHSV对照 VHSV control 正常对照 normal control 表3 图3 ScFv与纯化的VHSV病毒G蛋白结合的动力学参数 Tab. 3 单链抗体ScFv的原核表达与 Kinetics parameters of ScFv proteins binding to G protein of VHSV 纯化的SDS-PAGE检测 M. 预染的蛋白质分子质量标准 1. 纯化的单链抗体蛋白 2. 单链抗体基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物 3. pet28a 空载体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物 Fig. 3 SDS-PAGE of the expression and ka/(1/ms) kd/(1/s) KD/(M) 单抗 1G5 MAb 1G 单链抗体1G5 ScFv 1G purification of ScFv protein M. prestained Pr; 1. purified ScFv protein; 2. the expression product of 的基因工程抗体目前鱼类病毒的单链抗体研究较少本研究 ScFv gene recombinant in BL21(DE3); 3. the expression product of pet28a vector in BL21(DE3) 的开展一方面为VHSV病毒的诊断试剂开发基因工程抗体改造提供了物质基础同时也为其他鱼类疾病的研究提供了借鉴参考文献 [1] Brudeseth B E, Evensen O. Occurrence of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in wild marine fish species in the coastal regions of Norway [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 22, 52(1): [2] 图4 单克隆抗体的制备及其特性分析[J]. 细胞与分子免疫 ScFv原核表达产物的Western-blot分析学杂志, 213, 29(4): M. 预染的蛋白质分子质量标准 1.单链抗体蛋白 Fig. 4 景宏丽, 王静波, 曹欢, 等. 病毒性出血性败血症病毒 Western-blot analysis of the expression product Jing H L, Wang J B, Cao H, et al. Preparation and of recombinant ScFv gene in BL21(DE3) characterization of monoclonal antibodies against viral hemorrhagic septicemia virus [J]. Chinese Journal of M. prestained Pr; 1. ScFv Cellular and Molecular Immunology, 213, 29(4): 明同源性与鼠源单链抗体基因最高原核表达的抗VHSV单链抗体可以中和VHSV病毒对CHSE (in Chinese). [3] Mortensen H F, Heuer O E, Lorenzen N, et al. Isolation 214细胞的攻击与杆状病毒表达的VHSV病毒 of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from G蛋白有免疫印迹反应且与VHSV病毒G蛋白的 wild marine fish species in the Baltic Sea, Kattegat, 亲和力(KD)高达1.4 1 Skagerrak and the North Sea [J]. Virus Research, 1999, 8 M 证明本研究获得的单链抗体确实为VHSV病毒的功能性抗体本研究获得的单链抗体与原始单抗1G5具有相似的生 63(1 2): [4] Hedrick R P, Batts W N, Yun S, et al. Host and 物学活性但其制造成本更低更利于长期保 geographic range extensions of the North American 存且便于进一步改造获得效价和特异性更高 strain of viral hemorrhagic septicemia virus [J]. Diseases

6 1 期王宏华, 等 : 病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 133 of Aquatic Organisms, 23, 55(3): antibodies against viral hemorrhagic septicaemia virus [ 5 ] Takano R, Nishizawa T, Aritmoto M, et al. Isolation of by flow cytometry [J]. Journal of Virological Methods, viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from wild 215, 219: Japanese flounder, Paralichthys olivaceus [J]. Bulletin of [11] He M, Yan X C, Liang Y, et al. Evolution of the viral the European Association of Fish Pathologists, 2, hemorrhagic septicemia virus: Divergence, selection and 2(5): origin [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 214, [ 6 ] Kim S M, Lee J I, Hong M J, et al. Genetic relationship 77: of the VHSV (viral hemorrhagic septicemia virus) [12] Einer J K, Ahrens P, Forsberg R, et al. Evolution of the isolated from cultured olive flounder, Paralichthys fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus olivaceus in Korea [J]. Journal of Fish Pathology, 23, [J]. Journal of General Virology, 24, 85(5): 16(1): [ 7 ] Zhu R L, Zhang Q Y. Determination and analysis of the [13] Knüsel R, Bergmann S M, Einer J K, et al. Virus complete genome sequence of Paralichthys olivaceus isolation vs RT-PCR: Which method is more successful rhabdovirus (PORV) [J]. Archives of Virology, 214, in detecting VHSV and IHNV in fish tissue sampled 159(4): under field conditions? [J]. Journal of Fish Diseases, [ 8 ] 翁善钢. 病毒性出血性败血症的流行与诊断 [J]. 水产 27, 3(9): 养殖, 214(2): [14] Kim J O, Kim W S, Kim S W, et al. Development and Wong S G. Prevalence and diagnosis of viral application of quantitative detection method for viral hemorrhagic septicaemia [J]. Journal of Aquaculture, hemorrhagic septicemia virus (VHSV) genogroup IVa 214(2): 49 5 (in Chinese). [J]. Viruses, 214, 6(5): [ 9 ] 苗向阳, 邵建军, 朱瑞良, 等. 天然鼠源噬菌体抗体库 [15] Soliman H, El M M. Reverse transcription loop- 的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选 [J]. 中国农 mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid 业科学, 29, 42(1): detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS) Miao X Y, Shao J J, Zhu R L, et al. Construction of [J]. Veterinary Microbiology, 26, 114(3 4): naive mouse phage antibody library and screening of [16] Encinasa P, Gomez C E, Estepa A, et al. An ELISA for monoclonal antibodies specific for sheep inhibin [J]. detection of trout antibodies to viral haemorrhagic Scientia Agricultura Sinica, 29, 42(1): (in septicemia virus using recombinant fragments of their Chinese). viral G protein [J]. Journal of Virological Methods, [1] Zhou Y, Xie Z G. High throughput screening of scfv 211, 176(1 2):

7 134 水产学报 4 卷 Prokaryotic expression and functional verification of ScFv antibody against viral hemorrhagic septicemia virus WANG Honghua 1, HOU Zhumei 2, ZHANG Quanqi 1*, YU Haiyang 1, WANG Zhigang 1, QI Jie 1, WANG Xubo 1 (1. College of Marine Life, Ocean University of China, Qingdao 2663, China; 2. College of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 26619, China) Abstract: The aim of this study is to prepare the ScFv antibody (single chain variable fragment antibody) against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) and analyze the biological properties. The variable heavy (VH) and the variable light (VL)chain gene fragments were derived from mab 1G5 hybridoma cells against VHSV. The VH and the VL DNA fragments were assembled through a flexible linker DNA to generate ScFv DNA that was cloned subsequently in the pet28a vector to express ScFv protein in E.coli cells. The expressed ScFv protein, with a relative molecular mass of about 28 ku, existed in a form of soluble expression in cytoplasma. The ScFv protein could specifically identify VHSV glycoprotein (G), and neutralize viral virulence of VHSV in vitro. The ScFv protein showed good affinity for VHSV glycoprotein (G) antigen, as indicated by KD values of M. ScFv protein preparation has laid a foundation for further study of VHSV therapeutic antibodies as well as rapid diagnostic reagent. Key words: fish; viral hemorrhagic septicemia virus; ScFv antibody Corresponding author: Zhang Quanqi. qzhang@ouc.edu.cn Funding projects: National High Technology Development Plans (211AA1A42)

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌