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1 第 14 卷第 4 期 南方水产科学 Vol.14,No 年 8 月 South China Fisheries Siene Aug.,2018 doi: /j.issn 斑节对虾 2 种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究 吴勉之 1, 2, 杨丽诗 1, 周发林 1, 3, 黄建华 1, 3, 姜松 1, 杨其彬 1, 江世贵 (1. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 ; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 ; 3. 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地农业部斑节对虾遗传育种中心, 广东深圳 ) 1 摘要 : 在斑节对虾 (Penaeus monodon) 体内新发现了 2 种高血糖激素 (rustaean hyperglyemi hormone, CHH) 家族基因 PmCHH 和 PmHHLPP 基因组分析结果显示, 其均具有 CHH-Ⅰ 型基因基本的 信号肽 -CPRP- KR/ER/RR- 成熟肽 结构, 且与已报道的 CHHs 基因的基因组结构相似 ; 聚类分析结果显示, 尽管 PmCHH 和 PmHHLPP 与多个 CHHs 基因序列相似性超过 50% ( 最高达 99%), 但与其聚为一支的基因均不是 CHH-Ⅰ 型基因 ; 生物信息学分析结果显示,PmCHH 和 PmHHLPP 的转录起始位点 A 及其核心启动子区域分别位于开放阅读框 (ORF) 上游的 99 bp 和 190 bp, 同时在预测其空间结构后发现, 两者的三维结构中均含有 4 个 α 螺旋构型 ; 组织表达结果显示,2 个基因均在肠中有较高的表达量, 而 PmCHH 在鳃 PmHHLPP 在眼柄中表达量也较高, 但在肝胰腺和肌肉中表达量较低 ; 幼体发育阶段表达结果显示,2 个基因在无节幼体 Ⅲ~Ⅳ 期 溞状幼体 Ⅰ 期和糠虾幼体期表达量均有较大波动, 与代谢强度呈弱相关关系 根据其一级结构的特征和相关表达情况, 可推测 PmCHH 和 PmHHLPP 均为 CHHs 家族基因 关键词 : 斑节对虾 ; 甲壳动物高血糖激素 ; 基因组结构 ; 表达分析 ; 幼体发育中图分类号 : S 文献标志码 : A 文章编号 : (2018) Genome sequene analysis and expression of two CHH genes in tiger shrimp (Penaeus monodon) WU Mianzhi 1, 2, YANG Lishi 1, ZHOU Falin 1, 3, HUANG Jianhua 1, 3, JIANG Song 1, ZHU Caiyan 1, JIANG Shigui 1 (1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resoures Exploitation & Utilization, Ministry of Agriulture; South China Sea Fisheries Researh Institute, Chinese Aademy of Fishery Sienes, Guangzhou , China; 2. College of Fisheries and Life Siene, Shanghai Oean University, Shanghai , China; 3. Researh Centre for Blak Tiger Shrimp Heredity and Breeding, Ministry of Agriulture; Shenzhen Experimental Station of South China Sea Fisheries Researh Institute, Chinese Aademy of Fishery Sienes, Shenzhen , China) Abstrat: Two genes enoding rustaean hyperglyemi hormones, named as PmCHH and PmHHLPP, were found in tiger shrimp (Penaeus monodon). In the analysis of genomi sequene, a typial domain of CHH-I gene alled CPRP (CHH preursor-re- 收稿日期 : ; 修回日期 : 资助项目 : 现代农业 ( 虾蟹 ) 产业技术体系建设专项 (CARS-48); 广东省海洋渔业科技攻关与研发项目 (A201701A01); 广东省科技创新青年拔尖人才项目 (2015TQ01N583); 深圳市战略性新兴产业发展专项 ( ) 作者简介 : 吴勉之 (1992 ), 男, 硕士研究生, 从事甲壳动物高血糖家族激素研究 @qq.om 通信作者 : 江世贵 (1964 ), 男, 博士, 研究员, 从事水产动物遗传育种研究 jiangsg@ssfri.a.n

2 28 南方水产科学第 14 卷 lated peptide) was found between the signal and the mature peptides in these two genes, and all aligned sequenes shared a homogeneous struture of genome. They were alike other CHHs when being blasted in the NCBI. The similarity was over 50% and the maximum was 99%. Besides, PmCHH and PmHHLPP were lustered with the non-chh-i genes in the phylogeneti analysis. The bioinformatis analysis of their sequenes predits that the transription initiation site "A" as well as its ore promoter region in both genes loated at 99 bp and 190 bp upstream of the ORF (open reading frame), and both had four α-helies in the preditive proteins. The expression analysis of different tissues and larval development of P.monodon provides evidene that PmCHH and PmHHLPP ould not be easily identified as hyperglyemi genes: the highest expression level was deteted in gut, while they expressed low in tissues regulating blood gluose, hepatopanreas and musle. For the larval development, the stages of Nauplius Ⅲ-Ⅳ, Zoea Ⅰ and Mysis witnessed the peaks and delines of the expression of both genes, whih seemed irrelevant to glyemi regulation. In onlusion, PmCHH and PmHHLPP ould be identified as members of the CHH family aording to their CHH-I like struture. Key words: Penaeus monodon; Crustaean hyperglyemi hormone; genome; expression analysis; larval development 甲壳动物高血糖激素家族 (Crustaean hyperglyemi hormone,chhs), 是蜕皮动物尤其甲壳 动物维持内稳态平衡的一类重要激素 [1] 目前已探 明位于眼柄处 ( 无眼柄的等足类及部分有眼柄生 物, 窦腺位于头部近脑侧 [2] ) 的 X 器官窦腺复合体 (X-organ-sinus gland,xo-sg) 是该家族激素最主 要的合成和分泌场所 [3] 经 XO-SG 分泌后的神经 [4] 肽, 包括属于 CHH-Ⅰ 型的 CHH ITP (ion transport peptide) 和目前报道的几种基因同源产物 [1,5-6], 以及属于 CHH-Ⅱ 型的 VIH/GIH (vitellogenesis-inhibiting hormone/gonad-inhibiting hormone) MIH (molt-inhibiting hormone) 和 MOIH (mandibular or- [3] gan-inhibiting hormone) 等, 经体液运输作用到机 体各处 作为甲壳动物眼柄中含量最丰富的激素 [7-8], CHHs 主要参与机体的血糖调节 [3], 并在肌肉和肝 脏中发挥其 高血糖 功能 [9], 以满足机体需求, 同时适应外界环境的刺激 [10] CHHs 被发现在多种 组织中普遍表达, 包括眼柄神经 脑神经 胸腹神 经 肝胰腺 肠 胃 肌肉等 [3,8,11-15] [16], 同时在表皮 [17] 和精荚中也有表达, 这与其参与能量调节以外的 多种功能相一致 [18] 目前普遍认为 CHHs 基因的最主要特征是其成 熟肽上 6 个高度保守的半胱氨酸残基, 以及由此形 成的 3 个二硫键 (Cys 7 -Cys 43 Cys 23 -Cys 39 Cys 26 - Cys 52 ) [19-21] 此外,CHH-Ⅰ 型基因的氨基酸序列还 具有基本的 信号肽 -CPRP (CHH preursor-related peptide,chh 序列相关前导肽 )-KR/ER/RR- 成熟 肽 结构, 其中 CPRP 结构是区分 Ⅰ 型和 Ⅱ 型基因 的基本标志 目前在 NCBI 上公布的斑节对虾 (Penaeus monodon) CHHs 基因均为较早之前的报道 [22-25], 2005 年后仅有 1 个 [26], 且其功能各不相同 Keller [3] [4] [27] Böking 等和 Webster 等报道同物种内以及不 同物种之间均可能含有多种结构和功能不完全相同 的 CHHs 基因的情况 本研究在斑节对虾中新发 现 2 个高血糖激素基因 PmCHH 和 PmHHLPP, 进 一步丰富了斑节对虾 CHHs 家族成员 ; 另外, 通过 研究其基因组序列结构以及这 2 种基因在不同组织 和幼体发育阶段的表达情况, 并综合结构与功能同 其他基因进行对比分析, 也为研究这种多态多效性 现象提供新的样本, 从而为进一步了解 CHH 基因 在斑节对虾体内的调控机制 丰富对 CHHs 家族的 结构和功能的认识提供有益的借鉴 1 材料与方法 1.1 实验动物与日常管理 实验所需斑节对虾均来自中国水产科学研究院 南海水产研究所深圳试验基地农业部斑节对虾遗传 育种中心, 体质量为 (45.20±4.62) g, 体长为 (15.90±1.37) m, 暂养于室内车间水泥池 (1.84 m 1.70 m 1.73 m) 中, 养殖温度为 27~30, 盐度为 25~30, 溶氧充足, 自然采光 从中挑选体质健 康 无损伤的雌 雄对虾各 3 尾进行解剖取样, 获 得肝胰腺 肠 胃 眼柄神经 淋巴 肌肉 卵 巢 精巢等组织样品 ( 取 3 组平行样品 ), 其中眼柄 神经获取方法为, 在眼柄伸展情况下自眼柄基部将 其剪下, 去掉眼球部分后用镊子将尖端内露出的白 色条状部分夹出, 此为眼柄神经 将组织置于 RNAlater 稳定剂 (Ambion, 美国 ) 中保存 ; 另取少 量肌肉样品置于 95% 乙醇中常温保存备用 斑节对虾幼体发育不同时期的样品采集于基地 夏季繁育过程中 将完成人工授精 卵巢发育成

3 第 4 期吴勉之等 : 斑节对虾 2 种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究 29 熟 ( 暗绿色 ) 的雌性斑节对虾单独放于 50 m 3 黑桶中 暂养, 产卵后捞取部分受精卵作为样品保存, 余下 受精卵经 10~12 h 孵化 ( 进入无节幼体期 ) 以供后续 [28] 取样 根据江世贵所描述的斑节对虾幼体发育不 同时期的特征, 依次对无节幼体期 6 个时期 溞状 幼体期 3 个时期 糠虾幼体期 3 个时期及仔虾期进 行观察取样 ( 取 3 组平行样品 ), 并置于 RNAlater 稳定剂中保存 1.2 总 RNA 提取及 Real Time RT-PCR 的 DNA 制备 所有用于组织表达和幼体发育表达分析的样品 均通过 HiPure Fibrous RNA Plus Kit (Megan, 中 国 ) 试剂盒提取总 RNA 将溞状幼体期后可明显观 察到幼体颗粒的样品经匀浆机研磨并加入试剂盒所 提供的 Proteinase K 进行消化, 而后与其他样品一 同按照说明书进行抽提 琼脂糖凝胶电泳及 Nano- Drop Tehnologies 检测仪检测 RNA 完整性 然后 按照 TaKaRa 公司 PrimeSript TM RT reagent Kit with gdna Eraser 所述方法进行定量模板 DNA 合 成, 并储存于 基因组 DNA 抽提 基因组 DNA 提取按照 Megan 公司 HiPure Tissue DNA Mini Kit 组织 DNA 小量抽提试剂盒说明 书进行, 经琼脂糖凝胶电泳检测无误后储存于 20 备用 1.4 PmCHH 和 PmHHLPP 基因组的序列验证 在本斑节对虾转录组 ( 暂未公开 ) 中筛选得到 斑节对虾高血糖神经肽 PmCHH 和 PmHHLPP 的序 列信息, 将其与本实验室的斑节对虾基因组文库进 行比对, 获得这 2 个基因的基因组信息 使用 Primer Premier 5.0 软件设计基因组特异性引物 ( 表 1), 对所获得的基因组进行分段验证 使用 TaKaRa 公 司的 Ex Taq 酶, 以抽提得到的基因组 DNA 为模板 进行 PCR 扩增 PCR 反应体系为 50 μl, 反应条 件为 :1) 94 3 min;2) s s s,35 个循环 ;3) 72 5 min PCR 产物 经 1.8% 琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收处理, 并与 pmd19-t 载体 (TaKaRa, 中国 ) 连接 1 h 随 后转入感受态大肠杆菌中, 通过蓝白斑筛选获得阳 性克隆, 每个基因挑取 8 个菌落送往北京睿博兴科 生物技术有限公司广州分公司进行测序, 将所获得 的测序结果与基因组信息进行比对, 以进行序列 验证 1.5 PmCHH 和 PmHHLPP 的进化树构建和生物信息学预测在 NCBI 网站 ( ast.gi) 上对 PmCHH 和 PmHHLPP 进行 BLAST 比对, 利用 MEGA 7.0 软件对所得结果进行进化树构建 利用 SignalP 4.1 Server ( 预测氨基酸序列是否具有一般 CH- Hs 家族基因的信号肽结构 ; 通过 IBS 构建 2 个基因的基因组和其他已报道基因组的结构化模型 ; 在 SWISS-MODEL 网站 ( sy.org) 上尝试虚拟出功能蛋白的三维结构模型 ; 用在线 NNPP 2.2 服务器 ( tools/promoter.html) 预测 5 - 非编码区 (UTR) 结构中的核心启动子区域和转录起始位点 1.6 PmCHH 和 PmHHLPP 的组织表达和幼体发育表达分析利用 Beaon Designer 7.0 软件设计表达分析所需的荧光定量引物 PmCHH-qPCR-F/R 和 PmH- HLPP-qPCR-F/R ( 表 1), 使用在斑节对虾组织表达过程中更稳定表达的 EF-1α (elongation fator 1α, GenBank 号为 DQ021452) 作为内参基因 [29] Ta- KaRa 公司的 TB Green TM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) 为主要试剂, 通过 Rohe Light- Cyler 480 Ⅱ (Rohe, 德国 ) 完成 PmCHH 和 Pm- HHLPP 的组织表达和幼体发育表达分析 反应体系为 12.5 μl, 包括上下游引物各 0.5 μl,super Mix 5.25 μl,ddh 2 O 4.25 μl, 模板 DNA 1 μl ( 约 40 ng), 反应条件依照试剂推荐条件进行两步法扩增 每个组织的 3 个平行均进行检测, 每个样品设置内参对照和 3 个孔作为重复, 并设置了阳性和阴性对照 利用附带软件分析溶解曲线, 以眼柄神经 / 受精卵中基因的平均表达强度 (C t 值 ) 作为单位 1, 用 2 ΔΔCt 法计算基因 mrna 的相对表达量, 在统计分析软件 SPSS 24.0 中对实验结果进行单因素方差 (One-Way ANOVA) 分析, 并计算差异显著性 (Turkey), 然后在 Sigmaplot 7.0 软件中绘制表达结果分析图 2 结果 2.1 基因组序列分析与生物信息学预测利用 DNAMAN 8 将测序结果进行拼接 结果显示,PmCHH 基因组序列全长 bp (Gen-

4 30 南方水产科学第 14 卷 表 1 实验所用的引物及其序列 Tab.1 Primers and their sequenes used in this experiment 引物 primer 引物序列 primer sequene 作用 funtion 产物长度 /bp produt size PmHHLPP-GF1 PmHHLPP-GR1 PmHHLPP-GF2 PmHHLPP-GR2 PmHHLPP-GF3 PmHHLPP-GR3 HHLPP-qPCR-F HHLPP-qPCR-R PmCHH-GF1 PmCHH-GR1 PmCHH-GF2 PmCHH-GR2 PmCHH-GF3 PmCHH-GR3 CHH-qPCR-F CHH-qPCR-R EF-1α-qPCR-F EF-1α-qPCR-R GAGTGAGAACGCAGTTACAGGT GACGAAGACGAGGACGACA CGACCACAGCGTGAACAA GAATAGCGGAGAAACATAGCC GGCTATGTTTCTCCGCTATTC GACTCCTGTCCTTTACTTCCCTA CTACAACCTGTACCGCAAGCCCTA TTACTGAACCTCTGATTCACGAAGC GGGAACTCTAGTATAACTGTAGCCA TTCGGGAACAACGGACC GCTTGGACTGCCAGAACAT GCATCCGTAGAAGACCTGTG CACAGGTCTTCTACGGATGC TCAGCTGTAACGATTTCTGTTC GTTCGCCGTCAGAAGAA GCAGTCCAAGCACACATTG AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT CGTGGTGCATCTCCACAGACT 基因组序列验证 基因组序列验证 246 基因组序列验证 469 Real-time RT-PCR 75 基因组序列验证 457 基因组序列验证 313 基因组序列验证 269 Real-time RT-PCR 100 Real-time RT-PCR 73 Bank 登录号 :MG888660),PmHHLPP 基因组序列全长 bp (GenBank 登录号 :MG888661), 2 个基因的编码区域内都包含了 3 个外显子和 2 个内含子, 另外在 3 -UTR 中还另外包含了 1 个内含子 进一步对目前已报道的 19 个 CHH-Ⅰ 型基因 ( 从 NCBI 上获得,GenBank 号和物种名称详见图 1) 的基因组序列进行信号肽预测和结构域分析, 可见 PmCHH 和 PmHHLPP 同样包含 CHH-Ⅰ 基因基本的 信号肽 -CPRP-KR/ER/RR- 成熟肽 结构, 且第一个内含子位于信号肽区域 目前所获得的 PmCHH 基因近端启动子序列, 从翻译起始位点 (ATG) 起共 527 bp, 其预测的转录起始位点是位于开放阅读框 (open reading frame, ORF) 上游的第 99 个碱基 A, 核心启动子区覆盖了从 A 上游 40 bp 到下游 10 bp 共 50 bp 的区域 ;PmHHLPP 基因近端启动子序列, 从翻译起始位点 (ATG) 起共 604 bp, 其预测的转录起始位点是位于 ORF 上游的第 190 个碱基 A, 核心启 动子区同样覆盖了 50 bp 的区域 2 个基因的三维结构预测图 ( 图 2) 显示, 虽然都包含了 4 个 α 螺旋结构, 但是 PmCHH 第四个 α 螺旋结构更长 2.2 同源性和系统进化树分析将 PmCHH 和 PmHHLPP 在 NCBI 上进行比对发现,PmCHH 比对到的 CHHs 基因相似度普遍约 50%, 超过 56% 的仅有凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) (AJK ) 欧洲龙螯虾 (Homarus gammarus) (Q Q 和 Q ) 克氏原鳌虾 (Proambarus larkii) (AFV AIZ 和 AFV ) 和多齿新米虾 (Neoaridina dentiulata) (AIY ) 的部分序列, 其中凡纳滨对虾 CHH 基因与 PmCHH 的相似度达到 88%, 远远超过其他物种 而 PmHHLPP 与凡纳滨对虾的 2 个 hyperglyemi hormone-like peptide preursor 基因 (AFV AFV ) ITP 基因 (ABN ) 以及日本囊对虾 (Marsupenaeus japonius) ion transport peptide 基因 (BAE ) 的

5 第 4 期吴勉之等 : 斑节对虾 2 种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究 31 斑节对虾斑节对虾斑节对虾斑节对虾斑节对虾 凡纳滨对虾罗氏沼虾罗氏沼虾罗氏沼虾日本沼虾魔鬼沼虾日本长额虾日本长额虾日本长额虾克氏原螯虾克氏原螯虾克氏原螯虾刀额新对虾刀额新对虾刀额新对虾刀额新对虾 PmHHLPP PmCHH PmCHH 3 preursor PmCHH 2 preursor PmCHH 1 preursor LvCHH MrCHH gill form and eyestalk form MrCHH gill form and eyestalk form MrCHH preursor MnCHH MlCHH PjCHH1ES PjCHH1PO PjCHH2 PCHH-like preursor PCHH-likepreursor PCHH2 preursor MeCHH-likeneuropeptide 43-1 MeCHH-likeneuropeptide 43-2 MeCHH-likeneuropeptide 43-3 MeCHH-likeneuropeptide 43-4 MG MG AY AY AY KJ AF AF AY KM AF JQ JQ JQ AF AF AF AF AF AF AF 图 1 PmCHH 和 PmHHLPP 的基因组结构比较分析黑色实线代表基因组序列全长, 其中非编码区 信号肽 CPRP 结构 成熟肽的位置分别用灰色 黄色 蓝色 红色方框表示, 灰色问号区域表示预测的非编码区域, 但尚未证实 Fig.1 Genomi strutural analysis of PmCHH and PmHHLPP The solid blak lines represent the full length of the genomi sequene. The non-oding regions, signal peptides, CPRP regions and mature peptides are indiated by gray, yellow, blue and red boxes, respetively. The predited non-oding regions that have not been onfirmed are marked with gray boxes with question marks. α3 α4 α2 α1 图 2 PmCHH ( 左 ) 和 PmHHLPP ( 右 ) 的分子空间结构预测 序列覆盖度 (query over) 均达 99%, 且具有 80% 以上的序列相似度 ( 分别为 87% 87% 86% 和 80%); 虽然与凡纳滨对虾的另外几个基因 CHH (AAN ) MIH (AAK ) CHH (AAN ) MIH (P ) 和 CHH (AAN ) 的序列覆盖度仅 55% ( 主要分布于成 熟肽区域 ), 但其相似度仍达 85% 以上 ;70% 以上 相似度的还有克氏原鳌虾的 MIH (BAA ) α3 α4 α2 ɑ1~ɑ4 表示预测的 ɑ 螺旋的位置 Fig.2 Predited moleular spatial struture of PmCHH (left) and PmHHLPP (right) ɑ1 ɑ4 indiate the loations of predited ɑ-helies. α1 印度洋中脊盲虾 (Rimiaris kairei) CHH (ACS ) 细角刺虾 (Oplophorus grailirostris) CHH (ARN ) 和欧洲龙螯虾的 CHH (AAX ) 基因 将 2 个基因以及和 PmCHH 超过 53% 序列相似性 与 PmHHLPP 超过 70% 序列相似性的基因 ( 各 17 个 ) 一起进行系统进化树构建, 采用 Bootstrap 法重复计算 次 ( 图 3) 结果显示,PmCHH 和相似度最高的凡纳滨对虾 CHH 基因 (AJK ) 独立聚为一支, 而与其他 CHHs 基因距离较远 ; 排除部分序列 Bootstrap 值较低的问题,PmH- HLPP 与 CHH-Ⅰ 型的 ITP 基因和 CHH-Ⅱ 型的 MIH MOIH 等均距离较近 2.3 组织表达分析 PmCHH 和 PmHHLPP 在不同组织中的表达呈现差异性 ( 图 4) 2 个基因在眼柄 肝 肌肉等组织中均有分布 ;PmCHH 在鳃中的相对表达水平最高, 为眼柄神经中表达量的 14 倍, 表达量第二的肠道也远高于眼柄 (6 倍 ), 肝胰腺和肌肉中 PmCHH 的表达量仅是眼柄神经表达量的 2 倍, 差异并不显著 ;PmHHLPP 在肠中表达最高, 是眼柄

6 32 南方水产科学第 14 卷 克氏原鳌虾 Proambarus larkii CHH AIZ 克氏原鳌虾 P.larkii CHH preursor AFV 克氏原鳌虾 P.larkii CHH preursor AFV 克氏原鳌虾 P.larkii CHH preursor AFV 欧洲螯龙虾 Astaus leptodatylus CHH AAX 克氏原鳌虾 P.larkii CHH AAL 利莫斯螯虾 Faxonius limosus CHH CAA 利莫斯螯虾 F.limosus CHH CAA 美洲螯龙虾 Homarus amerianus CHH Q 美洲螯龙虾 H.amerianus CHH CAA 挪威海螯虾 Nephrops norvegius CHH AAQ 美洲螯龙虾 H.amerianus CHH preursor AAB 美洲螯龙虾 H.amerianus CHH ABA 凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei CHH AAN 凡纳滨对虾 L.vannamei MIH-like AAC 日本沼虾 Marsupenaeus japonius CHH preursor BAE 斑节对虾 P.monodon HHLPP 凡纳滨对虾 L.vannamei ITP preursor ABN 凡纳滨对虾 L.vannamei CHH-like preursor AFV 凡纳滨对虾 L.vannamei CHH-like preursor AFV 细脚刺虾 Oplophorus grailirostris CHH preursor ARN 印度洋中脊盲虾 Rimiaris kairei CHH ACS 多齿米虾 Neoaridina dentiulata CHH AIY 中华绒螯蟹 Erioheir sinensis CHH AGI 榄绿青蟹 Sylla olivaea CHH-like preursor ABP 拟穴青蟹 S.paramamosain CHH AFD 拟穴青蟹 S.paramamosain CHH ALQ 拟穴青蟹 S.paramamosain CHH AFH 斑节对虾 P.monodon CHH 凡纳滨对虾 L.vannamei CHH AJK 图 3 基于 NJ 法构建的 PmCHH 和 PmHHLPP 的系统进化树 Fig.3 Phylogeneti tree of PmCHH and PmHHLPP inferred using Neighbor-Joining method 神经中表达量的 2 倍, 其次为眼柄神经, 而其他组织中的表达量相对较低, 如肝胰腺 肌肉 淋巴 鳃和卵巢, 在精巢中的表达量极低, 仅为眼柄神经的 1/ 发育各期表达分析 PmCHH 和 PmHHLPP 基因在幼体不同发育阶段的表达也存在差异 ( 图 5) PmCHH 在受精卵时表达量较低, 在无节幼体 Ⅰ Ⅱ 期逐渐上调, 在 Ⅲ 期有一个明显回落, 随后在 Ⅳ 期达到表达高峰 ( 是受精卵时期表达量的约 22 倍, 是无节幼体 Ⅲ 期表达量的 12 倍 ), 随后回落到无节幼体前期水平 ; 进入溞状幼体期后, 在溞状幼体 Ⅰ 期有一个明显的下降, 随后 Ⅱ Ⅲ 期又逐步上升, 并在糠虾幼体 Ⅱ 期达第二个表达高峰, 随着发育阶段的推进, PmCHH 基因的表达水平在仔虾阶段回落到溞状幼体 Ⅰ 期的表达水平 与 PmCHH 相比,PmHHLPP 的整体表达水平 较低, 同时在受精卵阶段表达量相对较高, 在无节幼体时期下降, 并在无节幼体 Ⅲ 期和糠虾幼体 Ⅱ 期出现表达高峰, 分别为受精卵时期的 1.4 倍和 1.3 倍, 无节幼体 Ⅳ 至 Ⅵ 期和糠虾幼体 Ⅰ 至 Ⅲ 期表达量均呈现下降趋势, 在糠虾幼体期达到较高的表达水平, 随后在仔虾阶段下降了约 50% 3 讨论 PmCHH 和 PmHHLPP 具有 信号肽 -CPRP- KR/ER/RR- 成熟肽 结构, 这是 CHHs 基因尤其 CHH-Ⅰ 型基因最基本的特征 ; 同时, 除克氏原鳌虾和斑节对虾的个别已报道基因组序列以外, 绝大多数基因组编码区包含 3 个外显子和 2 个内含子 ( 其中 1 个内含子位于信号肽区域 ), 且在 3 -UTR 区域内含有另一个内含子结构 同源比对和系统进化树分析结果显示,PmCHH 与比对序列具有 50% 以上的相似性, 而 PmHHLPP 的相似性更

7 第 4 期吴勉之等 : 斑节对虾 2 种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究 33 PmCHH 的相对表达量 relative expression of PmCHH 肌肉 musle 淋巴 lymph 眼柄神经 eyestalk ganglion 肝胰腺 hepatopanreas a 肠 gut b 鳃 gill 精巢 testis 卵巢 ovary PmHHLPP 的相对表达量 relative expression of PmHHLPP a 肌肉 musle 淋巴 lymph 眼柄神经 eyestalk ganglion 肝胰腺 hepatopanreas b 肠 gut 鳃 gill 精巢 testis 卵巢 ovary 图 4 PmCHH 和 PmHHLPP 组织差异性表达使用 Dunan 法进行单因素方差分析, 按照 a>b> 的顺序数据的显著性依次降低一个水平, 复合字母 ( 如 ab) 表示数值的显著性介于两者之间 ; 下图同此 Fig.4 Expression levels of PmCHH and PmHHLPP in different tissues Duan's method was used in One-Way ANOVA test, and the desending order of the signifiane is indiated as a>b>. Compound letters (suh as ab) indiate that the signifiane is between those two levels. The same ase in the following figure. PmCHH 的相对表达量 relative expression of PmCHH a b b b b b b b b b Z N1 N2 N3 N4 N5 N6 Z1 Z2 Z3 M1M2M3 P 受精卵 zygote 无节幼体期 nauplius 溞状幼体期 zoea 幼体发育分期 stage of larval development 糠虾幼体期 mysis 仔虾 postlarva PmHHLPP 的相对表达量 relative expression of PmHHLPP b b Z N1 N2 N3 N4 N5 N6 Z1 Z2 Z3 M1M2M3 P 受精卵 zygote a 无节幼体期 nauplius b 溞状幼体期 zoea ab 幼体发育分期 stage of larval development a ab b 糠虾幼体期 mysis 仔虾 postlarva 图 5 PmCHH 和 PmHHLPP 在幼体发育阶段表达分析 Fig.5 Expression levels of PmCHH and PmHHLPP at different larval developmental stages 高, 且集中体现在作为功能区的成熟肽区域, 这足以证明 PmCHH 和 PmHHLPP 是属于 CHHs 家族的基因 然而, 值得注意的是, 与 PmCHH 在序列上最相似的凡纳滨对虾 CHH 基因 (AJK ) 并不是 CHH-Ⅰ 型基因 : 凡纳滨对虾该基因不具有 CPRP 结构, 它在行使高血糖调控功能的肝胰腺和肌肉中不表达, 且特异性的表达于精荚和输精管中 [30] ; 与 PmHHLPP 进化距离相近的多为 MIH 和 MOIH ( 包括 MIH/MOIH-like) 基因, 而聚为一支的 日本囊对虾的 CHH 基因 (BAE ) 可能参与发 育成熟和内分泌系统 [31], 这也是传统意义上认为 的 CHH-Ⅰ 型基因所不具有的功能 此前报道的斑 节对虾 CHH 基因 ( 在 NCBI 上比对后相似度较 低, 未在本文结果中体现 ), 虽然其结构上包含 CPRP 结构, 被分为 CHH-Ⅰ 型基因, 但是并不具 [23-24] 有高血糖调节活性或者表达基因结果不显著, 难以确认其功能 [23] 事实上,CHH-Ⅰ 型包含的基 因包括被认为行使高血糖调控的 CHH, 和后来在

8 34 南方水产科学第 14 卷 节肢动物中发现的 维持水盐平衡的姐妹基因 ITP, 无论结构上还是功能上均与属于 CHH-Ⅱ 型 基因的 MIH/MOIH VIH/GIH 极为不同 另一个值 得注意的现象是, 已报道的基因组中可变剪接普遍 存在, 如在刀额新对虾 (Metapenaeus ensis) 的一个 基因组序列中因为内含子的位置不同, 使得成熟肽 的序列发生了变化, 其功能也发生了改变 [32], 乃至 跨越了 CHH-Ⅰ 和 CHH-Ⅱ 的分界 近期有不少报 道提到部分新发现的 结构上属于 CHH-Ⅰ 型的 CHH-like 基因存在组织特异性的情况 [17,33-35] 显然 单靠一个 CPRP 结构把 CHH-Ⅰ 型和 CHH-Ⅱ 型进 行划分乃至以此作为基因功能的判断已不准确 应 该建立新的分类和判断方法, 在考虑可变剪接的基 [1] 础上重新进行划分 Montagné 等认为,CHHs 家族基因存在一个前体, 它是甲壳动物 CHHs 和节 肢动物 ITP 和 ITP-like 基因的共同祖先, 而可变剪 接过程的出现, 将本来存储在非编码区的遗传信息 释放出来, 丰富了 CHHs 家族的结构与功能, 使其 变得更加多样化与专一化, 这符合进化规律 进一步在定量表达结果中看到, 虽然 PmCHH 和 PmHHLPP 在眼柄神经 肝胰腺和肌肉中均有 表达, 但表达量并不高, 而表达量最显著的肠和鳃 是被认为与免疫功能相关的组织, 由此看出这 2 个 基因并不能被简单界定为高血糖调控的 CHH-Ⅰ 型 基因 而在幼体发育阶段中,2 个基因在无节幼体 Ⅲ~ Ⅳ 期 溞状幼体 Ⅰ 期和糠虾幼体期前后表达量也出 现了一定的波动 :PmHHLPP 基因在受精卵时期保 持了一个较高的相对表达量, 之后有短暂回落, 在 无节幼体 Ⅲ~Ⅳ 期时显著升高后回落, 之后在溞状 幼体 Ⅰ 期有一个小的反弹, 但不显著, 到糠虾幼体 期又显著上升 PmCHH 与 PmHHLPP 最明显的不 同是在溞状幼体阶段, 尤其是在 Ⅰ 期表达量达到低 谷, 而后才缓慢上升 目前关于甲壳动物幼体发育 阶段的基因表达情况研究报道的比较少, 仅周凯敏 等 [36] 李运东等 [37] Li 等 [17] [38] Li 等有报道, 且 分期方式 物种 实验方法不尽相同 值得注意的 是, 无节幼体 Ⅳ~Ⅳ 期 溞状幼体 Ⅰ 期和糠虾幼体 期是斑节对虾幼体变态的重要转折点 [28] : 无节幼体 Ⅲ~Ⅳ 期开始出现腹肢生长芽突, 头胸甲雏形出 现, 在外观上与之前有一定的差异, 这段时间主要 是大量消耗卵黄促进机体生长 ; 而进入溞状幼体期 后, 斑节对虾幼体脱离卵黄供能, 正式进入浮游摄 食阶段, 这段时间里幼体的运动摄食能力有明显增 强, 头部和胸部开始分节, 同时进化出口器和消化系统, 这段时间 PmCHH 和 PmHHLPP 的表达趋势相反 ; 而到了糠虾幼体时期, 步足和游泳足逐渐长成并开始分支分节, 游泳能力在这段时间明显增强, 机体内部也逐渐完善 这 3 个时期的共同特征是形态改变较大, 需要提高代谢强度, 这个过程中既可能包含能量的变化, 也可能具有物质积累的过程 虽然目前对 CHHs 基因的功能一般定义为促进血糖升高, 但也有报道其造成血糖浓度降低的情况 [39-41], 且前文也提到了这 2 个基因很有可能并不完全是具有高血糖调控功能的基因, 那就不能简单地考虑基因表达和能量需求的关系 ;PmHHLPP 与 MIH 这个蜕皮抑制基因在序列结构和聚类上相似, 而与 PmCHH 聚为一支的凡纳滨对虾 CHH 基因更多地表达于鳃和肠这样的免疫器官 [30], 本文的实验结果与其一致, 因此也应该更多考虑它们在蜕皮和免疫上的功能 另外需要注意的是,2 个基因预测的三维结构虽然都具有 4 个 α 螺旋, 与报道的其他 CHH 基因近似 [21], 但这 2 个基因的结构并不完全相同, 因此也需要对 2 个基因分别进行研究 本实验在斑节对虾中获得的基因 PmCHH 和 PmHHLPP 属于 CHHs 家族基因, 其与 CHH-Ⅰ 型基因在基因组结构上均具有很高的相似性, 具有 CHH-Ⅰ 型基本的序列结构 ; 其在组织中普遍表达, 在幼体发育阶段发挥功能, 但可能并不参与高血糖调控, 猜测是在蜕皮与免疫方面发挥作用, 这意味着不能将其简单定义为 CHH-Ⅰ 型基因, 而应该属于新的类型 综上, 新发现的 PmCHH 和 Pm- HHLPP 基因, 很有可能是具有 CHH-Ⅰ 型结构的新型 CHHs 基因 参考文献 : [1] MONTAGNÉ N, DESDEVISES Y, SOYEZ D, et al. Moleular evolution of the rustaean hyperglyemi hormone family in edysozoans[j]. BMC Evol Biol, 2010, 10(1): 62. [2] 蔡生力. 甲壳动物内分泌学研究与展望 [J]. 水产学报, 1998, 22 (2): [3] KELLER R. Crustaean neuropeptides: strutures, funtions and omparative aspets[j]. Experientia, 1992, 48(5): [4] BÖCKING D, DIRCKSEN H, KELLER R. The rustaean neuropeptides of the CHH/MIH/GIH family: strutures and biologial ativities[j]. Springer Berlin Heidelberg, 2002, 13(1): [5] NAGAI C, MABASHI-ASAZUMA H, NAGASAWA H, et al. Identifiation and haraterization of reeptors for ion transport

9 第 4 期吴勉之等 : 斑节对虾 2 种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究 35 peptide (ITP) and ITP-like (ITPL) in the silkworm Bombyx mori[j]. J Biol Chem, 2014, 289(46): [6] DIRCKSEN H. Inset ion transport peptides are derived from alternatively splied genes and differentially expressed in the entral and peripheral nervous system[j]. J Exp Biol, 2009, 212(Pt 3): [7] 杨济芬, 朱冬发, 沈建明, 等. 甲壳动物高血糖激素家族生理功能研究进展 [J]. 动物学杂志, 2009, 44(1): [8] 王雪惠, 孙金生, 杨卫军. 中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及活性鉴定 [J]. 水产学报, 2006, 30(2): [9] OHIRA T. Crustaean hyperglyemi hormone, e53[m]. San Diego: Aademi Press, 2016: [10] DUANGPROM S, KORNTHONG N, SUWANSA-ARD S, et al. Distribution of rustaean hyperglyemi hormones (CHH) in the mud rab (Sylla olivaea) and their differential expression following serotonin stimulation[j]. Aquaulture, 2017, 468(1): [11] 舒妙安, 张龙韬, 周宇芳, 等. 拟穴青蟹 (Sylla paramamosain) 两种 Ⅰ 型高血糖激素基因全长 DNA 的克隆及组织表达分析 [J]. 海洋与湖沼, 2012, 43(4): [12] FANJUL-MOLES M L. Biohemial and funtional aspets of rustaean hyperglyemi hormone in deapod rustaeans: review and update[j]. Comp Biohem Physiol C, 2006, 142(3/4): [13] FU C, HUANG X, GONG J, et al. Crustaean hyperglyaemi hormone gene from the mud rab, Sylla paramamosain: loning, distribution and expression profiles during the moulting yle and ovarian development[j]. Aquault Res, 2016, 47(7): [14] LIU M Q, PAN L Q, LI L, et al. Moleular loning, haraterization and reombinant expression of rustaean hyperglyemi hormone in white shrimp Litopenaeus vannamei[j]. Peptides, 2014, 53: [15] 金舒博, 王宁, 乔慧, 等. 青虾高血糖激素基因全长 DNA 序列的克隆及表达分析 [J]. 中国水产科学, 2013, 37(1): [16] QIAN Y Q, DAI L, YANG J S, et al. CHH family peptides from an 'eyeless' deep-sea hydrothermal vent shrimp, Rimiaris kairei: haraterization and sequene analysis[j]. Comp Biohem Physiol B, 2009, 154(1): [17] LI S H, LI F H, WANG B, et al. Cloning and expression profiles of two isoforms of a CHH-like gene speifially expressed in male Chinese shrimp, Fenneropenaeus hinensis[j]. Gen Comp Endor, 2010, 167(2): [18] CAMACHO-JIMÉNEZ L, SÁNCHEZ-CASTREJÓN E, DÍAZ F, et al. Cloning and expression of the reombinant rustaean hyperglyemi hormone isoform B2 (rchh-b2) and its effets on the metabolism and osmoregulation of the Paifi white shrimp Litopenaeus vannamei[j]. Gen Comp Endor, 2017, 253: [19] 王在照, 相建海. 甲壳动物 CHH 家族神经激素结构和功能研究进展 [J]. 水产学报, 2001, 25(2): [20] De KLEIJN D P, van HERP F. Moleular biology of neurohor- [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] mone preursors in the eyestalk of Crustaea[J]. Comp Biohem Physiol B, 1995, 112(4): 王艳华, 张亦陈, 孙妍, 等. 中华绒螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子结构解析 [J]. 水产学报, 2013, 37(7): DAVEY M L, HALL M R, WILLIS R H, et al. Five rustaean hyperglyemi family hormones of Penaeus monodon: omplementary DNA sequene and identifiation in single sinus glands by eletrospray ionization-fourier transform mass spetrometry[j]. Mar Biotehnol, 2000, 2(1): UDOMKIT A, CHOOLUCK S, SONTHAYANON B, et al. Moleular loning of a DNA enoding a member of CHH/MIH/GIH family from Penaeus monodon and analysis of its gene struture[j]. J Exp Mar Biol Eol, 2000, 244(1): TREERATTRAKOOL S, UDOMKIT A, EURWILAICHITR L, et al. Expression of biologially ative rustaean hyperglyemi hormone (CHH) of Penaeus monodon in Pihia pastoris[j]. Mar Biotehnol, 2003, 5(4): UDOMKIT A, TREERATTRAKOOL S, PANYIM S. Crustaean hyperglyemi hormones of Penaeus monodon: loning, prodution of ative reombinant hormones and their expression in various shrimp tissues[j]. J Exp Mar Biol Eol, 2004, 298(1): TREERATTRAKOOL S, PANYIM S, CHAN S M, et al. Moleular haraterization of gonad-inhibiting hormone of Penaeus monodon and eluidation of its inhibitory role in vitellogenin expression by RNA interferene[j]. FEBS J, 2008, 275(5): WEBSTER S G, KELLER R, DIRCKSEN H. The CHH-superfamily of multifuntional peptide hormones ontrolling rustaean metabolism, osmoregulation, moulting, and reprodution[j]. Gen Comp Endorinol, 2012, 175(2): 江世贵. 斑节对虾种虾繁育技术 [M]. 北京 : 海洋出版社, 2013: YANG L S, LI X L, JIANG S, et al. Charaterization of Argonaute2 gene from blak tiger shrimp (Penaeus monodon) and its responses to immune hallenges[j]. Fish Shellfish Immunol, 2014, 36(1): VENTURA-LÓPEZ C, GÓMEZ-ANDURO G, ARCOS F G, et al. A novel CHH gene from the Paifi white shrimp Litopenaeus vannamei was haraterized and found highly expressed in gut and less in eyestalk and other extra-eyestalk tissues[j]. Gene, 2016, 582(2): YAMANO K, UNUMA T. Expressed sequene tags from eyestalk of kuruma prawn, Marsupenaeus japonius[j]. Comp Biohem Physiol A, 2006, 143(2): GU P L, CHAN S M. The shrimp hyperglyemi hormone-like neuropeptide is enoded by multiple opies of genes arranged in a luster[j]. FEBS Lett, 1998, 441(3): DIRCKSEN H, BÖCKING D, HEYN U, et al. Crustaean hyperglyaemi hormone (CHH)-like peptides and CHH-preursor-related peptides from periardial organ neuroseretory ells in the

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