2016 年 12 月, 第 22 卷, 第 4 期,621630 页 Dec 2016,Vol. 22,No.4, pp. 621630 高校地质学报 Geological Journal of China Universities DOI: 10.16108/j.issn10067493.2016043 海南红树林湿地可培养硫酸盐还原菌的垂直分布特征研究 1, 丁海 2 3*, 姚素平, 刘桂建 2 4, 刘常宏 1. 安徽省煤田地质局勘查研究院, 合肥 230088;2. 中国科学技术大学地球与空间科学学院, 合肥 230026; 3. 南京大学地球科学与工程学院, 南京 210023;4. 南京大学生命科学学院, 南京 210093 摘要 : 利用厌氧微生物分离技术, 对深度为 1.2 m 的海南红树林湿地沉积物钻孔样品进行了分离培养, 共获得 11 株 厌氧 sulfatereducing bacteria (SRB) 菌株 经显微观察和 16S rdna 序列分析, 可归纳为 6 个属, 其中已经报道有芽孢杆菌 属 (Bacillus) 弧菌属 (Vibrio) 和梭状芽胞杆菌属 (Clostridium), 另外 3 个属分别为伯克霍尔德菌属 (Burkholderia) 希瓦 氏菌属 (Shewanella) 和海杆菌属 (Marinobacterium) 不同属的细菌对硫酸盐还原的速率最低为 14.71%, 最高可达 56.78%, 并且以上 6 属 11 株菌都能将 +6 价的硫还原生成 2 价硫, 并与培养基中的 Fe 2+ 结合生成黑色 FeS 沉淀, 而这些无定 形 FeS 沉淀是生成黄铁矿的前体 红树林湿地 SRB 种群数量随沉积物深度的增加而降低, 结合沉积物的地球化学分析测试 结果表明, 表层 (0 cm) 水界面的沉积物由于处于氧化 还原界面, 氧气的周期性输入在一定程度上抑制了 SRB 的生长 ; 随着 深度增加 (10~40 cm), 充足的有机质 偏中性的 ph 值以及厌氧环境的增强, 使得 SRB 种类和数量明显增加 ; 而 60 cm 以下 沉积物中因 TOC 含量降低, 减少了微生物可利用的碳源,pH 值明显降低,Na + 和 Ca 2+ 离子浓度明显增加, 这些因素都抑制了 SRB 的生长, 使得深部沉积物中 SRB 的种类和数量显著减少 关键词 : 红树林沼泽 ; 氧化还原环境 ; 可培养硫酸盐还原菌 ; 硫酸盐还原率 中图分类号 :P593 文献标识码 :A 文章编号 :10067493 (2016) 04062110 Diversity and Vertical Distribution of Culturable Sulfatereducing Bacteria in Coastal Mangrove Swamps from Hainan Island, China DING Hai 1,2, YAO Suping 3*, LIU Guijian 2, Liu Changhong 4 1. Exploration Research Institute, Anhui Provincial Bureau of Coal Geology, Hefei 230088, China; 2. School of Earth and Space Science, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China; 3. School of Earth Sciences and Engineering, Nanjing University, Nanjing 210023, China; 4. School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China Abstract: Utilizing an anaerobic method of isolating microorganisms, we identified and cultured a total of 11 strains of anaerobic sulfatereducing bacteria (SRB) from sediment samples collected from 1.2 mdeep mangrove swamps in Hainan. These SRB were classified into 6 genera based on their morphology that was observed under a microscopy and through sequence analysis of their 16S ribosomal DNA (16S rdna). These include three reported genera: Bacillus, Vibrio, and Clostridium. They also include three newly discovered genera: Burkholderia, Shewanella, and Marinobacterium. The minimum rate of sulfate reduction of these bacteria was 14.71%, and the maximum rate was 56.78%. Moreover, all the 11 strains were able to reduce sulfur S 6+ to S 2, which was subsequently 收稿日期 : 20160325; 修回日期 :20160811 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (41372127;40973051); 及安徽省博士后基金项目 (2016B121) 联合资助作者简介 : 丁海, 男,1983 年生, 博士后, 研究方向为有机地球化学 ;Email: dna75@163.com * 通讯作者 : 姚素平, 博士, 教授, 研究方向为有机地球化学 ;Email: spyao@nju.edu.cn
622 高校地质学报 2 2 卷 4 期 bound with iron (Fe 2+ ) to produce black iron (II) monosulfide (FeS) precipitate. FeS precipitate is the precursor of pyrite. The population of SRB in the mangrove swamps decreased with depth. Geochemical analysis of the sediments reveal that the oxidation and reduction interface was located at interface of sediment and water (0 cm), and the periodic input of oxygen partially inhibited the growth of SRB. In contrast, as the depth of sediment increased (1040 cm), an adequate supply of organic matter, a nearneutral ph, and an enhanced anaerobic environment led to a significant increase in both the number of SRB strains and the population of SRB. However, at depths greater than 60 cm, the total organic carbon (TOC) content in the sediment decreased, which reduced the carbon source available for microorganisms. In addition, both a significant reduction in ph levels and significant increases in sodium cation (Na + ) and calcium cation (Ca 2 + ) concentrations inhibited SRB growth, greatly decreasing the number of SRB strains and the total SRB population in the deep sediments. The geochemical characteristics of the sediments were the main factors affecting vertical distribution of SRB species in the mangrove swamp samples. Key words: mangrove swamps; redox condition; culturable SRB; sulfate reduction rate; sulfur cycle; pyrite. Corresponding author: YAO Suping, Professor; Email: spyao@nju.edu.cn 红树林湿地一般分布于热带 亚热带低能海岸潮间带上部, 受周期性潮水浸淹, 以红树植物为主体的常绿灌木或乔木组成的海岸湿地, 是中国重要的海岸湿地类型, 主要分布在海南 广东 广西 福建 台湾 香港和澳门等省区 ( 何斌源等,2007) 红树林湿地是地球上生产力最高的生态系统之一, 具有很高的有机物质含量, 在全球生态碳循环中起着重要作用 陆地生态系统的中 10% 的碳由红树林湿地输入海洋, 海洋沉积物碳总量的 15% 来自红树林湿地 (Jennerjahn and Ittekkot, 2002; Dittmar et al., 2006) 红树林湿地是典型的厌氧湿地, 由于海水的潮汐作用, 其最显著的特征之一是沉积物中硫含量很高, 且以循环快速的无机硫为主, 尤其是硫酸盐 (Alongi et al., 1989;Giblin and Wieder,1992) 的还原作用 由于其高硫酸盐特性, 硫酸盐还原菌是有机物质分解代谢的主要参与者 (Mackin and Swider, 1989), 其硫酸盐还原作用消耗红树林湿地中超过 50% 的有机物质 (Jørgensen, 1977), 同时硫酸盐被还原为硫化氢, 大部分的硫化氢与环境中铁离子发生反应, 以 FeS 和 FeS 2 化合物的形式沉积下来 (Moeslund et al., 1994) 硫酸盐还原菌是红树林湿地有机物质主要分解者, 在碳 硫循环过程中扮演重要角色, 目前有关红树林湿地微生物的研究主要集中在微生物的种群结构和生物多样性分析 降解有机污染物微生物的筛选等方面 (Jørgensen, 1978; Bharathi et al., 1991; 何斌源等, 2007; 钦佩, 2006), 而对于 SRB 的种群结构 分布特征以及在 S 循环中的作用等鲜有报道 开展红树林湿地 SRB 优势种群的分离 鉴定以及在 S 循环过 程中的作用研究具有重要的生物学和生态学意义, 并对深入了解 SRB 参与地球化学循环过程的机理具有一定参考价值 1 样品和方法 1.1 背景和样品红树林湿地样品取自海南岛东北部的东寨港 (E110 32 110 37 N 19 51 20 01 ) 的红树林自然保护区, 研究区年年平均气温 24.5, 年均降水约 1156.5 mm ( 林鹏,1997) 2010 年 7 月在红树林湿地中 ( 图 1) 用 PVC 管 (Φ140, 长 2 m) 钻孔取样 1 处, 获得钻孔样品长度为 1.2 m, 将采集好的样品密封并冷冻保存在 4 的冰箱中 在实验室将钻孔样品进行分装, 为了研究 SRB 种群数量及分布随垂直深度的变化, 采集深度为 0 10 20 30 40 60 90 120 (cm) 的集钻孔沉积物样品, 每层取约 200 g 沉积物分别保存于 2 个 50 ml 灭菌螺口离心管中, 一份用于可培养硫酸盐还原菌的分离, 另一份置于 80 冰箱中冷冻保存 1.2 红树林湿地沉积物理化性质的测试方法沉积物理化实验测试主要包括 ph 有机元素和金属离子等 首先利用梅特勒 托利多 ph 测量设备直接测试沉积物的 ph 值 取约 100 g 沉积物离心获得约 5~10 ml 孔隙水, 利用离子色谱仪 (Metrohm 790 IC) 测定 Cl 2 SO 4 Na + K + Mg 2+ Ca 2+ 等离子浓度 ; 称重约 50 g 沉积物冷冻干燥, 称取其中的 2 g 干燥样品用玛瑙碾钵碾磨至 200 目, 取 100 mg 粉末样品由 Elementar Vario MACRO CHNS 元素分析仪测试获得 N S H 等有机元素含量 ; 另取其中 1 g 粉未样加入 1 N HCl 在 25
4 期丁海等 : 海南红树林湿地可培养硫酸盐还原菌垂直分布特征研究 623 Fig. 1 图 1 红树林湿地沉积物采样点 Map showing the location of mangrove swamp sediment sampling sites 反应 24 h 去除无机碳后由 Elementar 元素分析仪测试 TOC 含量 取 2 g 混合均匀的粉末样品用环氧树脂胶结固定后抛光制成光片进行显微镜 (Nikon) 下观察和测量 ; 另将约 500 mg 沉积物样品喷上铂金后在扫描电子显微镜 (SEM,JEOL) 下观察样品中有机质和矿物的微观形貌特征, 同时利用电子探针完成部分样品的微区成分分析 1.3 沉积物样品中可培养 SRB 的种群数量测定 SRB 筛选平板培养基的配方如下 (Widdel and Bak, 1992; Hines et al., 1999): NaCl,30 g/l; NaSO 4, 84 g/l; KCl, 0.3 g/l; MgCl 2 6H 2O, 2 g/l; MgSO 4 7H 2O, 1 g/l; CaCl 2 2H 2O, 0.147 g/l; K 2HPO 4, 0.2 g/l; NH 4Cl, 0.26 g/l; NaHCO 3, 1.68 g/l; 乳酸钠, 10 mmol/l, 酵母膏, 0.1g/L; Fe(NH 4) 2(SO 4) 2 6H 2O, 1.66g/L; 琼脂 20 g, 定容至 1 L, 调节 ph 至 7.0, 选择 5 种不同底物的电子供体 (A): 乙酸钠, 乙醇, 乳酸钠均 20mmol/L, 苯甲酸钠 5 mmol/l, 丙酸钠 10 mmol/l 利用 Forma 1029 厌氧培养系统 进行系列稀释涂布法分离培养沉积物中可培养的 SRB 菌群 称取沉积物样品 1 g 左右, 置于 50 ml 无菌塑料管中, 加入无菌水至 10 ml, 振荡 10 min, 依次稀释至 10 5 10 6 10 7 倍 ; 然后分别取稀释液 200 μl 倾注至培养基平板上进行涂布培养, 每个浓度的稀释液均涂布于 5 种培养基平板上, 并且重复 2 个平板 用于分离 SRB 菌群的平板置于厌氧培养箱中, 加热至 35, 在混合气体 (10% H 2,10% CO 2,80% N 2) 和氮气以及钯催化剂共同的作用下进行厌氧培养 6d, 并记录各种底物平板上的细菌菌落形态及各种形态菌落的数目 1.4 可培养 SRB 菌种鉴定厌氧培养至出现黑色菌落, 挑取单菌落进一步重复接种操作直至得到纯化的菌株, 然后进行 16S rrna 基因序列的分析 (Shuang et al., 2006) 首先将已纯化的 SRB 菌种划线接种至相应的固体培养基平板上,35 培养 6 d, 提取细菌 DNA, 然后进行细菌 16SrDNA 目标片断的 PCR 扩增 16SrDNA 序列扩增引物 8f(5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3 )(Chen et al., 2008) 和 907r(5 CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT 3 )(Brinkhoff et al., 1998) 由上海英骏生物技术有限公司合成 PCR 反应试剂盒和纯化试剂盒分别购自北京天为时代科技有限公司和 OMEGA 公司 PCR 的反应体系 (50 μl) 为 10 PCR Buffer( 含 Mg 2+ )5 μl; 引物 8f(10 μmol/l)1 μl, 引物 907r
624 高校地质学报 2 2 卷 4 期 (10 μmol/l)1 μl;dntp 混合物 ( 每种 2.5 mmol/l) 4 μl; 挑取少量菌落作为模板 DNA;Taq 酶 (5 U μl 1 ) 0.5 μl;ddh 2O 补足至 50 μl PCR 的反应条件为 95 5 min;94 30 sec,57 1 min,72 1 min, 25 个循环 ;72 10 min 4 结束 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物后, 用 OMEGA 公司生产的 D649201 E. Z. N. A. TM CyclePure 试剂盒纯化 PCR 产物 纯化后的 PCR 产物送至南京大学医药与生物技术国家重点实验室完成测序工作 采用序列图谱软件 Chromas 对所得序列进行核对, 并使用 BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool, http: // www. ncbi. nlm. nih. Gov) 在 enbank+embl+ddbj+ PDB 基因库中对每株菌的 16SrDNA 序列进行同源性搜索和比对, 以获得参考序列, 然后应用 MEGA4 生物学软件构建系统进化树 1.5 SRB 硫酸根还原速率及还原产物的测定将已测序鉴定的 SRB 纯化菌种接种至 12 ml 相应的液体培养基中, 在 33 的条件下静置培养 定时取 1 ml 培养液测定硫酸根含量,30 天后计算 各 SRB 菌株的硫酸盐还原速率, 每个样品设置 3 个重复 SRB 菌培养产物经过冷冻干燥, 密封保存后真空环境喷涂铂金, 通过扫描电镜 (JEOL JSM6490) 分析 SRB 还原产物的形貌特征, 设置工作距离为 10 mm, 电压 20 kv 2 实验结果 2.1 红树林湿地的理化性质不同深度沉积物中的 ph 检测结果显示, 表层 (0 cm) ph 最高, 为 7.53, 随后降低到 ph6.33 (10 cm), 并在 60~90 cm 时降到最低 ph 5.57 TOC 含量在 0~10 cm 沉积物略有升高,10 cm 之后含量呈现下降趋势,TOC 在 10 cm 沉积物含量最高为 3.58%, 在 120 cm 含量最低为 1.01% ( 图 2) N 含量较低, 在 10 cm 处达到最高值 0.28%, 并随着深度增加持续降低, 最低值出现在 60 cm 深度约为 0.12% C/N 比值在 30 cm 处出现最大值 17, 随后持续降低直至 120 cm 处的最低值 8 S 含量除了在 60 cm 略有降低外, 整体呈现上升趋势, 深度 /cm 深度 /cm Fig. 2 图 2 红树林湿地沉积物不同深度元素含量 离子浓度及可培养 SRB 数量 Changes in element content, ion concentration, and the number of culturable SRB in the sediments of the mangrove swamps with depth
4 期丁海等 : 海南红树林湿地可培养硫酸盐还原菌垂直分布特征研究 625 含量在 0.67%~1.18% 之间, 在 120 cm 含量最高为 2 1.18% 红树林湿地的 SO 4 除在 20 cm 处浓度最低 ( 约 8.91 mmol/l), 皆在 10 mmol/l 以上, 平均约 13.39 mmol/l Na + 浓度持续增加, 从 0 cm 处的最低值 213.4 mmol/l, 持续增高至 120 cm 达到最高值为 402.6 mmol/l Ca 2+ 浓度除了 20 cm 沉积物浓度最低为 4.61 mmol/l, 整体呈现升高趋势, 在 120 cm 深度达到最高值为 7.46 mmol/l Cl 浓度在表层 0~ 10 cm 较低,20 cm 以下样品明显增高, 在 120 cm 达 2 到最高位 475.6 mmol/l SO 4 浓度在 20 cm 以上出现降低趋势, 而 30 cm 之后显著升高,60 cm 处达到最大值 ( 图 2) 红树林湿地中所有层位样品均有黄铁矿 (FeS 2) 存在, 呈星散状均匀分布在沉积物中, 主要晶形有八面体自形晶和草莓状体 ( 图 3) 自形的黄铁矿一般较小, 直径在 2 μm 左右 ( 图 3 B), 而草莓状黄铁矿的粒径一般达到 10 μm, 也可见 20 μm 以上的草莓状球体 ( 图 3C) 2.2 可培养 SRB 的鉴定 通过选择性培养, 形态学特征, 参照细菌学 鉴定手册, 将获得的可培养厌氧菌株归为 11 株 SRB ( 表 1) 11 个菌株的 16S rdnapcr 片段大小约 900 bp, 表 1 SRB 菌株的菌落形态特征描述 Table 1 The morphology description of SRB strains colony SRB 菌株编号 菌落形态 S1 白, 不规则, 不透明, 稍凸, 稍湿 S2 白, 不规则, 不透明, 扁, 边波状, 湿润 S3 浅黄, 边绒毛状, 不透明, 凸起, 稍湿, 较大 S4 乳白, 不规则, 不透明, 成片, 凸起, 湿润 S6 浅灰, 规圆, 半透明, 凸起, 小, 水珠样, 稍湿 S7 白, 不规则, 半透明, 较大片, 湿润 S8 灰色, 薄, 不规则, 稍透明, 成片, 湿润 S9 浅黄, 不规则, 边缘刺状, 突起, 湿润 S11 白, 规则, 半透明, 小, 稍湿 S13 浅灰, 不规则, 不透明, 小, 稍湿 S15 中间白色, 边缘浅黄, 不规则, 褶皱, 中央凸, 干 A: 草莓状黄铁矿 (<10 μm) 扫描电镜 (SEM) 图像 ;B: 自形黄铁矿 SEM 图像 ; C: 草莓状黄铁矿 (>20 μm) 反射光图像 ;D: 多草莓状黄铁矿聚合体 A: An SEM image of framboidal pyrite (<10 μm); B: SEM image of euhedral pyrite; C: A reflected light image of framboidal pyrite (>20 μm); D: A reflected light image of multiple framboidal pyrite particles Fig. 3 图 3 红树林湿地沉积物显微图像 Microscopic images of sediments from the mangrove swamps
626 高校地质学报 2 2 卷 4 期 测序结果经同源性分析, 归为 6 个 SRB 属, 主要属于变形菌门和厚壁菌门 其中 8 株归为变形菌门, 3 株归为厚壁菌门 在变形菌门中, 有 5 株属于 β 变形菌纲,3 株为 γ 变形菌纲,2 株为芽孢杆菌纲,1 株为梭状芽胞杆菌纲 参考系统发育树 ( 图 4), 菌株 S1 S2 S3 与伯克氏菌属 (Burkholderia) 的 Burkholderia fungorum 同源性为 99%, 菌株 S7 和 S8 与伯克氏菌属 (Burkholderia) 的 Burkholderia fungorum 同源性为 100% (Witzig et al., 2007); 菌株 S9 与溶血弧菌 Fig. 4 图 4 株菌系统发育树 A phylogenetic tree of the bacterial strains isolated in this study
4 期丁海等 : 海南红树林湿地可培养硫酸盐还原菌垂直分布特征研究 627 (Vibrio parahaemolyticus) 的同源性为 100% (Eiler and Bertilsson, 2006); 菌株 S11 与海杆菌属 (Marinobacterium) 同源性为 94% (Kim et al., 2007); 菌株 S13 与希瓦氏菌属 (Shewanella) 的同源性为 96% (Nakagawa et al., 2006); 菌株 S15 与梭状芽胞杆菌属 (Clostridium) 同源性为 98% (Carlier et al., 2006);S4 与芽孢杆菌属 (Bacillus) 的坚强芽孢杆菌 (Bacillus firmus) 同源性为 99%, 而 S6 的同源性达到 100% (Gontang et al., 2007) 2.3 SRB 在沉积物中数量及垂直分布采用系列稀释涂布平板法测定了各层沉积物中可培养 SRB 的种群数量 结果显示 SRB 的种群数量随沉积物深度而呈现先上升后下降的趋势 ( 图 2), 最高数量出现在 10 cm 深度, 为 7.74 10 11 CFU/g 土壤, 在 120 cm 深度数量最低, 为 4.45 10 8 CFU/g 土壤 在不同沉积物中每个属的 SRB 分布不同,6 个属 11 株 SRB 分布如表 1 所示 SRB 主要分布 60 cm 以上 在沉积物最表层 (0 cm) 只有 Shewanella 分布 ;10 cm,20 cm,30 cm 深度均有 1 株 B. fungorum SRB 分布 ; 在 40 cm 处获得的可培养 SRB 的种类最多, 其中 2 株 B. fungorum 2 株 B. firmus 1 株 Marinobacterium 在 60 cm 处有 1 株 Clostridium 在 90 cm 沉积物无可培养 SRB 分布 在 120 cm 有 1 株 V. parahaemolyticus 伯克氏菌属 B. fungorum 在 10~40 cm 都有分布, 是优势种群 2.4 SRB 硫酸根的还原速率及还原产物培养 30 d 后,V. parahaemolyticus S9 还原率速率最高, 可达到 56.78%,B. fungorum S1 还原率为 41.4%,B. firmus S4 和 Clostridium sp. S15 为在 30% ~40% Marinobacterium sp. S11 和 Shewanella sp. Table 2 表 2 红树林沉积物中 11 株可培养 SRB 的垂直分布 The vertical distribution of the 11 strains of culturable SRB in the sediment samples from mangrove swamps 深度 (cm) Burkholderia fungorum Clostridium Bacillus Marinobacterium Shewanella Vibrio 0 10 20 30 40 60 90 120 1(S1) 1(S2) 1(S8) 2(S3,S7) 1(S15) 2(S4, S6) 1(S11) 1(S13) 1(S9) Fig. 5 图 5 SRB 还原产物 SEM 图像 SEM images of the products of SRB reduction
628 高校地质学报 2 2 卷 4 期 S13 还原率较低, 约 15% ( 表 3) Table 3 菌株 表 3 B. fungorum S1 B. firmus S4 V. parahaemolyticus S9 Marinobacterium sp. S11 Shewanella sp. S13 Clostridium sp. S15 可培养 SRB 的硫酸盐还原率 Sulfate reduction rates of culturable SRB 硫酸盐还原率 (%) 41.40 36.00 56.78 15.74 14.71 32.32 菌株出现深度 (cm) 10 40 120 40 0 60 模拟实验的过程中 SRB 产生大量有特殊臭味 的 H 2S 气体, 在培养基中生成大量黑色沉淀, SEM 能谱揭示沉淀产物主要由 Fe 和 S 元素组成 ( 图 5),Fe/S 原子比介于 1 和 2 之间, 如图 6 中 #1 和 #2 两个能谱点显示 Fe/S 原子比分别为 0.9 和 1.5, 表明在 SRB 的作用下, 硫酸根离子被还原成 S 2, 而 S 2 与培养基中二价铁盐反应可生成不稳定 无定形 FeS 黑色沉淀或由无定形 FeS 向稳定的黄 铁矿 (FeS 2) 转化的过渡产物, 如马基诺矿 (mackinawite; tetragonal FeS, 即四方硫铁矿 ) 胶黄 铁矿 (greigite, cubic Fe 3S 4) 和磁黄铁矿 (pyrrhotite; e.g., Fe 7S 8) 等 (Sweeney and Kaplan, 1973; Wilkin and Barnes, 1996) 3 讨论 3.1 SRB 的多样性 SRB 是能够还原硫酸盐产生硫化氢的一类微 生物的总称, 是根据功能来定义的一类微生物, 目前发现的 SRB 分布于 19 属, 包括革兰氏阳性细 菌, 革兰氏阴性嗜微温菌和古生菌的嗜热硫还原 细菌 (KlepacCeraj et al., 2004) 本研究采用传统 的硫酸盐还原菌分离方法从红树林湿地分离到 11 株 SRB, 经鉴定属于 6 个属, 分别为伯克霍尔德菌 属 芽孢杆菌属 弧菌属 希瓦氏菌属 梭状芽 胞杆菌属 海杆菌属 其中芽孢杆菌属 弧菌属 ( 陈皓文,1999) 和梭状芽胞杆菌属中的 Clostridium tunisiense (Olfa Ben Dhia Thabet et al., 2004) 已有 相关报道为硫酸盐还原菌, 如本次研究分离获得 的 Bacillus firmus S4,Bacillus firmus S6 以及 Vibrio parahaemolyticus S9 等菌株 而伯克霍尔德菌 希 瓦氏菌属和海杆菌属中至今未见有 SRB 菌种的报 道 本研究能够分离获得新的 SRB 菌种的主要原 因可能与本研究采样地的生境 采样沉积物部位 以及分离手段有关 3.2 可培养 SRB 在红树林湿地的垂直分布规律对 SRB 种群数量的研究多数集中在浅层样品中, 一般集中在 5~20 cm 深度 (Niko Finke et al., 2007; Leloup et al., 2005) 的沉积物, 本研究自 1.2 m 的沉积物钻孔中间隔一定距离取沉积物分析, 用硫酸盐还原菌选择培养基在厌氧条件下系统地分离研究了 SRB 的种群数量, 结果显示 SRB 的种群数量随沉积物深度而呈现先上升后下降的趋势, 最高数量出现在 10 cm 深度, 为 7.74 10 11 CFU/g 土壤, 是表层 (0 cm) 的 56 倍 ; 之后,SRB 种群数量随深度增加而急剧下降, 这与前人研究结果相类似, 例如报道的北部湾东侧沉积物表层 SRB 数量是 50~370 cm 沉积物数量的 5.1 倍 (Chen and Xu, 1999) 造成 SRB 这种分布的可能原因是 : 表层处于氧化还原界面, 与氧气接触, 并且硫酸盐含量较低, 不利于厌氧还原环境的产生, 使得 SRB 生长受到抑制, 从而导致种群数量较低 ; 而 10 cm 以下氧气含量降低, 逐步向还原带过渡, 且含有丰富的有机物质,TOC 高达 3.58%, 从而为 SRB 的活动提供丰富的有机质来源 浅钻样品其它深度 SRB 数量可能受到以下几方面因素的综合影响 :(1) 红树林有机物组成 : 红树林 40 cm 以上沉积物中高有机质含量促进了 SRB 的繁茂, 底部沉积物中由于 TOC 含量以及 C/N 值的明显降低, 表明其有机质来源较单一, 以藻类体为主, 这就可能极大地抑制了 SRB 的发育 此外, 有研究表明红树林根际细菌数量变化受红树根以及根系分泌有机物质的影响 (Moriarty et al., 1986), 即植物根系释放的有机酸刺激了硫还原菌的活动, 有助于促进硫酸盐还原过程 (Alongi et al., 2001; 张薇等,2005; 张小李等,2000); (2) 沉积物温度和 ph 值 :Moosa 等 (2005) 研究曾研究了温度对 SRB 还原活性的影响, 结果表明培养温度在 20~35 C 之间时还原活性随温度升高而增加, 但在 40 C 还原活性反倒降低, 红树林沉积物温度在各沉积物可能是不同的, 对 SRB 的影响也不同 ; 沉积物 ph 值与 SRB 生长也密切相关, 通常 SRB 生活的环境 ph 值在 6~9 之间 (Willow and Cohen, 2003),Kimura 等 (2006) 报道 SRB 不能在 ph 值低于 5.5 的条件下生长 海南红树林湿地沉积物环境偏酸性, 且随着沉积物深度增加 ph 值呈现
4 期丁海等 : 海南红树林湿地可培养硫酸盐还原菌垂直分布特征研究 629 下降趋势,10 cm 沉积物 ph 值在 6.33,40~120 cm 沉积物 ph 小于 6, 最低在 5.57, 下层沉积物可能因酸度偏大对 SRB 生存造成不良影响 ;(3) 沉积物孔隙水中的离子浓度 :Na + 浓度与 SRB 生长呈负相关 ( 张小里等,1999),Ca 2+ 对 SRB 生长及活性也有抑制作用 (Maree and Strydom, 1987) 海南红树林沉积物中 Na + 浓度随着沉积物深度增加而升高, 在 120 cm 沉积物达到 402.6 mmol/l,ca 2+ 浓度在 20 cm 以后也呈逐渐升高趋势 4 结论 (1) 对红树林 1 处浅钻研究表明, 该区域存在丰富的 SRB, 经过分离培养纯化共获得 6 属 11 株 SRB 菌株, 其中已经报道的种属为芽孢杆菌属 弧菌属和梭状芽胞杆菌属, 新发现的种属为伯克霍尔德菌属 希瓦氏菌属和海杆菌属 (2) 该红树林钻孔中,SRB 在沉积物中的垂直分布受到沉积物理化特征影响因素导致差异较大, 如上部沉积物 (40 cm) 高 TOC 值和偏中性的 ph 值促进了 SRB 的生长, 而 40 cm 以下沉积物中 TOC 含量明显降低, 偏酸性的 ph 值 (ph<6) 和显著增加的 Ca 2+ Na + 离子浓度可能抑制了 SRB 的生长 (3) SRB 菌种模拟培养实验显示 V. parahaemo lyticus S9 还原率速率最高, 可达到 56.78%,Mari nobacterium sp. S11 和 Shewanella sp. S13 还原率较低, 约 15% 6 属 11 株 SRB 均能将 +6 价的硫还原生成 2 价硫, 并与培养基中的 Fe 2+ 结合生成无定形 FeS 黑色沉淀, 而这些 FeS 沉淀为沉积物中出现大量黄铁矿提供了可能 参考文献 (References) 陈皓文. 1999. 胶州湾潮间带和沿岸区硫酸盐还原菌含量分布 [J]. 海洋环境科学,18(2): 2730. 何斌源, 范航清, 王瑁, 等. 2007. 中国红树林湿地物种多样性及其形成 [J]. 生态学报, 27(11): 48594870. 林鹏. 1997. 中国红树林生态系 [M]. 北京 : 科学出版社 :1318. 钦佩. 2006. 海滨湿地生态系统的热点研究 [J]. 湿地科学与管理,2(1): 711. 张小里, 刘海洪, 陈开勋, 等. 1999. 硫酸盐还原菌生长规律的研究 [J]. 西北大学学报 ( 自然科学版 ),29(5): 397402. 张小李, 陈志昕, 刘海洪. 2000. 环境因素对硫酸盐还原菌生长的影响 [J]. 中国腐蚀与防护报,20(40): 224229. 张薇, 魏海雷, 高洪文. 2005. 沉积物微生物多样性及其环境影响因子研究进展 [J]. 生态学杂志,24(1): 4852. Alongi D M. 1989. Benthic processes across mixed terrigenouscarbonate sedimentary facies on the central Great Barrier Reef continental shelf [J]. Continental Shelf Research, 9:629663. Alongi D M,Wattayakorn G,Pfitzner J,et al. 2001. Organic Carbon Accumulation and Metabolic Pathways in Sediments of Mangrove Forests in Southern Thailand [J]. Marine Geology,179(12):85103. Bharathi P A L,Oak S and Chandramohan D. 1991. Sulfatereducing bacteria from mangrove swamps 2. Their ecology and physiology [J]. Oceanologica Acta,14(2):163171. Brinkhoff T,Santegoeds C M and Sahm K. 1998. A polyphasic approach to study the diversity and vertical distribution of sulfuroxidizing Thiomicrospira species in coastal sediments of the German Wadden Sea [J]. Applied and Environmental Microbiology,64:46504657. Carlier J P,Manich M,Loiez C, et al. 2006. First isolation of clostridium amygdalinum from a patient with chronic osteitis [J]. J. Clin. Microbiol, 44(10):38423844. Chen Haowen and Xu Jiasheng. 1999. Content of sulphatereducing bacteria in the sediment on the east side of Beibu Gulf and its significance [J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences,15(3):103107. Chen Yuqing,Ren Guanju,An Shuqing, et al. 2008. Changes of bacterial community structure in copper mine tailings after colonization of reed phragmites communis [J]. Pedosphere,18(6):731740. Dittmar T, Hertkorn N, Kattner G, et al. 2006. Mangroves, amajor source of dissolved organic carbon to the oceans [J]. Glob.Biogeochem. Cycles, 20:10121029. Eiler A and Bertilsson S. 2006. Detection and quantification of Vibrio populations using denaturant gradient gelelectrophoresi [J] Journal of Microbiological Methods,67(2):339348. Giblin A E and Wieder R K. 1992. Sulphur Cycling in Marine and Freshwater Wetlands [M]. SCOPE 48,Chichester:John & Sons: 85124. Gontang E A,Fenical W and Jensen P R. 2007. Phylogenetic diversity of grampositive bacteria cultured from marine sediments [J]. Applied and Environmental Microbiology,73(10):32723282. Hallberg K B and Johnson D B. 2006. Sulfidogenesis in low ph(3.84.2) media by a mixed population of acidophilic bacteria [J]. Biodegradation, 17(2):5765. Hines M E,Evans R S and Genthner B R S. 1999. Molecular phylogenetic and biogeochemical studies of sulfatereducing bacteria in the rhizosphere of Spartina alterniflora [J]. Applied and Environmental Microbiology,65:22092216. Kim H,Choo Y J,Song J, et al. 2007. Marinobacterium litorale sp. nov. in the order Oceanospirillales [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,57:16591662. Jennerjahn T C and Ittekkot V. 2002. Relevance of mangroves for the production and deposition of organic matter along tropical continental margins [J]. Die Naturwissenschaften,89:2330. Jørgensen B B. 1977. The sulfur cycle of a coastal marine sediment [J]. Limnology and Oceanography,22:814831. Jørgensen B B. 1978. A comparison of methods for the quantification of bacterial sulfate reduction in coastal marine sediments [J]. Geomicrobiology,1:4964.
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