Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I Cat.No.QP-01111/01112/01113/01114 Real Time PCR Easy TM -Taqman Cat.No.QP-01021/01022/01023/01024 For qpcr using purified DNA Store at -20 C Research use only Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 1/19
目 录 产品介绍........ 3 产品特点............ 3 试剂盒应用............. 4 产品质量控制............ 4 试剂盒内容.......... 5 试剂盒组分信息.......... 5 储存条件...... 6 注意事项............ 6...... 试剂盒原理..... 7 SYBR Green I 荧光染料法........... 7 Taqman 探针法.............. 8 操作前准备事项............. 9 实验材料和设备........... 9 安全性.............. 9 操作指南......... 10 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I 操作步骤...... 10 Real Time PCR Easy TM -Taqman 操作步骤........ 12 Real Time PCR 引物设计原则................. 14 Forward Primer 和 Reverse Primer........... 14 Probe........... 14 操作示意图.............. 16 问题分析指南............... 17 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 2/19
产品介绍 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I 试剂盒提供的 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 是一种使用 SYBR Green I 进行 Real Time PCR 扩增反应的全新预混系统, 能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度 同时, 提供 ROX 作为内参染料 该试剂盒的荧光强度为同类产品的 3-5 倍, 能更灵敏的 更直观的反应目的模板 DNA 的浓度 Real Time PCR Easy TM -Taqman 试剂盒提供的 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 是一种使用特异荧光探针进行 Real Time PCR 扩增反应的全新预混系统, 能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度 同时, 提供 ROX 作为内参染料 该 Real Time PCR Mix 扩增效率高, 能更灵敏的 更直观的反应目的模板 DNA 的浓度 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR/Taqman 包含本公司特有的热启动 Foregene Taq DNA Polymerase, 该酶相对于普通 Taq 酶具有扩增效率高 特异性扩增能力强 错配率低等 优点 用于荧光定量 PCR 反应可减少非特异性扩增, 提高 PCR 的准确性 产品特点 独特的 PCR 优化体系, 使 2 Real PCR Easy TM Mix 具有更强的兼容性 热启动 Foregene Taq Polymerase, 具有更高的扩增效率 更高的扩增灵敏度 更高的扩增特异性 优化的 2 Real PCR Easy TM Mix 使 SYBR Green I 具有更高的检测灵敏性, 其荧光强度为同类产品的 3-5 倍, 可满足不同类型的荧光定量实验需求 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 使用 Foregene 优化的独特体系, 提高 sequence-specific probe 检测的灵敏度和特异性 本产品附带有 ROX 内参染料, 可用于消除信号本底及孔间信号误差, 方便客户用于不同型号定量 PCR 仪使用 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 3/19
试剂盒应用 荧光定量 PCR 进行模板定量分析 常规 PCR 扩增 Taqman 法可用于等位基因的检测 产品质量控制 按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 (FOREGENE s Total Quality Management System), 每一批次的 Real Time PCR 系列试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 4/19
试剂盒内容 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I(20μl 体系 ) 试剂盒组成 QP-0101T QP-01011 QP-01012 QP-01013 QP-01014 50 Preps 200 Preps 500 Preps 1000 Preps 2000 Preps 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 0.5ml 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 6 1.7ml 12 50 ROX Reference Dye 100μl 400μl 1ml 1ml 2 1ml 4 DNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 1.7ml 2 10ml 20ml 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 1 份 Real Time PCR Easy TM -Taqman(20μl 体系 ) 试剂盒组成 QP-0102T QP-01021 QP-01022 QP-01023 QP-01024 50 Preps 200 Preps 500 Preps 1000 Preps 2000 Preps 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 0.5ml 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 6 1.7ml 12 20 ROX Reference Dye 100μl 200μl 0.5ml 1ml 1ml 2 DNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 1.7ml 2 10ml 20ml 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 1 份 试剂盒组分信息 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR: 包含福际生物特别改造的热启动 Taq DNA Polymerase MgCl 2 优化配比的 dntps 和 SYBR Green I 反应缓冲液 PCR 反应增强剂 优化剂以及稳定剂等 PCR 反应时, 只需将适当的裂解混合液 引物 DNase-ddH 2 O 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 中即可用于 PCR 反应 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman: 包含福际生物特别改造的热启动 Taq DNA Polymerase MgCl 2 优化配比的 dntps 反应缓冲液 PCR 反应增强剂 优化剂以及稳定剂等 PCR 反应时, 只需将适当的裂解混合液 引物 DNase-ddH 2 0 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 中即可用于 PCR 反应 ROX Reference Dye: 一般用于 ABI Stratagene 等公司的 Real Time PCR 扩增仪上, 用于调整 PCR 加样误差所引起的 PCR 管与管之间的差异 不同仪器所需 ROX Reference Dye 浓度不同, 用户可以根据仪器的推荐浓度添加 DNase-Free ddh 2 O: 超纯水, 用于 PCR 反应 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 5/19
储存条件 1. 输运条件 全程低温冰盒运输, 保证试剂盒处于 <4 状态 2. 保存条件 本试剂盒避光保存于 -20 C; 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 2 Real Time PCR Easy TM Mix-SYBR 和 ROX Reference Dye 需避光保存于 -20 C; 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 若 2 Real PCR Mix 置于低温度保存, 应避免反复冻融, 否则会影响 PCR 效率 使用时请将 2 Real PCR Mix 上下颠倒轻柔混匀, 避免起泡, 并瞬时离心后使用 如果试剂没有混匀, 其反应性能会有所下降 注意, 切勿使用振荡器混匀 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 含有 SYBR Green I, 保存时或配制 PCR 反应液时应避免强光照射 反应液的配制 分装请一定使用新的 ( 无污染的 ) 枪头 PCR 管等, 尽量避免污染 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 6/19
试剂盒原理 SYBR Green I 荧光染料法 试剂盒使用了热启动 Foregene Taq DNA Polymerase 进行 PCR 扩增, 通过检测反应液中 SYBR Green I 的荧光强度, 达到监控 PCR 产物扩增量的目的 在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR Green I 荧光染料,SYBR Green I 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的 SYBR Green I 染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步 SYBR Green I 与双链 DNA 结合后发出荧光, 可以通过检测反应体系中的 SYBR Green I 荧光强度, 达到检测 PCR 产物扩增量的目的 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 7/19
TaqMan 荧光探针 PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针, 该探针为一寡核苷酸, 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解, 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光信号, 即每扩增一条 DNA 链, 就有一个荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步 再通过实时监测整个 PCR 进程荧光信号的积累, 与标准曲线对比进行定量分析 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 8/19
操作前准备事项 使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书 Real Time PCR Easy TM 系列试剂盒操作简 单 方便 快速, 说明书提供了整个试剂盒的完整信息和正确使用方法 请在使用前 准备好必要的实验材料和设备 实验材料和设备 0.2ml 无菌 PCR 管 荧光定量 PCR 扩增仪 微量移液器 冰浴 自备 DNA 模板 PCR 引物 Probe 安全性 本产品仅供科研使用, 请勿用于医药 临床医疗 食品及化妆品等用途 使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 9/19
操作指南 本说明书根据实验目的的不同, 分别提供了 SYBR Green I 染料法和 Taqman 探针法定 量 PCR 操作方法 客户可根据自己的实验目的, 按照相应的实验说明进行操作 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I 操作步骤 A:Real Time PCR 体系配制 1. 取出 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 50 ROX Reference Dye 引物等置于冰盒中, 使其自然融化 融化后, 上下颠倒混匀试剂, 可用离心机瞬时离心收集散落在管壁和盖子上的液体 注意 :2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 放在室温或握在手中时间较长会变浑浊, 可将其置于冰上 2-5min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 2. 将适量的 DNA 模板 引物或 50 ROX Reference Dye 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 中, 并用 DNase-Free ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 1) 注意 : 该操作应在冰浴上进行, 长时间的室温放置会降低产品性能 表 1:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容用量终浓度 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 10μl 25ul 1 Forward Primer (10μM) 0.8μl 2μl 0.4μM 1* Reverse Primer (10μM) 0.8μl 2μl 0.4μM 1* Template(DNA) Xμl 5μl 50 ROX Reference Dye - - 2* 3* DNase-Free ddh 2 O (8.4-X)μl 16μl Total Volume 20μl 50μl 1*: 通常引物终浓度为 0.4 μm 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.2~1.0 μm 范围内调整引物浓度 2*:DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下 因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同, 必要时可进行梯度稀释, 确定最佳的 DNA 模板添加量 3*: 根据定量 PCR 仪器不同选择合适终浓度的 ROX Reference Dye 常见定量 PCR 仪的最适 ROX Reference Dye 浓度见下表 : Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 10/19
荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM7000/7300/7700/ 7900HT/Step One 等 ROX Reference Dye 终浓度 5 ( 如 20μl 体系, 加入 2μl 50 ROX Reference Dye) ABI 7500/7500 Fast 和 Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 等 1 ( 如 20μl 体系, 加入 0.4μl 50 ROX Reference Dye) B:Real Time PCR 反应 根据 A 步骤配制好 PCR 体系, 混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 ( 两步法反应条件见下表 2-1, 三步法反应条件见下表 2-2) 表 2-1: 两步法 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 94-95 3min 1 预变性 2( 两步 ) 94-95 5-10sec 循环中模板变性 40 60-65 20-30sec 退火 / 延伸 表 2-2: 三步法 步骤温度时间循环数内容 1 94-95 3min 1 预变性 94-95 5-10sec 循环中模板变性 2( 三步 ) 55-65 10sec 40 退火 72 20sec 延伸注意 : 为了得到最佳的 PCR 效果, 针对不同的模板 不同的引物可采用梯度 PCR 优化反应条件 PCR 反应条件视定量 PCR 仪 模板 引物等的不同而各异 在具体操作中需要根据定量 PCR 仪 模板类型 目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 反应时间等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 11/19
Real Time PCR Easy TM -Taqman 操作步骤 A:Real Time PCR 体系配制 1. 取出 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 20 ROX Reference Dye 引物 Probe 等置于冰盒中, 使其自然融化 融化后, 上下颠倒混匀试剂, 可用离心机瞬时离心收集散落在管壁和盖子上的液体 注意 :2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 放在室温或握在手中时间较长会变浑浊, 可将其置于冰上 2-5min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 2. 将适量的 DNA 模板 引物 Probe 或 20 ROX Reference Dye 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 中, 并用 DNase-Free ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 3) 注意 : 该操作应在冰浴上进行, 长时间的室温放置会降低产品性能 表 3:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容用量终浓度 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 10μl 1 Forward Primer(10μM) 0.8μl 50-900nM 1* Reverse Primer(10μM) 0.8μl 50-900nM 1* Probe(4μM) 1μl 200nM Template(DNA) Xμl 2* 20 ROX Reference Dye - 3* DNase-Free ddh 2 O Total Volume (7.4-X)μl 20μl 1*: 通常引物终浓度为 400nM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 50-900nM 范围内调整引物浓度 2*:DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下 因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同, 必要时可进行梯度稀释, 确定最佳的 DNA 模板添加量 注意 : qpcr 体系可以根据实验需要和 PCR 型号进行调节 大多数特异引物的终浓度, 我们推荐 400nM,Probe 的终浓度我们推荐 200nM 特异引物和 Probe 的用量请根据配制的浓度按照我们推荐的终浓度自行调整用量 50μl 体系的 qpcr, 请参照 20μl 体系按比例调整试剂用量 3*: 根据定量 PCR 仪器不同选择合适终浓度的 ROX Reference Dye 常见定量 PCR 仪的最适 ROX Reference Dye 浓度见下表 : Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 12/19
荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM7000/7300/7700/ 7900HT/Step One 等 ROX Reference Dye 终浓度 1 ( 如 20μl 体系, 加入 1μl 20 ROX Reference Dye) ABI 7500/7500 Fast 和 Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 等 0.5 ( 如 20μl 体系, 加入 0.5μl 20 ROX Reference Dye) B:Real Time PCR 反应 根据 A 步骤配制好 PCR 体系, 混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 ( 反应条件见下表 4) 表 4:Taqman 法 Real Time PCR 反应条件 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 94 3min 1 预变性 2( 两步 ) 94 5-10sec 循环中模板变性 40 60-65 20-30sec 退火 / 延伸 注意 : 为了得到最佳的 PCR 效果, 针对不同的模板 不同的引物可采用梯度 PCR 优化反应条件 PCR 反应条件视定量 PCR 仪 模板 引物等的不同而各异 在具体操作中需要根据定量 PCR 仪 模板类型 目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 反应时间等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 13/19
Real Time PCR 引物设计原则 Forward Primer 和 Reverse Primer 进行 Real Time PCR, 引物设计非常重要 引物关系到 PCR 扩增的特异性 高效性等, 可以参照以下原则进行引物设计 : 引物长度 :18-30bp GC 含量 :40-60% Tm 值 : 引物设计软件, 如 Primer 5, 可以给出引物的 Tm 值 上下游引物的 Tm 值应尽量接近 也可以使用 Tm 计算公式 :Tm=4 (G+C)+2 (A+T) 进行 PCR 时, 一般选择低于引物 Tm 值 5 的温度作为退火温度 ( 相应的提高退火温度可以增加 PCR 反应的特异性 ) 引物及 PCR 产物 : 设计引物 PCR 扩增产物长度最好在 100-150bp 应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物 避免上下游引物 3 端之间形成 2 个或 2 个以上的互补碱基 引物 3 端碱基不能存在多余 3 个连续的 G 或 C 引物自身不能存在互补结构, 否则会形成发夹结构, 影响 PCR 扩增 引物序列中 ATCG 应尽量分布均匀,3 端碱基避免为 T Probe 探针选择要保守, 引物选择要保守, 因此必须找一段 100-200bp 相对要保守的片段来设计引物与探针 即 real-time PCR 的扩增片段是 50bp-150bp 当找不到 150bp 的保守片段时, 必须确保探针的片段是保守的 一般按照以下原则进行 Probe 的设计 : 探针位置尽可能地靠近上游引物 探针长度应在 15-45bp( 最好是 20-30bp), 以保证结合特异性 检测探针的 DNA 折叠和二级结构 Tm 值在 65-70, 通常比引物 TM 值高 5-10 ( 至少要 5 ),GC 含量在 40%-70% 探针的 5 端应避免使用 G 鸟嘌呤 因为 5 G 会有淬灭作用, 而且即使是被切割下来 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 14/19
还会存在淬灭作用 整条探针中, 碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量 G 含量高会降低反应效率, 这时就应选择配对的另一条链作为探针 为确保引物探针的特异性, 最好将设计好的序列在 blast 中核实一次, 如果发现有非特异性互补区, 建议重新设计引物探针 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 15/19
操作示意图 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 16/19
问题分析指南 以下针对 Real PCR Easy TM 系列试剂盒在实验中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助 另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您 如有任何需要可联系我们 :028-83361257 或 E-mali: Tech@foregene.com 无扩增信号 1. 试剂盒保存不当导致 SYBR 失效或者试剂盒过期导致 SYBR 荧光信号丢失 建议 : 试剂盒打开后, 其中的试剂要避光 -20 保存, 且不能经常冻融 ; 购买新的 Real Time PCR Kit 试剂盒进行相关实验 1. 试剂盒中的 Taq DNA Polymerase 因试剂盒保存不当或过期而失去活性 建议 : 确认试剂盒的保存条件 ; 重新在 PCR 体系中添加适量 Taq DNA Polymerase 或者购买新的 Real Time PCR Kit 试剂盒进行相关实验 2. DNA 模板中存在大量的 Taq DNA Polymerase 的抑制因子 建议 : 重新纯化模板或降低模板的使用量 3. Mg 2+ 浓度不适合 建议 : 我们提供的 2 Real PCR Mix 的 Mg 2+ 浓度为 3.5 mm 但针对有些特殊的引物 和模板可能需要的 Mg 2+ 浓度较高, 因此可直接添加 MgCl 2 进行 Mg 2+ 浓度的优化, 建 议每次增加 0.5mM 的 Mg 2+ 进行优化 4. PCR 扩增条件不适合 引物序列或者浓度不当 建议 : 确认引物序列的正确性以及引物没有降解 ; 扩增信号不好时, 可尝试降低退 火温度, 适当调整引物浓度等 5. 模板用量问题, 太少或过多 建议 : 可进行模板线性化梯度稀释, 选择 PCR 效果最好的模板浓度进行 Real Time PCR 实验 NTC 出现过高的荧光值 1. 在操作过程中导致的试剂污染 建议 : 更换新的试剂进行 Real Time PCR 实验 2. PCR 反应体系配制时发生污染 建议 : 操作时进行必要的防护措施, 比如 : 戴乳胶手套, 使用带滤芯的枪头等 3. 引物出现降解, 引物降解会导致非特异性扩增出现 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 17/19
建议 : 可使用 SDS-PAGE 电泳检测引物是否降解, 更换新的引物进行 Real Time PCR 实验 出现引物二聚体或非特异性扩增 1. Mg 2+ 浓度不适合 建议 : 我们提供的 2 Real PCR Easy TM Mix 的 Mg 2+ 浓度为 3.5 mm 但针对有些特 殊的引物和模板可能需要的 Mg 2+ 浓度较高, 因此可直接添加 MgCl 2 进行 Mg 2+ 浓度的 优化, 建议每次增加 0.5mM 的 Mg 2+ 进行优化 2. PCR 退火温度过低 建议 : 每次增加 1 或者 2 进行 PCR 退火温度的优化 3. PCR 产物太长 建议 :Real Time PCR 产物长度最好在 100-150bp 之间, 不要超过 500bp 4. 引物出现降解, 引物降解会导致很会飞特异性扩增出现 建议 : 可使用 SDS-PAGE 电泳检测引物是否降解, 更换新的引物进行 Real Time PCR 实验 5. PCR 体系不当, 或体系太小 建议 :PCR 反应体系太小会导致检测精度降低 最好使用定量 PCR 仪推荐的反应 体系重新进行 Real Time PCR 实验 定量值重复性差 1. 仪器故障 建议 : 仪器的每一个 PCR 孔之间可能存在误差, 在温度管理或检测时产生重现性较 差现象 请根据相应仪器的说明书进行点检 2. 样品纯度不好 建议 : 样品不纯会导致实验的重复性较差, 这包括模板 引物的纯度 最好进行模 板的再纯化, 引物最好使用 SDS-PAGE 纯化 3. PCR 体系配制放置时间过长 建议 :Real Time PCR 体系配制好后立即用于 PCR 实验, 不要搁置太长时间 4. PCR 扩增条件不适合 引物序列或者浓度不当 建议 : 确认引物序列的正确性以及引物没有降解 ; 扩增信号不好时, 可尝试降低退 火温度, 适当调整引物浓度等 5. PCR 体系不当, 或体系太小 建议 :PCR 反应体系太小会导致检测精度降低 最好使用定量 PCR 仪推荐的反应 体系重新进行 Real Time PCR 实验 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 18/19
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