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第 13 卷第 2 期 2015 年 3 月 生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol 13 No 2 Mar 2015 doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2015 02 007 深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究 李丽珍 1,2, 杨键 1, 田新朋 1, 麦志茂 1,2, 苏宏飞 1,2, 龙丽娟 1,2 1,2, 张偲 (1 中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省海洋药物重点实验室, 广东广州 510301;2 中国科学院大学, 北京 100049) 摘 要 : 从深海放线菌 Streptomyces sp SCSIO 03032 基因组中扩增到 1 条含淀粉结合域的水解糖苷 13 家族基因 amy032, 该基因编码氨基酸与已知蛋白一致性最高为 67% 将 amy032 插入表达载体 pet32a 启动子下游, 构建重 组载体 pet amy 重组质粒导入大肠杆菌 Rosseta (DE3) 菌株中,SDS PAGE 分析结果显示目的基因成功实现异 源表达 Ni NTA 对重组酶进行纯化, 并对其酶学性质进行表征 结果表明 : 重组淀粉酶 AMY032 的最适作用温 度为 50, 最适 ph 为 8 0, 以可溶性淀粉为底物时的比酶活为 ( 276 ± 57) U / mg, K m 为 0 02 g / L, V max 为 70 mg / (L min) Ca 2 + 能提高该酶的催化活性,Ni 2+ Cu 2 + Zn 2 + 和 Mn 2 + 对该酶有抑制作用 AMY032 对生玉米淀粉和 生大米淀粉具有水解活性, 其比酶活分别为 (49±12) U / mg 和 (39±11) U / mg; 扫描电镜结果显示 AMY032 使生玉 米淀粉的表面产生明显凹陷 关键词 : 深海放线菌 ; 基因组挖掘 ; 有机物降解 ; 淀粉结合域 ; 克隆表达 中图分类号 :Q93;TQ925 1 文献标志码 :A 文章编号 :1672-3678(2015)02-0035-06 Cloning,expression and characterization of raw amylase gene fromdeep sea actinomycete LI Lizhen 1,2,YANG Jian 1,TIAN Xinpeng 1,MAI Zhimao 1,2, SUN Hongfei 1,2,LONG Lijuan 1,2,ZHANG Si 1,2 (1 Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica,CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio resources and Ecology,South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China; 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China) Abstract: The glycoside hydrolase family 13 gene amy032, deduced amino acid sequence of which exhibited highest identity of 67% with known protein in GenBank,was amplified from a deep sea strain Streptomyces sp. SCSIO 03032. The mature gene was inserted into pet32a under T7 promoter. Recombinant vector was transformed in Escherichia coli Rosetta ( DE3) cells, and SDS PAGE analysis results showed that the amylase gene was successfully expressed. Enzyme AMY032 was then purified by nickel affinity chromatography and characterized. The optimum temperature of the purified enzyme was 50 收稿日期 :2014-04-02 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划 )(2012AA092104); 国家自然科学基金重点项目 (41230962); 国家海洋公益专项 (201305018); 广东海洋经济创新发展区域示范项目 (GD2012 D01 002); 中国科学院重点部署项目 (KSCX2 EW B 13) 作者简介 : 李丽珍 (1989 ), 女, 广东汕头人, 硕士研究生, 研究方向 : 海洋生物学 ; 张偲 ( 联系人 ), 研究员,E mail:zhsimd@ scsio.ac.cn

36 生物加工过程第 13 卷,and optimum ph 8 0. With soluble starch as substrate,specific activity was (276±57) U / mg,k m was 0 02 g / L and V max was 70 mg / ( L min). The catalytic activity of the enzyme was slightly improved by Ca 2+ and restrained by Ni 2+,Cu 2+,Zn 2+ and Mn 2+. AMY032 could hydrolyze raw corn starch and raw rice starch,with specific activity of (49 ± 12) U / mg and (39 ± 11) U / mg,respectively. Scanning electron microscope showed AMY032 generate obviously dents on raw corn starch surface. Keywords:deep sea actinomycete; genome mining; organic matter degradation; starch binding domain; cloning and expression 生淀粉是一种结构复杂而致密的有机大分子颗粒, 其外层有水化层包裹, 一般淀粉酶难以进入生淀粉内部对其进行水解, 所以生淀粉的糖化往往需要通过高温蒸煮来破坏生淀粉颗粒的水化层结构 [1] 生淀粉酶对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒表现出强水解活性 [2], 可将传统的淀粉糊化 液化 糖化工艺合并为一步直接糖化 [3] 若将生淀粉酶应用于无蒸煮的酒精发酵, 总耗能可节约 30% ~40% [4], 因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度关注 具有生淀粉降解活性的酶通常具有 3 个结构域 [5] : 催化域 ( catalytic domain, CD) 淀粉结合域 (starch binding domain,sbd) 和一段连接区域 淀粉结合域 (SBD) 对于生淀粉的酶解至关重要, 一方面它使酶吸附到淀粉颗粒上从而有利于酶的水解作用, 另一方面它本身就会破坏淀粉颗粒的结构从而促进酶解 [6] 有研究发现, 没有淀粉结合区域的葡萄糖淀粉酶对可溶性淀粉的水解速率不变, 而对生淀粉颗粒的水解能力非常低 [7] 目前为止, 绝大多数生淀粉酶的来源是陆地微生物 [8], 也有少量海洋细菌的 α 淀粉酶被报道具有生淀粉降解活性, 分别来自 Bacillus sp ALSHL3 [9] 和 Bacillus aquimaris MKSC 6 2 [10] 以海洋动植物的有机体为主的大分子有机物 ( 包括碳水化合物 蛋白质和脂类 ) 源源不断地向沉积物中沉降, 为沉积物中的异养微生物提供了充足的营养来源 出于摄食的需求, 这些微生物往往首先要分泌出一系列水解酶类将颗粒有机物水解为可吸收的小分子物质 因而海洋沉积环境来源的微生物具有生产高活性有机物水解酶的潜力 笔者从 1 株深海放线菌 Streptomyces sp SCSIO 03032 的全基因组序列中挖掘出 1 条具有 CBM20 家族淀粉结合域的新型 α 淀粉酶基因 amy032, 其编码的蛋白具有潜在水解生淀粉的能力, 将该基因进行异源表达, 并表征其酶学特性, 以期为其工业化应用奠定基础 1 材料与方法 1 1 材料海洋放线菌 Streptomyces sp SCSIO 03032( 分离于 3 412 m 深的印度洋沉积物 ) Escherichia coli Rosseta (DE3) Escherichia coli DH5α, 保藏于热带海洋生物资源与生态重点实验室 ; 表达载体 pet32a,novagen 公司 ;LA taq 酶 pmd18 T 载体 限制性内切酶,TaKaRa 公司 ; 胶回收试剂盒,OMEGA 公司 3,5 二硝基水杨酸 (DNS) 等化学试剂均为市售分析纯 1 2 Streptomyces sp SCSIO 03032 基因组 DNA 的提取有关 DNA 的提取方法参照文献 [11] 进行 1 3 α 淀粉酶基因 amy032 的克隆 Streptomyces sp SCSIO 03032 的淀粉酶基因序列已经通过基因组测序获得, 使用生物信息学软件 Vector NTI 进行引物设计, 获得上游引物 5 ATAT GGATCCCTCACCGTCGCCGCCCCCGCCGCCCAG G 3 和下游引物 5 ATATCTCGAGGGTGCGCCA GACGTCGCTCAGGCTG 3 使用所设计的上下游引物, 以 Streptomyces sp SCSIO 03032 基因组 DNA 为模板 PCR 扩增 α 淀粉酶基因 amy032, 用限制性 内切酶 BamH Ⅰ 和 Xho Ⅰ 酶切 α 淀粉酶基因 amy032 后, 与经 BamHⅠ 和 XhoⅠ 酶切的表达载体 pet32a 进行连接 将连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 中, 涂布到含 100 μg / ml 氨苄青霉素的 LB 培养基平板上筛选克隆 进一步提取质粒 DNA, 双酶切验证正确后命名重组质粒为 pet amy 1 4 重组菌株的培养和诱导将重组质粒 pet amy 转化至大肠杆菌 Rosseta (DE3) 中, 接种至 50 ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基中,37 振荡培养, 待 OD 600 为 0 6 时, 加入 IPTG 使其终浓度为 0 5 mmol / L,28 诱导 10 h 9 000 r / min 离心 10 min, 收集菌体, 用 10 ml 浓度为 100 mmol / L 的 Tris HCl 缓冲液重悬菌体, 超声破胞 10

第 2 期 李丽珍等 : 深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究 37 min 12 000 r / min 的转速离心 10 min, 上清即为 AMY032 的粗酶液 1 5 α 淀粉酶的分离纯化 粗酶液过镍柱, 用 ph 为 8 0 的 5 mmol / L 的咪 唑溶液平衡柱子, 加入酶液后再用 5 mmol / L 和 20 mmol / L 的咪唑溶液洗掉杂蛋白, 最后用 500 mmol / L 的咪唑溶液洗脱目的蛋白, 收集到的洗脱液 为纯化后的酶液, 用 12% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 1 6 PAGE) 进行检测 α 淀粉酶 AMY032 酶活的测定 取 50 μl 稀释一定倍数的纯化重组酶 AMY032, 加入到 450 μl 0 01 g / L 的淀粉溶液 ( Tris HCl ph8 0) 中,50 水浴 10 min 后, 加入 500 μldns 溶 液 沸水中反应 5 min, 室温冷却, 分光光度计测量在 545 nm 下的吸光值 吸光值与不同含量的葡萄糖吸 光度标准曲线图做比较计算酶活 一个酶活力单位 (U) 定义为在上述反应条件下, 每分钟转化等价于 1 μmol 葡萄糖的还原糖所需的酶量 1 7 1 7 1 酶学性质研究 温度对酶活性的影响 在反应温度分别为 20 30 40 50 60 和 70 的 条件下, 测定不同温度条件下的酶活 以酶活最高 为 100%, 其余为相对酶活, 确定酶的最适反应温 度 每组设置 3 个重复试验 1 7 2 ph 对酶活性的影响 用 ph 分别为 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 和 11 0 的缓冲液配制不同 ph 的 0 01 g / L 可溶性淀 粉溶液, 测定相应的酶活力 以酶活最高为 100%, 其余为相对酶活, 确定酶的最适反应 ph 每组设置 3 个重复试验 1 7 3 金属离子对酶活性的影响 以不加金属离子为对照, 分别在酶液中加入 5 mmol / L 的 Ca 2+ Na + Ni 2+ Ba 2+ Mg 2+ K + Mn 2+ Zn 2+ 和 Cu 2+ 处理, 再加入 1% 质量分数的可溶性淀粉 反应, 测定酶活 每组设置 3 个重复试验 1 7 4 降解生淀粉能力的比较 取 50 μl 稀释一定倍数的纯化重组酶 AMY032, 分别与 0 01 g / L 生玉米淀粉 生大米粉 生红薯粉和 生木薯粉混合后, 于 50 摇床 100 r / min 反应 20 min, 测定上清液中还原糖的量, 计算酶的比酶活, 并 与可溶性淀粉对比 每组设置 3 个重复试验 1 8 扫描电镜表征 0 01 g / L 的生淀粉添加 50 U 的 AMY032 降解 30 min 后, 离心, 沉淀后用无水乙醇洗涤 3 次, 自然风干 使用 Ion Sputter E 1010 型离子溅射仪 (Hitachi 公司 ) 在 5 0 kv 和 20 ma 的条件下对淀粉颗粒喷 40 s, 使颗粒表面镀 Pt 采用 Hitachi S 4800 型扫描电镜 (Hitachi 公司 ) 观察和拍照 2 结果与讨论 2 1 α 淀粉酶基因 amy032 的核苷酸序列分析以及编码产物 AMY032 的氨基酸序列分析用 NCBI(http: / / www ncbi nlm nih gov / ) 上的软件如 ORF Finder BLAST 对 α 淀粉酶 DNA 序列进行分析发现,α 淀粉酶基因 amy032 的开放阅读框由 1 737 个脱氧核苷酸组成 其中起始密码子为 GTG, 终止密码子为 TGA, 测序结果提交 GenBank, 基因登录号为 KJ577548 α 淀粉酶基因 amy032 编码 1 个含 579 个氨基酸的蛋白质 使用 BLAST 搜索 GenBank 数据库, 与 AMY032 催化功能域相似性最高的为灰黄链霉菌 (Streptomyces flavogriseus) 的假定水解糖苷酶蛋白, 其氨基酸一致性为 67% ( 图 1) 用组件结构研究工具 Pfam 分析来源于海洋放线菌 Streptomyces sp SCSIO 03032 的 α 淀粉酶 AMY032 的组件结构, 结果显示 : 自 N 端的 1 ~ 39 位氨基酸为信号肽, 自 N 端的 71 ~ 345 位氨基酸为家族 13 水解糖苷酶的催化功能域, 自 N 端第 397 ~ 467 位氨基酸为 α 淀粉酶的 C 端 β 折叠域, 自 N 端 483 ~ 569 位氨基酸为 CBM20 淀粉结合功能域 淀粉结合域在真菌生淀粉酶中非常常见, 大多数真菌生淀粉酶的淀粉结合域都位于羧基端, 但是米根霉的糖化酶的 SBD 是位于氨基端 真菌来源的糖化酶的 SBD 包括了大约 100 个氨基酸残基, 这个区域可能处于催化区域的后面, 也可能是处在一个糖基化连接区域的后面 2 2 α 淀粉酶基因 amy032 在大肠杆菌中的表达及重组酶的纯化笔者前期尝试使用 pet28a 和 pet22b 对基因 amy032 进行表达, 表达产物均以无活性的包涵体形式存在,pET32a 表达载体在多克隆位点的上游添加 315 bp 的 Trx 标签用于辅助蛋白折叠 重组质粒 pet amy 导入大肠杆菌后, 重组细胞裂解液表现出淀粉酶活性 SDS PAGE 电泳结果表明 α 淀粉酶基因 amy032 在 Escherichia coli Rosseta (DE3) 中得到表达, 在约 7 5 10 4 附近出现了明显条带, 与预测的蛋白大小相符 ( 包括 Trx 标签 1 0 10 4 在内 ) 粗酶液

３８ 生 图１ Ｆｉｇ １ 物 加 工 过 第 １３ 卷 程 ＡＭＹ０３２ 与同源的 α 淀粉酶的氨基酸序列比对 Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＡＭＹ０３２ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｍｙｌａｓｅ 经镍柱亲和层析纯化后得到单一的电泳条带 图 ２ 纯度达 ９５ 以上 可用于酶学性质分析 度大于 ５０ 时 酶活力下降较快 温度达到 ７０ 时 该酶仅存有 ２０ 酶活力 由此可知 该酶的最 适反应温度为 ５０ 图３ Ｆｉｇ ３ １ 标准蛋白 ２ 无 ＩＰＴＧ 诱导 ｐｅｔ ａｍｙ 在 Ｅ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ ＤＥ３ 表达粗提取酶液 ３ ＩＰＴＧ 诱导 ｐｅｔ ａｍｙ 在 Ｅ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ ＤＥ３ 表达粗提提取酶液 图２ Ｆｉｇ ２ ２ ３ ４ Ｎｉ ＮＴＡ 亲和层析提取的 ＡＭＹ０３２ 重组菌株表达 α 淀粉酶的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析结果 ＳＤＳ ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｙ０３２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ 酶学性质研究结果 考察温度对 ＡＭＹ０３２ 酶活力的影响 结果见图 ３ 由图 ３ 可知 温度为 ５０ 时 酶活力最大 当温 反应温度对 ＡＭＹ０３２ 酶活的影响 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＭＹ０３２ 考察 ｐｈ 对 ＡＭＹ０３２ 酶活力影响 结果见图 ４ 由图 ４ 可知 当 ｐｈ 为 ８ ０ 时 酶活力最高 当 ｐｈ 大 于 １０ ０ 时 酶活力仅有 １７ 由此可发现 该酶反 应的最适 ｐｈ 为 ８ ０ 考察金 属 离 子 对 ＡＭＹ０３２ 酶 活 力 的 影 响 结 果见表 １ 由表 １ 可知 Ｃａ ２ 对生淀粉酶有促进作 用 Ｎｉ ２ Ｃｕ ２ Ｚｎ ２ 和 Ｍｎ ２ 对 该 酶 有 抑 制 作 用 用 金属离 子 Ｎｉ ２ 处 理 酶 液 后 相 对 酶 活 只 剩 １８ Ｃｕ ２ 处理酶液后 相对酶活为 ３４ Ｚｎ ２ 处 理 酶 液

第 2 期 李丽珍等 : 深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究 39 Fig 4 图 4 ph 对 AMY032 酶活的影响 Effects of ph on the activity of AMY032 图 5 Fig 5 淀粉酶 AMY032 K m 值的测定 Linewear Burk plots of AMY032 后, 相对酶活仅剩 14%; Mn 2+ 处理酶液后, 酶活 为 24% 表 1 金属离子对 AMY032 酶活的影响 Table 1 Effects of metal ions on enzyme activity of AMY032 金属离子 相对酶活 / % 金属离子 相对酶活 / % 空白对照 100 Na + 99 Ca 2+ 102 Cu 2+ 34 K + 98 Zn 2+ 14 Ni 2+ 18 Mn 2+ 24 Mg 2+ 85 Ba 2+ 90 以可溶性淀粉为底物, 在 ph8 0 温度 50 的 条件下取不同质量浓度 (ρ S ) 的可溶性淀粉, 测得反 应速率 ( V), 得到 1 / V 与 1 / ρ S 的关系, 结果见图 5 由图 5 双倒数线结果计算重组淀粉酶 AMY032 对可 溶性淀粉的 K m 值为 0 02 g / L, 最大反应速率 (V max ) 为 70 18 mg / (L min) 2 4 AMY032 对生淀粉的水解 以不同的生淀粉为底物, 测定 AMY032 对不同 生淀粉的降解能力, 结果见表 2 由表 2 可知 : 生玉 米淀粉和生大米粉对酶解作用敏感, 其比酶活分别 是 (49±12) 和 (39±11) U / mg, 但与陆地来源的生淀 粉酶比较,AMY032 对生淀粉的水解率还需要提高而与海洋来源的生淀粉酶 AmyP [17] ( 39 6 ± 1 4) U / mg 相比,AMY032 具有良好的水解生淀粉能力 而生红薯粉和生木薯粉对酶解作用不敏感 表 2 AMY032 对不同生淀粉的降解活性 Table 2 Degrading activities of AMY032 to various raw starch 底物比酶活 / (U mg -1 ) 可溶性淀粉 276±57 生玉米淀粉 49±12 生大米粉 39±11 生红薯粉 生木薯粉 使用扫描电镜观察了 AMY032 降解生淀粉前后淀粉颗粒的变化情况, 以未加入生淀粉酶为对照组, 结果见图 6 由图 6 可知 : 在 50 反应 20 min 后淀粉颗粒表面致密光滑 ( 图 6( a)), 而反应组中经过重组淀粉酶 AMY032 处理后的生玉米淀粉颗粒表面出现许多细密的孔洞 ( 图 6 ( b )), 说明 AMY032 能有效破坏生玉米淀粉颗粒表面结构并释放还原糖 目前, 很多来自陆地的具有生淀粉降解 Fig 6 图 6 AMY032 水解生淀粉的 SEM 照片 SEM images of untreated and treated raw corn starch granules with AMY032 by scanning electron microscopy

40 生物加工过程第 13 卷 能力的 α [13] 淀粉酶被广泛的研究, 庞宗文等报道 从土壤中分离到 4 株具有生淀粉分解酶活性的根 霉, 其中 Rhiizous sp 2 和 Rhiizous sp 3 的生淀粉分 解酶活性最高, 分别为每克干曲 520 U 和 405 U 郭 [14] 爱莲等报道从自然界分离到 1 株高酶活的生淀 粉糖化酶菌株黑曲霉 Sx, 在最适产酶条件下酶活达 [15] 到 382 U / g 丁立孝等报道从 23 份土样中筛选 出 105 株野生型霉菌, 其中有 10 株具有较高的糖化 生淀粉的能力 AMY032 对不同生淀粉的降解能力 存在差异, 主要是因为不同植物来源的天然生淀粉 对生淀粉酶的敏感性差异很大, 淀粉颗粒的大小 表面特性和内部结构都成为影响因素 [16] 一般来 说, 谷物来源的淀粉较其他来源的淀粉容易被 降解 [17] 3 结论 克隆到来源于印度洋 Streptomyces sp SCSIO 03032 的 α 淀粉酶基因, 并检测到纯化的 α 淀粉 酶具有生淀粉的降解能力, 测定最适温度为 50, 最适 ph 为 8 0 AMY032 对生玉米淀粉具有水解 活性, 其比酶活为 (49±12) U / mg,amy032 的成熟 肽中有非常重要的两部分, 一是自 N 端的第 71 ~ 345 位氨基酸为家族 13 水解糖苷酶的催化功能域, 二是自 N 端第 483 ~ 569 位氨基酸为 CBM20 淀粉结 合功能域 基于氨基酸相似性,CBM 分成了 42 个家族, 在 CAZy 的分类中,CBM 中有六类是 SBD 家族, 分别是 CBM20 CBM21 CBM25 CBM26 CBM34 和 CBM41 笔者研究的生淀粉酶 AMY032 的羧基端含有约 100 个氨基酸的 CBM20 类淀粉结合域, 这段淀粉结合域 很可能对 AMY032 水解生淀粉的能力有重要贡献, 因而有必要对羧基端的氨基酸功能进行深入研究 参考文献 : [ 1 ] Robertson G H,Wong D W,Lee C C,et al.native or raw starch digestion:a key step in energy efficient biorefining of grain[ J].J Agric Food Chem,2006,54(2):353 65. [ 2 ] Kaneko T,Ohno T,Ohisa N.Purification and characterization of a thermostable raw starth digesting amylase from a Streptomyces sp. isolated in a milling factory[ J].Biosci Biotechnol Biochem,2005, 69(6):1073 1081. [ 3 ] Matsubara T,Ben A Y,Anindyawati T,et al. Degradation of raw starch granules by alpha amylase purified from culture of Aspergillus awamori KT 11 [ J]. J Biochem Mol Biol, 2004, 37 (4):422 8. [ 4 ] 谢慧玲, 阮森林, 刘亮伟, 等. 酸性生淀粉酶产生菌的筛选及 酶学性质研究 [J]. 食品工业科技,2008,29(10):85 87. [ 5 ] Sauer J, Sigurskjold B W, Christensen U, et al. Glucoamylase: structure / function relationships, and protein engineering[ J]. Biochim Biophys Acta,2000,1543(2):275 293. [ 6 ] Penninga D,van der Veen B A,Knegtel R M,et al.the raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 [ J ]. J Biol Chem, 1996, 271 ( 51 ): 32777 32784. [ 7 ] Southalla S M,Simpson P J,Gilbert H J,et al.the starch binding domain from glucoamylase disrupts the structure of starch [ J]. FEBS Lett,1996,447(1):58 60. [ 8 ] Sun H, Zhao P, Ge X, et al. Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes [ J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(4):988 1003. [ 9 ] Vidilaseris K, Hidayat K, Retnoningrum D S, et al. Biochemical characterization of a raw starch degrading α amylase from the Indonesian marine bacterium Bacillus sp. ALSHL3[ J]. Biologia, 2009,64(6):1047 1052. [10] Puspasari F,Nurachman Z,Noer A S,et al.characteristics of raw starch degrading α amylase from Bacillus aquimaris MKSC 6. 2 associated with soft coral Sinularia sp. [ J]. Starch Stärke,2011, 63(8):461 467. [11] 萨姆布鲁克 J, 鲁塞尔 D W. 分子克隆实验指南 [ M]. 黄培堂, 译. 北京 : 科学出版社,2002. [12] 彭惠, 雷寅, 刘源涛, 等. 海洋环境来源的淀粉酶 AmyP 对生玉 米淀粉的降解特性 [ J]. 中国生物工程杂志,2012,32 ( 7): 79 83. [13] 庞宗文, 梁静娟, 陈桂光. 生淀粉分解酶产生菌的分离筛选 [J]. 中国酿造,1997(3):10 11. [14] 郭爱莲, 郭延巍, 杨琳, 等. 生淀粉糖化酶的菌种筛选及酶学 研究 [J]. 食品科学,2001,22(10):45 48. [15] 丁立孝, 顾军, 倪新江, 等. 无蒸煮生淀粉糖化酶霉菌的选育 [J]. 食品科学,2002,23(2):78 80. [16] Wang W J,Powell A D,Oates C G. Pattern of enzyme hydrolysis in raw sago starch: effects of processing history [ J]. Carbohydr Polym,1995,26(2):91 97. [17] Li J H,Vasanthan T,Hoover R,et al.starch from hull less barley: V. in vitro susceptibility of waxy, normal, and high amylose starches towards hydrolysis by alpha amylases and amyloglucosidase[ J].Food Chem,2004,84(4):621 632. ( 责任编辑荀志金 )